lncRNA TUG1靶向miR-326對(duì)哮喘患兒氣道平滑肌細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響

李青華 宋靖榮 董焱 呂白于 呂偉

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院兒科，上海 201900)

哮喘是小兒常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。哮喘病情易反復(fù)發(fā)作，難以治愈，給患者后期生活、學(xué)習(xí)帶來(lái)極大影響[1-2]。哮喘主要病理特征是持續(xù)的氣道炎癥，氣道高反應(yīng)性和氣道重塑等，氣道平滑肌細(xì)胞參與氣道炎癥反應(yīng)，且平滑肌細(xì)胞的增殖是哮喘氣道重塑的特征性改變，其在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[3-5]。故促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞的凋亡及減輕其引起的炎癥反應(yīng)對(duì)哮喘的治療具有重要意義。研究表明，lncRNA可以調(diào)控哮喘氣道炎癥和氣道重塑，有希望成為診斷和治療哮喘的新型靶點(diǎn)[6]。長(zhǎng)非編碼RNA?；撬嵘险{(diào)基因1(lncRNA TUG1)在哮喘大鼠模型中表達(dá)水平升高；lncRNA TUG1促進(jìn)了氣道平滑肌細(xì)胞(ASMC)的增殖和遷移，并減少了細(xì)胞凋亡[7]。抑制lncRNA TUG1可通過(guò)miR-34c/BRD4軸減輕香煙煙霧提取物在慢性阻塞性肺疾病中引起的炎癥損傷[8]。lncRNA TUG1高表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)miR-21 / PTEN軸促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和動(dòng)脈粥樣硬化[9]。干擾lncRNA TUG1可緩解脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[10-11]。然而lncRNA TUG1對(duì)ASMC中炎癥因子的影響及其機(jī)制尚不清楚。miR-326可抑制TGF-β1處理的ASMC的基質(zhì)蛋白沉積和細(xì)胞增殖[12]。抑制circHIPK3可通過(guò)miR-326 / STIM1軸抑制ASMC的增殖，遷移并上調(diào)細(xì)胞凋亡[13]。miR-326在體內(nèi)可減輕CCl4誘導(dǎo)的小鼠的肝纖維化和炎癥[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)顯示，lncRNA TUG1與miR-326有互補(bǔ)的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討lncRNA TUG1是否通過(guò)調(diào)控miR-326影響ASMC的凋亡和炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2017年1月～2020年6月我院收治的支氣管哮喘患兒和非哮喘患兒各9例，年齡5～15歲，平均8歲；從接受了肺切除術(shù)的患兒中獲得氣管段，分離出氣道平滑肌束；以非哮喘患兒組織為對(duì)照組，所有患兒及家屬均知情同意。

1.2 細(xì)胞與主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：120026，北京凱瑞基生物科技有限公司)；Trizol試劑(貨號(hào)：5301100，杭州新景生物試劑開(kāi)發(fā)有限公司)；熒光定量試劑盒(貨號(hào)：QPG-052，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：QN1317-CAT，北京百奧萊博科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(貨號(hào)：QCB-3201-1，上海欽誠(chéng)生物科技有限公司)；IL-4、IL-5、IL-13酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(貨號(hào)：E-EL-H0101c、E-EL-H0191c、E-EL-H0104c，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：GM-040502A，上海澤葉生物科技有限公司)。

1.3 氣道平滑肌細(xì)胞(ASMCs)分離培養(yǎng) 無(wú)菌條件下將支氣管哮喘患兒的氣道平滑肌束，剪成1 mm3的組織塊，均勻鋪在培養(yǎng)瓶的底部，加入含血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)4～5 d后可見(jiàn)從組織塊邊緣爬出少量細(xì)胞，隨后開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%左右時(shí)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，成峰谷生長(zhǎng)狀；然后用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，取穩(wěn)定傳代4～6代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ASMCs，將TUG1干擾載體及其陰性對(duì)照質(zhì)粒、miR-326模擬物及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至ASMCs中，記為si-NC組、si-TUG1組、miR-mimics-NC組、miR-326-mimics組；將TUG1干擾載體陰性對(duì)照質(zhì)粒與miR-326抑制劑陰性對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，TUG1干擾載體分別與miR-326抑制劑及其陰性對(duì)照分別共轉(zhuǎn)染至ASMCs中，分別記為si-NC+miR-inhibitor-NC組、si-TUG1+miR-inhibitor-NC組及si-TUG1+miR-326 inhibitor組。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)TUG1和miR-326表達(dá)水平 提取氣道平滑肌組織及細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后按照熒光定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR，其中TUG1和miR-326分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，PCR反應(yīng)體系：2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μL SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μL，7 μL無(wú)菌水；循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；融解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。最后相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，用預(yù)冷的PBS漂洗，用結(jié)合緩沖液重懸，加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻避光孵育10 min；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，將蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(1∶800)4℃孵育過(guò)夜；加入二抗(1∶1000)室溫孵育2 h；顯影、定影、成像，用Quantity One凝膠分析軟件檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-4、IL-5、IL-13水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后取上清，具體按照試劑盒操作進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建TUG1野生型和突變型熒光素酶報(bào)告載體WT-TUG1和MUT-TUG1，將其分別與miR-NC和miR-326共轉(zhuǎn)染至ASMCs中；按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 TUG1和miR-326在氣道平滑肌組織的表達(dá)水平 與非哮喘患兒比較，哮喘患兒的氣道平滑肌組織中TUG1表達(dá)水平升高，miR-326表達(dá)水平降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 TUG1和miR-326在氣道平滑肌組織的表達(dá)水平

2.2 利用RNA干擾技術(shù)沉默TUG1后對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的凋亡及炎癥因子的影響 與si-NC組比較，si-TUG1組TUG1表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高，IL-4、IL-5、IL-13水平降低(均P<0.05)，見(jiàn)表2，圖1。

表2 沉默TUG1對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的凋亡及炎癥因子的影響

圖1 沉默TUG1對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的凋亡及炎癥因子的影響

2.3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) TUG1的核酸序列中存在與miR-326互補(bǔ)的序列，見(jiàn)圖2。WT-TUG1與miR-326共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性降低，MUT-TUG1與miR-326共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著變化，

圖2 TUG1的核酸序列中存在與miR-326互補(bǔ)的序列

見(jiàn)表3。與si-NC組比較，si-TUG1組TUG1表達(dá)水平降低，miR-326表達(dá)水平升高(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表3 TUG1和miR-326的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

表4 TUG1靶向負(fù)相關(guān)

2.4 過(guò)表達(dá)miR-326對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的凋亡及炎癥因子的影響 與miR-mimics-NC組比較，miR-326-mimics組miR-326表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高，IL-4、IL-5、IL-13水平降低(P<0.05)，見(jiàn)表5，圖3。

表5 過(guò)表達(dá)miR-326對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的凋亡及炎癥因子的影響

圖3 過(guò)表達(dá)miR-326對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的凋亡及炎癥因子的影響

2.5 干擾miR-326能逆轉(zhuǎn)沉默TUG1對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的凋亡及炎癥因子的影響 與si-NC+miR-inhibitor-NC組比較，si-TUG1+miR-inhibitor-NC組miR-326表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高，IL-4、IL-5、IL-13水平降低(均P<0.05)；與si-TUG1+miR-inhibitor-NC組比較，si-TUG1+miR-326 inhibitor組miR-326表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，Bax表達(dá)水平降低，IL-4、IL-5、IL-13水平升高(均P<0.05)，見(jiàn)表6，圖4。

圖4 干擾miR-326能逆轉(zhuǎn)沉默TUG1對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的凋亡及炎癥因子的影響

表6 干擾miR-326能逆轉(zhuǎn)沉默TUG1對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的凋亡及炎癥因子的影響

3 討論

支氣管哮喘是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的疾病之一，研究發(fā)現(xiàn)一些lncRNA與炎癥反應(yīng)以及氣道平滑肌細(xì)胞有著密切的聯(lián)系，推斷l(xiāng)ncRNA可能參與調(diào)控哮喘的發(fā)生、發(fā)展[15-16]。已有研究報(bào)道lncRNA TUG1影響ASMC的增殖、遷移和凋亡[7]，且lncRNA TUG1還可促進(jìn)高血壓狀態(tài)下血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[17]。沉默lncRNA TUG1抑制了ox-LDL處理的血管平滑肌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。此外，lncRNA TUG1還參與炎癥反應(yīng)過(guò)程，如抑制lncRNA TUG1可抑制TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)的大鼠脊髓缺血再灌注的炎癥損傷[19]。lncRNA TUG1的下調(diào)通過(guò)使miR-449b-5p海綿化，從而減輕了缺血再灌注誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的炎癥[20]。TUG1通過(guò)靶向結(jié)合miR-29b-1-5p調(diào)節(jié)MTDH/NF-κB/IL-1β通路減輕脊髓缺血再灌注損傷炎癥損傷[21]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了哮喘患兒氣道平滑肌組織中TUG1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示TUG1高表達(dá)，與以往研究結(jié)果相符[7]。進(jìn)一步沉默lncRNA TUG1的表達(dá)，結(jié)果顯示，ASMCs中細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高，IL-4、IL-5、IL-13水平降低。IL-4、IL-5、IL-13均是炎癥反應(yīng)啟動(dòng)和傳遞的必要的因子，通過(guò)增加氣道炎癥可加重哮喘[22]。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沉默lncRNA TUG1不僅可以促進(jìn)ASMC凋亡，還可抑制炎癥反應(yīng)。

已有研究報(bào)道，miR-326影響ASMC的增殖[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，哮喘患兒氣道平滑肌組織中miR-326表達(dá)水平降低；而過(guò)表達(dá)miR-326后，ASMCs中細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-326可促進(jìn)ASMCs凋亡。此外，miR-326還參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)有關(guān)；如miR-326通過(guò)分別靶向TNFSF14和PTBP1來(lái)減輕二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化，從而抑制炎癥并促進(jìn)自噬活性[23]。miR-326通過(guò)下調(diào)TLR4抑制巨噬細(xì)胞中脂多糖誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-326后ASMC中IL-4、IL-5、IL-13水平降低；表明過(guò)表達(dá)miR-326抑制了ASMC的炎癥反應(yīng)。

為研究lncRNA TUG1與miR-326的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1的核酸序列中存在與miR-326互補(bǔ)的序列，說(shuō)明TUG1可結(jié)合miR-326；本研究進(jìn)一步構(gòu)建了含miR-326結(jié)合位點(diǎn)的TUG1野生型和突變型熒光素酶報(bào)告載體，將其分別與miR-NC和miR-326共轉(zhuǎn)染至ASMCs中檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性，結(jié)果顯示W(wǎng)T-TUG1與miR-326共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性降低，MUT-TUG1與miR-326共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著變化；且抑制TUG1表達(dá)后miR-326表達(dá)水平升高；表明TUG1可靶向負(fù)調(diào)控miR-326的表達(dá)。為研究miR-326對(duì)TUG1的影響，本實(shí)驗(yàn)在干擾miR-326的同時(shí)沉默TUG1，結(jié)果顯示，ASMC的凋亡率降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，Bax表達(dá)水平降低，IL-4、IL-5、IL-13水平升高；表明而干擾miR-326逆轉(zhuǎn)了沉默TUG1對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞凋亡及炎癥因子的影響。這表明TUG1可與miR-326相互作用影響氣道平滑肌細(xì)胞凋亡及炎癥。

4 結(jié)論與啟示

沉默lncRNA TUG1可通過(guò)靶向調(diào)控miR-326促進(jìn)哮喘患兒氣道平滑肌細(xì)胞凋亡，抑制炎癥因子的釋放。本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳皟H在體外進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，還有待于進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。