包君麗,高欣元,韓宇博,林海燕,彭坤明,鄭義

宮頸癌是僅次于乳腺癌的一種常見的婦科腫瘤疾病[1]。研究顯示造成宮頸癌病變的主因是高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染[2-3]。目前宮頸癌的主要治療方案是手術(shù)和放化療治療，但療效有限，易復(fù)發(fā)。新型免疫治療，如抗體靶向治療和過繼細(xì)胞治療的療效也不理想[4-5]。

古代中醫(yī)醫(yī)籍雖沒有與宮頸癌同名病例，但依據(jù)其臨床癥狀可將其歸屬于“崩漏”、“五色帶下”、“癥瘕”等范疇，該范疇之內(nèi)中醫(yī)具有豐富的治療案例[6]。近些年來中醫(yī)藥在宮頸癌的治療過程中取得了不錯的進(jìn)展[7]。大量的臨床研究表明復(fù)方苦參注射液治療宮頸癌療效尤為顯著[8-9]。中藥研究發(fā)現(xiàn)苦參、白土苓具有涼血解毒、抗癌、提高免疫力等功效，苦參和土茯苓的中藥制劑已被中國中醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)用于臨床輔助治療各種癌癥[10-12]。目前復(fù)方苦參注射液治療宮頸癌的研究主要以臨床為主，對其藥理研究相對較少，其作用于宮頸癌機(jī)制的相關(guān)動物實(shí)驗和細(xì)胞實(shí)驗更少。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法研究復(fù)方苦參注射液治療宮頸癌中化合物、作用靶標(biāo)和作用機(jī)制。

1 資料及方法

1.1 復(fù)方苦參注射液化合物與相應(yīng)靶標(biāo)的收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫平臺(TCMSP）[13]、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID)[14]和中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(TCMIP）[15]，以復(fù)方苦參注射液全方藥物“苦參”、“土茯苓”為關(guān)鍵詞在“Herb name”條目中檢索其化合物，根據(jù)藥物化合物ADME的分子動力參數(shù)，將藥物篩選閾值設(shè)定為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%，藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18，獲得復(fù)方苦參注射液的有效化合物分子，同時在平臺獲得其對應(yīng)的候選靶標(biāo)。

1.2 宮頸癌GEO芯片熱圖與火山圖繪制從GEO數(shù)據(jù)庫[16]獲取GSE63514芯片與相關(guān)數(shù)據(jù)，使用R軟件，設(shè)定P＜0.005 and|log2(fold change)|＞1，制作火山圖與熱圖，收集疾病的差異基因。

1.3 靶蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將復(fù)方苦參注射液與宮頸癌的差異基因取交集后,檢索String數(shù)據(jù)庫[17]，獲得蛋白互作關(guān)系，以“TSV”格式導(dǎo)出結(jié)果。通過Cytoscape3.7.2軟件對蛋白互作關(guān)系進(jìn)行可視化處理，NetworkAnalysis實(shí)施網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯謩e以每個節(jié)點(diǎn)為中心計算相應(yīng)的Degree值(連接度)，圖示化相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction,PPI)，并以PNG格式導(dǎo)出。

1.4 化合物-作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析去除重復(fù)及與化合物沒有交集的靶點(diǎn)，將與治療宮頸癌潛在作用靶點(diǎn)相對應(yīng)的化合物分子構(gòu)建關(guān)系數(shù)據(jù)表作為Cytoscape3.7.2軟件輸入的源文件，圖示化展現(xiàn)藥物活性成分與作用宮頸癌靶標(biāo)之間的相互關(guān)系。

1.5 生物學(xué)過程及通路分析通過bioconductor里所包含的clusterprofiler程序包去富集分析復(fù)方苦參注射液作用于宮頸癌的靶標(biāo)基因，設(shè)置P≤0.05，再通過pathview對所獲得的分子功能(molecular functions，MF)、生物過程(biologicalprocess，BP)、細(xì)胞組分(cellular components,CC)、及KEGG通路數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，繪制與之對應(yīng)的前30條數(shù)據(jù)的高級氣泡圖。

1.6 分子對接在PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[18]獲取復(fù)方苦參注射液重要化合物結(jié)合的候選蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)，利用MOE插件structure prepare進(jìn)行修飾，去除配體、添加氫、去除水、優(yōu)化和修補(bǔ)氨基酸，最小化所有候選靶點(diǎn)的能量。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方苦參注射液化合物及靶標(biāo)篩選收集苦參和土茯苓化合物共178個，對應(yīng)的靶標(biāo)共1 136個。

2.2 宮頸癌GEO芯片熱圖與火山圖繪制獲取的128個樣本，運(yùn)用R軟件來制作火山圖與熱圖，再利用excel匯總疾病的差異基因。紅色代表相應(yīng)基因表達(dá)上調(diào)，綠色代表相應(yīng)基因表達(dá)下調(diào)，顏色越深則表示基因表達(dá)的差異性越大，圖1,圖2。復(fù)方苦參注射液靶標(biāo)基因與宮頸癌GEO差異基因的交集基因共118個，為復(fù)方苦參注射液對宮頸癌的潛在作用靶標(biāo)。

圖1 正常人與宮頸癌患者差異基因熱圖

圖2 正常人與宮頸癌患者差異基因火山圖

2.3 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖圖3中共包括112個節(jié)點(diǎn)，1 396條邊，節(jié)點(diǎn)尺寸越大，顏色越深表示相應(yīng)節(jié)點(diǎn)的Degree越大，通過靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖計算得出相關(guān)節(jié)點(diǎn)度數(shù)的平均值為13，根據(jù)中值原則選取degree＞13的靶點(diǎn)（共計41個）作為重點(diǎn)研究，如VEGFA、MAPK3、CDK1、CCND1、MMP9、CDK4、CCNB1、CCNA2、HRAS、CXCL8、CHEK1、TOP2等。

圖3 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 藥物-化合物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將復(fù)方苦參注射液化合物和與宮頸癌的作用靶標(biāo)繪制成藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。圖中節(jié)點(diǎn)共計296個，其中化合物分子178個，潛在作用靶點(diǎn)118個，邊線共計1 143條。復(fù)方苦參注射液主要通過多成分對應(yīng)多靶標(biāo)來發(fā)揮對宮頸癌治療作用，圖4。

圖4 藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO富集分析和KEGG富集分析GO富集分析結(jié)果顯示，BP分析富集基因數(shù)量較大的有不飽和脂肪酸代謝過程(unsaturated fatty acid metabolic process),對酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)(response to acid chemical),膠原分解代謝過程(collagen catabolic process)等，點(diǎn)越大富集基因越多，P值越小顏色越紅，則表示相應(yīng)結(jié)果的置信度越高，圖5。KEGG通路富集結(jié)果共計有共135條通路(P＜0.05)，如細(xì)胞周期信號通路(Cell cycle)、AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙型肝炎信號通路(Hepatitis B)等，通路節(jié)點(diǎn)越大，表示富集該通路基因數(shù)量越多，顏色越深則表示P值越小，圖6。

圖5 BP分析

圖6 KEGG富集圖

2.6 分子對接測試苦參堿和以下潛在靶蛋白（圖7）:CDK1（PDB:6gu2）、MMP9（PDB:6esm）之間的對接精度。苦參堿是復(fù)方苦參注射液的主要化合物之一，目前有大量的關(guān)于苦參堿治療宮頸癌的研究[19-21]。這些靶蛋白在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中處于關(guān)鍵位置，同時它們參與了關(guān)鍵通路，提示它們宮頸癌對化合物的反應(yīng)中可能起關(guān)鍵作用。對接分析結(jié)果顯示靶標(biāo)蛋白和化合物分子之間結(jié)合性不錯。

圖7 苦參堿(MOL005944)與CDK1、MMP9的分子對接

3 討論

本研究結(jié)果表明，復(fù)方苦參注射液的有效活性化合物分子共有178個，其治療宮頸癌的靶標(biāo)蛋白有118個，利用R軟件對這些靶標(biāo)蛋白進(jìn)一步分析獲得復(fù)方苦參注射液治療宮頸癌的生物過程及富集通路，從而探究復(fù)方苦參注射液對宮頸癌治療作用機(jī)制，為其治療宮頸癌提供理論依據(jù)，更加科學(xué)的指導(dǎo)臨床應(yīng)用，也為進(jìn)一步的實(shí)驗探究提供方向。

已有臨床數(shù)據(jù)驗證復(fù)方苦參注射液中的主要活性成分苦參堿對宮頸癌治療有顯著療效。其中程熠[22]等的體外實(shí)驗表明苦參堿可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程來抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖。之前的很多研究結(jié)果表明苦參堿抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞的活力和遷移能力[23-25]。王芳[26]報道苦參堿對宮頸癌C33A細(xì)胞增殖具有抑制作用并可以誘導(dǎo)其凋亡。王英[27]等的小鼠實(shí)驗結(jié)果表明苦參堿能增強(qiáng)順鉑抑制U14細(xì)胞增殖作用。李軍[28]等的實(shí)驗結(jié)果提示苦參堿通過抑制人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖，可以使癌細(xì)胞周期滯留在G0/G1，S期細(xì)胞數(shù)減少。此外，大量的研究表明苦參堿通過抗炎、抗菌、抗病毒等作用發(fā)揮其對宮頸癌發(fā)生發(fā)展的預(yù)防作用。

根據(jù)“靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖”以及文獻(xiàn)資料分析可得，復(fù)方苦參注射液可能通過作用血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)、細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)等4個靶標(biāo)對宮頸癌發(fā)揮治療作用。VEGFA是由VEGFA基因編碼的蛋白質(zhì)，對內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用，可增加血管通透性，誘導(dǎo)血管生成，血管發(fā)生和內(nèi)皮細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞遷移和抑制細(xì)胞凋亡。Ioana[29]等的臨床實(shí)驗發(fā)現(xiàn)宮頸癌手術(shù)后復(fù)發(fā)的患者血清VEGFA顯著升高，提示VEGFA與宮頸癌發(fā)病密切相關(guān)，同時可預(yù)測宮頸癌放療效果。CDK是細(xì)胞周期調(diào)控的核心物質(zhì)，CDK1是CDK的一種，其在分裂間期活性高，分裂期活性迅速下降，以順利完成分裂。Deng[30]等的Sp1可能通過靶向CDK1抑制G2/M期阻滯而參與宮頸癌放療治療，提示Sp1、CDK1有望成為提高宮頸癌放療療效的潛在治療靶點(diǎn)。大量的研究表明CCND1和腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，其機(jī)制是CCND1基因末端的polyA尾的過度表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞G1期縮短，進(jìn)而體積縮小，分裂原的依賴性減弱，促進(jìn)細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖。Akin[31]等的細(xì)胞實(shí)驗結(jié)果表明依維莫司、吉西他濱和紫杉醇可降低宮頸癌CCND1的表達(dá)，提示CCND1是宮頸癌治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。MMP-9可降解細(xì)胞外基質(zhì),在腫瘤細(xì)胞生長,分化,侵襲,轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)腫瘤血管生成及免疫監(jiān)視中起到重要作用，與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。張瑞敏[32]等的臨床觀察結(jié)果表明宮頸癌患者血清MMP9水平均明顯升高,且與患者的臨床分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。

文獻(xiàn)檢索結(jié)合KEGG通路富集分析表明,復(fù)方苦參注射液治療宮頸癌主要涉及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)，P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK),核轉(zhuǎn)錄因子(NF-kappa B)，低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)。陸蓉[33]等的動物實(shí)驗提示苦參堿可能是通過抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來抑制HeLa細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)生長達(dá)到治療作用。王博[34]等的細(xì)胞實(shí)驗發(fā)現(xiàn)漢黃岑素可以通過調(diào)節(jié)P53信號通路增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的自噬和凋亡，抑制其增殖,實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)宮頸癌對順鉑的化療敏感性，且在一定劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴性。洪丹丹[35]等的細(xì)胞實(shí)驗結(jié)果驗證了小檗堿可以通過對TLR4-NF-κB信號通路調(diào)控來影響B(tài)cl-2的表達(dá),對于宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)其凋亡具有顯著的抑制作用，證明了小檗堿對治療宮頸癌有一定的作用。

4 小結(jié)

總之，本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方苦參注射液治療宮頸癌的主要化合物有苦參堿、槐定堿、右旋異苦參堿、贗靛葉堿、苦參醇、降苦參醇等，這些化合物通過作用于OPN、MMP-9、SIRT1、VEGFR-3等靶標(biāo)以及調(diào)節(jié)PI3K-Akt、apelin/APJ、P38MAPK、NF-kB、AMPK等信號通路發(fā)揮對宮頸癌的治療作用。這表明復(fù)方苦參注射液治療宮頸癌具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路參與的特點(diǎn)。本研究的不足之處在于未能通過科學(xué)實(shí)驗證實(shí)其他治療宮頸癌的可能機(jī)制，但可以為有關(guān)實(shí)驗的深一步進(jìn)行提供思路與方向。