吳小勝,崔廷婷,王兆芹,惠光鵬,趙正苗,萬宇平
可同時(shí)檢測毒死蜱、異菌脲殘留的熒光試紙條研制及其應(yīng)用
吳小勝1,2,崔廷婷1,2,王兆芹1,2,惠光鵬1,2,趙正苗1,2,萬宇平2*
(1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司,北京 102206;2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心,北京)
本文利用毒死蜱單克隆抗體、異菌脲單克隆抗體,研制出一種能夠檢測果蔬加工副產(chǎn)品類飼料中毒死蜱、異菌脲的熒光免疫層析矩陣試紙條。毒死蜱檢測限為葉菜類加工副產(chǎn)品類飼料0.5 mg/kg,根莖類加工副產(chǎn)品類飼料1 mg/kg;果蔬加工副產(chǎn)品類飼料中異菌脲檢測限為5 mg/kg,檢測時(shí)間為5 min,假陽性率和假陰性率均為0,符合《獸藥殘留檢測試劑盒(條、卡)備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》要求,試紙條能夠應(yīng)用到基層實(shí)驗(yàn)室的大批量樣本檢測,具有實(shí)際意義,并且未見同時(shí)檢測毒死蜱、異菌脲的二合一熒光免疫層析試紙條的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,具有創(chuàng)新性。
毒死蜱;異菌脲;熒光免疫層析試紙條;快速檢測
毒死蜱和異菌脲均屬于果蔬中典型殘留農(nóng)藥,毒死蜱是乙酰膽堿酯酶抑制劑,屬硫代磷酸酯類殺蟲劑,中毒癥狀表現(xiàn)為抽搐、痙攣、惡心、嘔吐等。異菌脲是二甲酰亞胺類高效廣譜、觸殺型殺菌劑,對水生生物有極高毒性,可對水體環(huán)境產(chǎn)生長期不良影響,在養(yǎng)殖過程中,動物可能通過飲食攝入,對動物造成傷害,影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)。因此,研究開發(fā)毒死蜱和異菌脲的檢測技術(shù)和方法具有重要意義。
目前傳統(tǒng)檢測毒死蜱的儀器方法有比色光譜法[1]、氣相色譜法[2]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3-4]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、電化學(xué)傳感器法[6]等;傳統(tǒng)檢測異菌脲的儀器方法有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]、氣相色譜法[8-10]、高效液相色譜法[11-12]等。上述儀器方法成本高,用時(shí)較長,而免疫化學(xué)檢測法具有低成本、用時(shí)較短、特異性較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。本文制備出一種毒死蜱單克隆抗體和異菌脲單克隆抗體,將其用于制備熒光免疫層析試紙條,費(fèi)用及檢測時(shí)限均能夠滿足基層實(shí)驗(yàn)室的檢測需求,該產(chǎn)品已市場化,應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè),保證畜產(chǎn)品質(zhì)量,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
1.1.1 材料 白菜、馬鈴薯、皇冠梨等果蔬加工副產(chǎn)品類飼料,購自北京某超市。
1.1.2 樣品與儀器 毒死蜱、異菌脲等標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95 %)購自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心,羊抗鼠抗抗體、熒光分析儀由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供;時(shí)間分辨熒光微球購自蘇州為度生物技術(shù)有限公司;渦旋儀購自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。
1.2.1 毒死蜱半抗原的制備 毒死蜱原藥與氨基丁酸在四氫呋喃中加熱,反應(yīng)完成后,堿溶解,萃取,水相調(diào)節(jié)pH,萃取,得到粗品,柱層析純化分離,得到半抗原產(chǎn)物[15]。
1.2.2 異菌脲半抗原的制備 以2,6-二氯-4-硝基苯酚為起始原料,經(jīng)烴基化反應(yīng),硝基還原反應(yīng),芳香胺的?;磻?yīng),成環(huán)反應(yīng),亞胺的?;磻?yīng)以及叔丁酯水解等反應(yīng),合成了帶有四碳鏈長度的羧基半抗原產(chǎn)物,具體方法如下[16]:
圖1 毒死蜱半抗原合成路線
化合物a的合成:5.0 g 2,6-二氯-4-硝基苯酚與3.2 g 4-溴丁酸叔丁酯在丙酮中攪拌,加2.6無水碳酸鉀催化,60 ℃ 反應(yīng)8 h。反應(yīng)停止后,蒸出溶劑,加水與乙酸乙酯萃取,有機(jī)層加入無水硫酸鈉干燥,濃縮,過200-300目硅膠柱,用吸附柱色譜進(jìn)行層析分離純化,得到化合物a 5.23 g,收率87 %。
化合物b的合成:鋅粉3.1 g加水20 ml,冰乙酸1 ml,90 ℃ 反應(yīng)30 min,加5.2 g化合物a的乙醇溶液80 ml,60 ℃ 反應(yīng)4 h。停止反應(yīng),抽濾,蒸干,加水與二氯甲烷萃取,靜置,有機(jī)層加入無水硫酸鈉干燥,石油醚/乙酸乙酯20/1重結(jié)晶,得到化合物b 4.8 g,收率91 %。
化合物c的合成:化合物b 4.7 g加乙腈100 ml溶解,攪拌,加氨基乙酸2.16 g,氮?dú)獗Wo(hù)下,通入碳酰氯,50 ℃ 反應(yīng)7 h。停止反應(yīng),加氫氧化鈉水溶液50 ml,震蕩,旋蒸,除去乙腈,加乙酸乙酯溶解,加水洗滌,濃縮,蒸干,過200~300目硅膠柱,用吸附柱色譜進(jìn)行層析分離純化,得到化合物c 3.57 g,收率73 %。
圖2 異菌脲半抗原合成路線
化合物d的合成:化合物c 3.4 g加1,2-二氯乙烷溶解,加DMF 0.5 ml,加草酰氯3 ml,室溫?cái)嚢? h,旋蒸蒸干,除去有機(jī)溶劑,加吡啶80 ml溶解,80 ℃ 反應(yīng)7 h。停止反應(yīng),冷卻到室溫,旋蒸,除去吡啶,加乙醇-石油醚(10:3,v/v)加熱溶解,4 ℃ 放置過夜,抽濾,得到化合物d 2.97 g,收率82 %。
化合物e的合成:化合物d 2.8 g加1,2-二氯乙烷200 ml溶解,加異丙胺2.7 ml,通入氮?dú)猓懦諝?,通入碳酰氯,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6 h。停止反應(yīng),加KOH水溶液50 ml震蕩,靜置,分出有機(jī)相,水洗,無水硫酸鈉干燥蒸干,過200~300目硅膠柱,石油醚/乙酸乙酯(1:1)洗脫分離,得到化合物e 1.53 g,收率64 %。
化合物f的合成:取化合物e 1.53 g,加70 % 甲酸水溶液100 ml溶解,70 ℃ 攪拌反應(yīng)6 h,停止反應(yīng),旋蒸,除去溶劑,加氫氧化鈉水溶液,加乙酸乙酯萃取,分去有機(jī)相,水相調(diào)節(jié)pH值到4,加1,2-二氯乙烷萃取,水洗,干燥,蒸干,乙醇/正己烷(6:4,v/v)重結(jié)晶,得到白色固體0.81 g,收率77 %。
1.2.3 單克隆抗體的制備 將1.2.1制備的毒死蜱半抗原、1.2.2制備的異菌脲半抗原分別與牛血清白蛋白偶聯(lián),得到毒死蜱免疫原、異菌脲免疫原。分別用毒死蜱免疫原、異菌脲免疫原免疫Balb/c小鼠,免疫劑量為150 μg/只,使其產(chǎn)生抗血清。小鼠血清測定結(jié)果較高后,取其脾細(xì)胞,按8:1(數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液,篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化,直到得到分泌氟喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管,立即放入37 ℃ 水浴中速融,離心去除凍存液后,移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5 ml/只,7 d后腹腔注射穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株5×105個(gè)/只,7 d后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化,-20 ℃ 保存。即得到毒死蜱單克隆抗體、異菌脲單克隆抗體。將1.2.1制備的毒死蜱半抗原、1.2.2制備的異菌脲半抗原分別與卵清白蛋白偶聯(lián),得到毒死蜱包被原、異菌脲包被原。
1.2.4 制備毒死蜱、異菌脲殘留二合一熒光試紙條 1.2.3制備的毒死蜱單克隆抗體、異菌脲單克隆抗體分別用熒光微球標(biāo)記,具體方法如下:(1)取熒光微球懸液100 μl混懸于900 μl活化緩沖液中,于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后棄上清,重懸微球于1 ml活化緩沖液中,以此法洗滌微球2次,加入適量活化劑,混勻后室溫震蕩活化10 min;(2)將(1)所述混懸液于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后棄上清,重懸于偶聯(lián)緩沖液中,以此法洗滌微球2次,加入10~20 μl抗毒死蜱單克隆抗體溶液/異菌脲單克隆抗體溶液(蛋白濃度1 mg/ml),混勻后室溫震蕩偶聯(lián)120 min;(3)將(2)所述混懸液于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后棄上清,重懸于封閉緩沖液中,以此法洗滌微球1次,混勻后室溫震蕩封閉30 min;(4)將(3)所述混懸液于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后棄上清,重懸于貯存緩沖液中,以此法洗滌微球1次,混勻后于4 ℃ 避光保存。將上述熒光微球標(biāo)記的抗體分別噴涂到試紙條的結(jié)合物釋放墊上,在檢測線1(T1線)上包被毒死蜱包被原,在檢測線2(T2線)上包被異菌脲包被原;在質(zhì)控線(C線)上包被羊抗鼠抗抗體。組裝上述結(jié)構(gòu),制備出毒死蜱、異菌脲殘留二合一熒光試紙條。
1.2.5 檢測方法 檢測前樣品應(yīng)恢復(fù)至室溫,取新鮮樣品擦去泥土,剪碎成小于1 cm見方的碎片。稱取1.00 ± 0.05 g樣品至15 ml聚苯乙烯離心管中,再加入5 ml提取液,蓋上蓋子,手動上下振蕩30s,靜置1min,得樣品溶液。
用吸管吸取上述樣品溶液垂直滴加2~3滴于加樣孔,液體流動時(shí)開始計(jì)時(shí),反應(yīng)5min,通過熒光分析儀讀取檢測結(jié)果。其它時(shí)間判讀無效。
圖3 毒死蜱、異菌脲殘留二合一熒光試紙條
1.2.6 樣本檢測限 在空白白菜樣本中添加毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/kg,在空白馬鈴薯樣本中添加毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg,在空白白菜樣本以及皇冠梨樣本中分別添加異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、2.5、5、7.5、10 mg/kg。按照1.2.5所述方法用三批試紙條進(jìn)行檢測,每個(gè)濃度重復(fù)5次,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定樣本檢測限[17]。
1.2.7 試紙條的特異性 《獸藥殘留檢測試劑盒(條、卡)備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》規(guī)定:采用與待檢藥物同類藥物、類似物或可能聯(lián)合使用的藥物測定特異性,因此,分別配制10 mg/kg的腐霉利、啶蟲脒、滅蠅胺等藥物,用試紙條重復(fù)檢測3次,判斷試紙條的特異性。
1.2.8 準(zhǔn)確性 農(nóng)業(yè)部文件要求:以假陽性率和假陰性率表示熒光免疫層析法的準(zhǔn)確性[17]。取經(jīng)儀器確證的50份陰性果蔬樣品(質(zhì)量濃度小于檢測限),50份陽性果蔬樣品(質(zhì)量濃度大于檢測限),用該試紙條進(jìn)行檢測毒死蜱、異菌脲藥物殘留,計(jì)算假陽性率和假陰性率[17]。《獸藥殘留檢測試劑盒(條、卡)備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》規(guī)定:試紙條假陽性率應(yīng)小于5 %,假陰性率應(yīng)為零[17]。
在空白白菜樣本中添加毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/kg,在空白馬鈴薯樣本中添加毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg,在空白白菜樣本以及皇冠梨樣本中分別添加異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、2.5、5、7.5、10 mg/kg。按照1.2.6步驟進(jìn)行檢測,確定檢測限[17]。檢測白菜中毒死蜱濃度為0 mg/kg、0.25 mg/kg時(shí),試紙條呈現(xiàn)陰性結(jié)果,濃度為0.5 mg/kg、0.75 mg/kg、1.0 mg/kg時(shí),試紙條呈現(xiàn)陽性結(jié)果,即試紙條能夠檢測出大于等于0.5 mg/kg濃度的毒死蜱白菜樣本;檢測馬鈴薯中毒死蜱濃度為0 mg/kg、0.5 mg/kg時(shí),試紙條呈現(xiàn)陰性結(jié)果,濃度為1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg時(shí),試紙條呈現(xiàn)陽性結(jié)果,即試紙條能夠檢測出大于等于1.0 mg/kg濃度的毒死蜱馬鈴薯樣本;檢測白菜中異菌脲濃度為0 mg/kg、2.5 mg/kg時(shí),試紙條呈現(xiàn)陰性結(jié)果,濃度為5 mg/kg、7.5 mg/kg、10 mg/kg時(shí),試紙條呈現(xiàn)陽性結(jié)果,即試紙條能夠檢測出大于等于5 mg/kg濃度的異菌脲白菜樣本;檢測皇冠梨中異菌脲濃度為0 mg/kg、2.5 mg/kg時(shí),試紙條呈現(xiàn)陰性結(jié)果,濃度為5 mg/kg、7.5 mg/kg、10 mg/kg時(shí),試紙條呈現(xiàn)陽性結(jié)果,即試紙條能夠檢測出大于等于5 mg/kg濃度的異菌脲皇冠梨樣本。由此可知,該試紙條的檢測限為:毒死蜱檢測限為白菜0.5 mg/kg,馬鈴薯1 mg/kg;白菜和皇冠梨中異菌脲檢測限為5 mg/kg,見表1。
表1 毒死蜱、異菌脲二合一試紙條的檢測限
注:- 表示陰性,+ 表示陽性。
該試紙條檢測10 mg/kg的腐霉利、啶蟲脒、滅蠅胺等藥物,結(jié)果均呈陰性,表明該試紙條特異性較好。
用試紙條檢測50份陰性果蔬樣品,檢測結(jié)果均為陰性,說明假陽性率低于5 %;用試紙條檢測50份陽性果蔬樣品,試紙條檢測結(jié)果均為陽性,說明試紙條假陰性率為零,符合《獸藥殘留檢測試劑盒(條、卡)備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》要求[17]。
表2 特異性測定
表3 準(zhǔn)確性測定
由于市場需求,本研究暫時(shí)只測定了白菜、馬鈴薯、皇冠梨等果蔬加工副產(chǎn)品類飼料樣本,后續(xù)研究會增加樣本進(jìn)行測定。本研究制備的農(nóng)藥殘留熒光免疫層析矩陣試紙條,只需根據(jù)樣本特點(diǎn)調(diào)整其前處理方法,即能夠檢測出該樣本的農(nóng)藥殘留量,因此,本試紙條對于其他動物飼料方面的檢測,同樣適用。
本文制備出的毒死蜱、異菌脲半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原,最終制備出商品化的熒光免疫層析矩陣試紙條。按照《獸藥殘留檢測試劑盒(條、卡)備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》要求,對試紙條進(jìn)行了特異性、準(zhǔn)確性等性能測試,均符合要求。試紙條的檢測時(shí)間僅為5 min,比現(xiàn)有文獻(xiàn)中儀器方法用時(shí)更短,操作更簡便。試紙條對毒死蜱檢測限為葉菜類加工副產(chǎn)品類飼料樣本0.5 mg/kg,根莖類加工副產(chǎn)品類飼料樣本1 mg/kg;果蔬加工副產(chǎn)品類飼料樣本中異菌脲檢測限為5 mg/kg,靈敏度較高。該方法作為一種快速篩查手段,可廣泛用于果蔬加工副產(chǎn)品類飼料中農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場篩查和檢測,具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會價(jià)值。
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(2021–03–24)
S818.9
A
1007-1733(2021)08-0013-06
典型性農(nóng)殘多靶標(biāo)高效快速檢測技術(shù)研究與應(yīng)用(Z181100009318006)項(xiàng)目資助