孔凡華 李菁菁 韋艷琳 馬文麗 白沙沙 徐佳佳 崔亞娟

摘 要：建立高效液相色譜法測(cè)定食品中姜黃素類(lèi)化合物含量的分析方法。利用單因素試驗(yàn)，對(duì)食品中姜黃素類(lèi)化合物的提取試劑、提取方式、提取時(shí)間進(jìn)行選擇，確定最佳提取條件為甲醇振蕩提取5 min。色譜條件：YMC^TMC30色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（80∶20，v/v），用磷酸調(diào)節(jié)pH 到3.0，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)420 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果表明：3種姜黃素類(lèi)化合物在0.10～10.00 μg/mL內(nèi)與峰面積有良好線性關(guān)系，生姜和咖喱中3種姜黃素類(lèi)化合物的平均回收率分別為87.86%～107.35%和87.08%～107.47%，RSD均小于5%，3種姜黃素類(lèi)化合物含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%。該方法簡(jiǎn)單可行、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可廣泛用于食品中姜黃素類(lèi)化合物含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;姜黃素類(lèi)化合物;脫甲氧基姜黃素;雙脫甲氧基姜黃素

姜黃素是我國(guó)食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 2760^[1]允許使用的著色劑，可以在糕點(diǎn)、飲料、糖果、冷凍飲品等14種食品中使用。姜黃素類(lèi)化合物具有抗炎抗氧化和抗菌活性^[2-4]、抗腫瘤抗癌抗病毒活性^[5-7]、抗動(dòng)脈粥樣硬化^[8]、保肝護(hù)肝^[9]等多種藥理功效，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品著色劑以及化妝品上并逐漸被應(yīng)用到保健食品和飲料上^[10]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的姜黃素類(lèi)化合物檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法^[11-13]、分光光度法^[14]、薄層色譜法^[16]、毛細(xì)管電泳法^[17-18]和液相色譜-質(zhì)譜法^[19-20]等。分光光度計(jì)法測(cè)定的是總姜黃素類(lèi)化合物的含量，不適合姜黃素各單體化合物的測(cè)定;薄層色譜法通常用來(lái)做半定量或限定試驗(yàn)，但由于姜黃素類(lèi)化合物不穩(wěn)定，在薄層上分離時(shí)容易受光及其他因素影響，導(dǎo)致結(jié)果重現(xiàn)性差、準(zhǔn)確性低;毛細(xì)管電泳法具有快速、微量的優(yōu)點(diǎn)，但方法的重現(xiàn)性較差;液相色譜-質(zhì)譜法具有靈敏度高的特點(diǎn)，但是設(shè)備昂貴，方法普及性差;HPLC法因其分離效果好、靈敏度高、選擇性好成為目前測(cè)定姜黃素類(lèi)化合物的常用方法。本研究參照姜黃素類(lèi)化合物檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法和文獻(xiàn)方法，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，對(duì)食品中姜黃素類(lèi)化合物的提取試劑、提取方式、提取時(shí)間等前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，以3種姜黃素類(lèi)化合物提取效率的高低作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳提取條件;通過(guò)比較檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜柱、流動(dòng)相、流速和柱溫等高效液相色譜條件，以3種姜黃素類(lèi)化合物的分離度和峰形對(duì)稱(chēng)性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳色譜條件，實(shí)現(xiàn)食品中3種姜黃素類(lèi)化合物的有效提取和高效分離。生姜和咖喱是最常見(jiàn)、最易得的富含姜黃素的樣品，因此該試驗(yàn)選取這兩種物質(zhì)為研究對(duì)象，進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，考察方法的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和適用性，以期建立食品中姜黃素類(lèi)化合物的精準(zhǔn)分析檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生姜、咖喱等樣品，市購(gòu);姜黃素、脫甲氧基姜黃素、雙脫甲氧基姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%），都埃法生物科技有限公司。甲醇、乙腈（均為色譜純），美國(guó)Fisher公司;無(wú)水乙醇，優(yōu)級(jí)純，北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224S分析天平，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;QL-901斡旋振蕩器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;EYELA MMV-1000W振蕩器，東京理化株式會(huì)社;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超市儀器有限公司;HITACHI CF16RXII 高速冷凍離心機(jī)，日本日立科技有限公司;METTLER TOLEDO pH計(jì)，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司;EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化株式會(huì)社;安捷倫1260高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器和ChemStation for LC systems（版本序列號(hào)：Rev.B.04.03-SP2[105]）色譜工作站，美國(guó)Agilent公司;YMC^TMC30色譜柱，5 μm，250 mm×4.6 mm（內(nèi)徑）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為500 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中保存，使用前用甲醇稀釋成相應(yīng)的質(zhì)量濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 提取溶劑的選擇 稱(chēng)取0.100 0 g咖喱樣品和10.000 0 g（精確至 0.000 1 g）生姜樣品，置于 50 mL 棕色容量瓶中，根據(jù)姜黃素類(lèi)化合物的理化特性，分別加入 30 mL甲醇、無(wú)水乙醇、甲醇∶水=1∶1（V/V）、甲醇∶水=7∶3（V/V）、無(wú)水乙醇∶水=8∶2（V/V）、乙腈超聲提?。üβ蕿?00 W，25 ℃）10 min，分別加提取溶劑定容至刻度，搖勻后轉(zhuǎn)移至離心管中，置于離心機(jī)4 ℃、5 000 r/min 離心 5 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜后供液相色譜測(cè)定。

1.3.3 提取方式的選擇 稱(chēng)取0.100 0 g咖喱樣品（精確至 0.000 1 g）置于 50 mL 棕色容量瓶中，分別加入 30 mL甲醇，常溫超聲提取、振蕩提?。?80 r/min）、渦旋提取10 min，加甲醇至刻度，搖勻后轉(zhuǎn)移至離心管中，置于離心機(jī)4 ℃、5 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò) 0.45 μm濾膜過(guò)濾后供液相色譜測(cè)定。

1.3.4 提取時(shí)間的選擇 稱(chēng)取 0.100 0 g咖喱樣品（精確至 0.000 1 g）置于 50 mL 棕色容量瓶中，分別加入 30 mL甲醇，振蕩提取（280 r/min）1、5、10、15、20、30 min，加甲醇至刻度，搖勻后轉(zhuǎn)移至離心管中，置于離心機(jī)4 ℃、5 000 r/min 離心 5 min，取上清液過(guò) 0.45 μm濾膜后供液相色譜測(cè)定。

1.3.5 色譜參考條件 色譜柱：YMC^TMC30色譜柱，5 μm，250 mm×4.6 mm（內(nèi)徑）;柱溫30 ℃;流動(dòng)相∶乙腈-水（80∶20，v/v），用磷酸調(diào)節(jié)pH 為3.0;流速1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)420 nm;進(jìn)樣量10 μL。

1.3.6 方法驗(yàn)證 按照《GB/T 27404—2008試驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》^[21]方法學(xué)要求，建立校準(zhǔn)曲線及校準(zhǔn)曲線的工作范圍;逐步稀釋樣品上機(jī)測(cè)定，R（S/N）=3時(shí)的測(cè)定濃度作為檢出限，R（S/N）=10時(shí)的測(cè)定濃度作為定量限;分別稱(chēng)取生姜和咖喱樣品，按照試驗(yàn)優(yōu)化的方法，平行測(cè)定6次，計(jì)算姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素的含量，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的重現(xiàn)性;向樣品本底添加低、中、高三個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行三水平六平行加標(biāo)回收試驗(yàn)，以回收率的高低評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度。

1.4 姜黃素類(lèi)化合物含量的計(jì)算

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 本法采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。將姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)、以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算直線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4.2 結(jié)果計(jì)算 試樣中姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素含量按式（1）計(jì)算：

X=C×Vm×f………………（1）

式（1）中，X-試樣中姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素的含量（μg/g）;C-標(biāo)準(zhǔn)工作液中姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素的含量（μg/mL）;V-試樣溶液體積（mL）;m-試樣質(zhì)量（g）;f-試樣濃縮倍數(shù)?？偨S素含量是3種姜黃素類(lèi)化合物單體含量的和。

1.5 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)與儀器配套的 ChemStation for LC systems（版本序列號(hào)：Rev.B.04.03-SP2[105]）工作站軟件完成數(shù)據(jù)的采集與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

姜黃素極性較小，不溶于水和乙醚，易溶于甲醇、乙醇、丙二醇等試劑中。本研究根據(jù)前人研究成果^[22-26]選取6種不同提取溶劑，比較不同提取溶劑對(duì)生姜和咖喱中姜黃素類(lèi)化合物的提取效果。由表1、表2可知，甲醇對(duì)生姜和咖喱中姜黃素類(lèi)化合物的提取效果最佳，顯著高于其他提取溶劑（P<0.05），本研究結(jié)果與李卓等^[27]研究結(jié)果吻合。

2.2 提取方法的選擇

提取方法是指提取、制備目標(biāo)化合物的方法。選擇提取方法時(shí)，既要保證高提取效率，又要保證有效成分在提取過(guò)程中不被破壞，振蕩提取、超聲提取和渦旋提取是常用的提取方法。由表3可知，振蕩提取、超聲提取和渦旋提取對(duì)咖喱中3種姜黃素類(lèi)化合物提取效率沒(méi)有顯著性差異（P>0.05），本研究選擇振蕩提取方法。

2.3 提取時(shí)間的選擇

由表4可知，振蕩提取不同時(shí)間對(duì)咖喱中3種姜黃素類(lèi)化合物提取效率沒(méi)有顯著性影響（P>0.05），考慮到食品基質(zhì)的復(fù)雜性，個(gè)別樣品提取時(shí)間太短可能會(huì)導(dǎo)致提取不完全，所以本研究選擇振蕩提取5 min。

2.4 姜黃素類(lèi)化合物方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限 按照1.3.5色譜

條件進(jìn)行HPLC分析，得出姜黃素類(lèi)化合物的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限。表5結(jié)果表明，在0.1～10.0 μg/mL內(nèi)，3種姜黃素類(lèi)化合物的濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系。雙脫甲氧基姜黃素和脫甲氧基姜黃素分離度為4.96、脫甲氧基姜黃素和姜黃素分離度為5.59、雙脫甲氧基姜黃素出峰時(shí)間為6.012 min、脫甲氧基姜黃素出峰時(shí)間為7.155 min、姜黃素出峰時(shí)間為8.719 min（圖1）。

2.4.2 方法精密度試驗(yàn) 按試驗(yàn)優(yōu)化的最佳提取方式和色譜條件，平行測(cè)定6次，生姜和咖喱中姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素HPLC色譜圖見(jiàn)圖2和圖3。由表6可知，生姜和咖喱中姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素測(cè)定結(jié)果的RSD均小于5%，滿(mǎn)足《GB/T 27404—2008 試驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》^[21]要求，表明方法精密度良好。

2.4.3 方法準(zhǔn)確度試驗(yàn) 準(zhǔn)確度為分析方法測(cè)定的平均值與真值相符的程度。穩(wěn)定樣品中加入不同水平已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量作為真值）稱(chēng)加標(biāo)樣品;同時(shí)測(cè)定樣品和加標(biāo)樣品;加標(biāo)樣品扣除樣品值后與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的誤差即為該方法的準(zhǔn)確度：

P=X1-X0m×100%（2）

式（2）中，P-加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率;m-加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量;X1-加標(biāo)試樣的測(cè)定值;X0-未加標(biāo)試樣的測(cè)定值。

為測(cè)定本方法的準(zhǔn)確度，采用樣品加標(biāo)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。由表7、表8可知，生姜和咖喱中3種姜黃素類(lèi)化合物的平均回收率均分別為87.86%～107.35%和87.08%～107.47%，RSD均小于5%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)論

在前人研究的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，對(duì)食品中姜黃素類(lèi)化合物的提取試劑、提取方式、提取時(shí)間等前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，以3種姜黃素類(lèi)化合物提取效率的高低作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到食品中姜黃素類(lèi)化合物的最佳提取方式為甲醇振蕩提取5 min。選擇生姜和咖喱樣品進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明，3種姜黃素類(lèi)化合物在0.1～10.0 μg/mL（決定系數(shù)r>0.999）的濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系;姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素的檢出限分別為0.1、0.2、0.3 μg/g，定量限分別為0.3、0.6、0.9 μg/g;按試驗(yàn)確定的最佳前處理?xiàng)l件和色譜條件平行測(cè)定6次，得到生姜和咖喱中3種姜黃素類(lèi)化合物含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%;向樣品本底添加低、中、高三個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行三水平六平行加標(biāo)回收試驗(yàn)，得到生姜和咖喱中3種姜黃素類(lèi)化合物的平均回收率為87.86%～107.35%和87.08%～107.47%，RSD均小于5%，表明方法準(zhǔn)確度良好。本研究建立的方法，操作簡(jiǎn)單，儀器成本低，精密度好，準(zhǔn)確度高，可以同時(shí)測(cè)定食品中3種姜黃素類(lèi)化合物的含量，是分析食品中姜黃素類(lèi)化合物成分的理想方法，可以為食品中姜黃素類(lèi)化合物的測(cè)定提供方法基礎(chǔ)?！?/p>

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Determination on Curcuminoids in Food by High Performance Liquid Chromatography

KONG Fan-hua¹，LI Jing-jing¹，WEI Yan-lin，MA Wen-li²，BAI Sha-sha¹，XU Jia-jia¹，CUI Ya-juan¹

（¹Beijing Institute of Nutrition Resources，Beijing 100069，China;²Inner Mongolia Mengniu Dairy Industrial Co.Ltd.，Hohhot 011500，China）

Abstract：An analytical method was developed for determining total content of curcuminoids in food by high performance liquid chromatography.The extraction reagent，extraction method and extraction time of curcuminoids in food were selected by single factor experiment.Methanol extraction by shaking for 5 min was selected.The separation of curcuminoids were achieved on YMC^TMC30 column（150 mm×4.6 mm，5 μm）using acetonitrile-water（80∶20，v/v）as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The DAD detection wavelength and column temperature were set at 420 nm and 30 ℃，respectively.The results showed that the linear range of three curcuminoids were 0.10～10.00 μg/mL.The average recovery rate of ginger and curry was 87.86%～107.35% and 87.08%～107.47% and RSD was less than 5%.The relative standard deviation（RSD）was no more than 5%.Therefore，this developed method is characteristics of simple operation，and high reproducibility and accuracy.It can be widely applied to determine total content of curcuminoids in food.

Keywords：HPLC;curcuminoids;demethoxycurcumin;bisdemethoxycurcumin