越橘花色苷的酰化修飾及其穩(wěn)定性改善研究

洪森輝，黃冰晴，張晶怡，費(fèi)鵬*

1(閩南師范大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，福建 漳州，363000)2(閩南師范大學(xué) 閩臺(tái)特色園林植物福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 漳州，363000)

蔓越橘屬于杜鵑花科、越橘屬(Vacciniumspp.)多年生落葉或常綠灌木，在全世界廣泛分布[1]。越橘中含有豐富的花色苷，其含量在目前已測(cè)蔬菜與水果中較高。BARON等[2]從蔓越橘中提取了花色苷并進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果表明越橘花色苷中主要包括15種花色苷，是由矢車(chē)菊素、飛燕草素、芍藥色素、牽牛花色素和錦葵色素分別與葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖通過(guò)糖苷鍵結(jié)合形成的?；ㄉ赵谒嵝詶l件下形成穩(wěn)定的紅色烊陽(yáng)離子，并在堿的存在下部分轉(zhuǎn)變?yōu)轷?lèi)結(jié)構(gòu)并呈現(xiàn)藍(lán)色[3-4]。這種特性使它們可以用于制備有顏色指示的智能食品包裝材料，用以監(jiān)測(cè)肉類(lèi)食品的腐敗變質(zhì)[5-7]。

花色苷在貯藏和加工過(guò)程中容易降解和褪色，極大地影響了其在智能包裝中的應(yīng)用。除了pH、光、氧[8]等外部因素外，花色苷的結(jié)構(gòu)對(duì)其穩(wěn)定性也有很大的影響。有研究表明花色苷中2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)中羥基的增加通常會(huì)導(dǎo)致其穩(wěn)定性的降低，而甲基化程度的增加有利于提高花色苷的穩(wěn)定性[9]。游離羥基的糖基化也增強(qiáng)了花青素的穩(wěn)定性，這是由于糖鏈可以像緞帶一樣在2-苯基苯并吡喃骨架表面堆積，這種堆積可以防止花色苷因水合平衡的轉(zhuǎn)換而褪色，從而保持其顏色穩(wěn)定性[10]。部分天然花色苷常被酰化修飾，常見(jiàn)的?；鶊F(tuán)有芳香酸(如阿魏酸、芥子酸、沒(méi)食子酸等)和脂肪酸(如丙二酸、乙酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸、草酸)[11]。有研究表明，在同種情況下，?；幕ㄉ毡确酋；幕ㄉ辗€(wěn)定性更好[10,12-13]，這是因?yàn)轷；奈蛔栊?yīng)使花色苷更不容易受到水攻擊和阻礙，抑制甲醇假堿和查爾酮結(jié)構(gòu)的形成。YANG等[14]利用月桂酸對(duì)黑豆花色苷進(jìn)行?；男?，結(jié)果表明改性花色苷的熱穩(wěn)定性顯著提高了。本課題組在前期通過(guò)固相反應(yīng)法將馬來(lái)酸酐接枝到花色苷分子上，其褪色率顯著降低[15]，但其穩(wěn)定性仍不理想。

本研究采用酶催化方法將3,4-二羥基苯甲酸及沒(méi)食子酸接枝到越橘花色苷分子上以提高其穩(wěn)定性，為越橘花色苷的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

越橘(蔓越橘，Vaciniummacrocarpon)花色苷粗提物，西安圣青生物有限公司；脂肪酶(Novozymes 435，≥5 000 U/g，重組酶，在黑曲霉中表達(dá))、3,4-二羥基苯甲酸、沒(méi)食子酸，上海阿拉丁試劑有限公司；油酸、β-胡蘿卜素、DPPH，上海麥克林試劑有限公司；四氫呋喃、無(wú)水乙醇、吐溫-80、檸檬酸、鹽酸、磷酸氫二鉀，西隴化工股份有限公司。本文所用試劑，如無(wú)特別說(shuō)明，均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

MultiSkan Go全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、NICOLET IS 10傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)賽默飛世爾有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海力辰儀器科技有限公司；T9紫外-可見(jiàn)分光光度儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ?；ㄉ盏闹苽?/p>

將10 g越橘花色苷粗提物溶于300 mL無(wú)水乙醇，隨后用微孔膜過(guò)濾去除花色苷中的蛋白質(zhì)、多糖、果膠等；然后在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以去除濾液中的無(wú)水乙醇；最后，通過(guò)冷凍干燥進(jìn)一步去除溶劑，所得樣品即為越橘花色苷，記作Na-An。

將4 g越橘花色苷溶于100 mL去離子水并加入1 g Novozymes 435脂肪酶混合均勻；將15 mmol的3,4-二羥基苯甲酸溶于100 mL四氫呋喃；然后將上述2種液體混合，并將其置于50 ℃下磁力攪拌24 h進(jìn)行酶催化反應(yīng)；反應(yīng)完成后，通過(guò)微孔濾膜過(guò)濾去除混合液中的脂肪酶；隨后，在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以去除混合液中的四氫呋喃，再通過(guò)冷凍干燥去除水分；接著，將所得固體樣品分散于100 mL四氫呋喃中，攪拌10 min后通過(guò)微孔濾膜過(guò)濾，取濾渣，重復(fù)3次以洗去固體樣品中的未反應(yīng)的酚酸；最后，通過(guò)冷凍干燥去除濾渣中剩余的四氫呋喃，收集樣品即為3,4-二羥基苯甲酸修飾的越橘花色苷，記作Dh-An。

用同樣方法制備沒(méi)食子酸修飾的越橘花色苷，記作Ga-An。

1.3.2 ?；葴y(cè)定

采用電位滴定法測(cè)定花色苷的酰化度(acylation degree，AD)[16-17]。將0.2 g的花色苷(或?；ㄉ?溶解于20 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中，在40 ℃下攪拌2 h使花色苷水解并皂化；隨后，用0.01 mol/L的HCl溶液滴定至pH值為9.0。按照公式(1)、公式(2)計(jì)算?；ㄉ盏乃嶂?acid value，AV)和AD：

(1)

AD/%=M×(AV1-AV0)×100

(2)

式中：C0為皂化使所用NaOH溶液濃度(0.1 mol/L)；V0為皂化使所用NaOH溶液體積(20 mL)；C1為滴定使所用NaOH溶液濃度(0.01 mol/L)；V1為滴定使所用NaOH溶液體積；m為所用花色苷質(zhì)量；M為接枝基團(tuán)的相對(duì)分子質(zhì)量;AV1為酰化花色苷的酸值；AV0為原始花色苷的酸值。

1.3.3 總花青素含量測(cè)定

通過(guò)pH差示法測(cè)定花色苷中的總花青素含量(total anthocyanin content，TAC)，具體參照李曉嬌等[18]方法。分別用pH 1.0(0.5 mol/L檸檬酸/鹽酸)和pH 4.5(0.5 mol/L檸檬酸/磷酸氫二鉀)的緩沖液將2份10 mL花色苷溶液(5 g/L)稀釋至250 mL；在黑暗中放置1 h后，用酶標(biāo)儀分別測(cè)定2種溶液在513和700 nm處的吸光度?；ㄉ盏腡AC值計(jì)算如公式(3)和公式(4)所示：

(3)

A=(A513 nm-A700 nm) pH1.0-(A513nm-A700nm) pH4.5

(4)

式中：A表示吸光度；MW為矢車(chē)菊蘇-3-O-葡萄糖的相對(duì)分子質(zhì)量，為449.2 g/moL；ε為摩爾消光系數(shù)，為26 900 L/(mol·cm)；DF為稀釋因子；L為光程。

1.3.4 DPPH自由基清除率測(cè)定

用無(wú)水乙醇稀釋0.25 mmol/L DPPH乙醇溶液至其在513 nm處吸光度約為0.8；向4 mL的DPPH溶液中加入0.05 mL花色苷溶液，在黑暗中靜置30 min后，測(cè)定其在513 nm處的吸光度；參照樣品不加花色苷溶液，以50 μL無(wú)水乙醇替代；通過(guò)公式(5)計(jì)算花色苷的DPPH自由基清除率：

(5)

式中：A0為參照樣在513 nm處的吸光度，A1為樣品在513 nm處的吸光度。

1.3.5 β-胡蘿卜素漂白抑制率測(cè)定

參照YANG等[19]，將10 mL β-胡蘿卜素氯仿溶液(1 mg/mL)、400 mL亞油酸和4 mL吐溫-80在梨形瓶中充分混合后，在40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿。隨后，在梨形瓶中加入100 mL蒸餾水，將混合后的液體均勻混合成乳化液；然后取10 mL乳化液并稀釋至100 mL，制得乳化稀釋液；將0.1 mL的花色苷溶液加入到4.9 mL的乳化稀釋液中，混合均勻后測(cè)定其在470 nm處相應(yīng)的吸光度；然后將樣品置于50 ℃恒溫水浴2 h，并測(cè)定其在470 nm處吸光度。參照樣中不加花色苷溶液，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液代替。通過(guò)公式(6)計(jì)算β-胡蘿卜素漂白法的抑制率：

(6)

1.3.6 穩(wěn)定性測(cè)定

取10 mL花色苷溶液，將其置于25 ℃環(huán)境下貯存，每12 h測(cè)量1次花色苷溶液在513 nm處的吸光度，根據(jù)公式(7)計(jì)算花色苷溶液的褪色率：

(7)

式中：A0為花色苷溶液的初始吸光度(513 nm處)，A1為貯存一定時(shí)間后花色苷溶液在513 nm處的吸光度。

1.3.7 結(jié)構(gòu)表征

通過(guò)NICOLET IS 10傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR)表征花色苷的官能團(tuán)，波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為16 cm-1；采用在T9紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-visible spectroscopy，UV-Vis)測(cè)定其在200～800 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV-Vis分析

采用UV-Vis研究了3,4-二羥基苯甲酸及沒(méi)食子酸改性對(duì)越橘花色苷分子結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖1所示。越橘花色苷在～279 nm和～523 nm處有2個(gè)特征吸收峰，是由花色苷的吡喃環(huán)上的電子躍遷造成的。早在1958年，HARBORNE等[20-22]已經(jīng)開(kāi)始報(bào)道UV-Vis光譜學(xué)在花青素結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用。研究結(jié)果表明，花色苷UV-Vis譜圖上300～350 nm處的肩峰是由?；斐傻模移湓谠撎幍奈舛扰c可見(jiàn)光區(qū)最大吸收強(qiáng)度的比值表示花色苷?；潭取Ｓ蓤D1可以看出，與天然越橘花色苷相比，改性花色苷在～312 nm處出現(xiàn)了明顯的肩峰，表明3,4-二羥基苯甲酸和沒(méi)食子酸都通過(guò)酰化反應(yīng)接枝到花色苷分子上，而不是與花色苷物理共混。

a-紫外光區(qū)；b-可見(jiàn)光區(qū)圖1 越橘花色苷及改性花色苷的UV-Vis圖譜Fig.1 UV-Vis spectra of native and acylated anthocyanins

2.2 FTIR分析

a-4 000～400 cm-1；b-2 000～1 000 cm-1圖2 越橘花色苷及改性花色苷的紅外光譜圖譜Fig.2 FTIR spectra of native and acylated anthocyanins

2.3 ?；群突ㄇ嗨睾糠治?/h3>

通過(guò)電位滴定法測(cè)定了越橘花色苷酰化反應(yīng)后的?；取Ｈ鐖D3-a所示，3,4-二羥基苯甲酸及沒(méi)食子酸修飾花色苷的?；确謩e為4.65%(Dh-An)和4.53%(Ga-An)。如圖3-b所示，天然越橘花色苷中的花青素含量為373.3 mg/g，酰化改性后，Dh-An 中花青素含量為167.9 mg/g，Ga-An中花青素含量為154.8 mg/g。這可能是由于以下幾個(gè)方面造成，一方面，外來(lái)基團(tuán)接枝到花色苷分子上，導(dǎo)致單位質(zhì)量的花色苷中的花青素含量降低。另一方面，花青素含量是通過(guò)pH差示法測(cè)定的，其依據(jù)是花色苷的發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變是環(huán)境pH的函數(shù)，而起干擾作用的褐色降解物顏色不隨pH值的變化而變化。在?；磻?yīng)過(guò)程中，可能會(huì)有部分花色苷發(fā)生降解并形成褐色降解物從而造成TAC降低。

a-?；龋籦-花青素含量圖3 越橘花色苷及改性花色苷的?；群突ㄇ嗨睾縁ig.3 AD and TAC of native and acylated anthocyanins注：不同大寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05)；不同小寫(xiě)字母代表差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.4 抗氧化活性分析

圖4反映了越橘花色苷在?；磻?yīng)前后DPPH自由基清除率和β-胡蘿卜素漂白抑制率的變化。如圖4-a所示，天然越橘花色苷的DPPH自由基清除率為73.5%，接枝酚酸后，該值分別上升至85.6%(Dh-An)和91.6%(Ga-An)。這是由于花色苷分子為DPPH自由基提供電子從而使其褪色，花色苷分子上的酚羥基是良好的電子供體，可以有效清除DPPH自由基。酚酸分子上也有酚羥基，同樣是良好的抗氧化劑，當(dāng)其接枝到花色苷分子上后極顯著(P<0.01)提高了越橘花色苷的抗氧化活性。另外，3,4-二羥基苯甲酸分子上有2個(gè)酚羥基，而沒(méi)食子酸分子上有3個(gè)酚羥基，因此可以觀察到Ga-An的DPPH自由基清除率高于Dh-An。

在β-胡蘿卜素漂白實(shí)驗(yàn)中，油酸在加熱過(guò)程中被氧化生成自由基并造成β-胡蘿卜素被漂白褪色?；ㄉ盏募尤肟梢杂行宄退岱磻?yīng)生成的自由基并抑制β-胡蘿卜素褪色[1-3]。由圖4-b可以觀察到，天然越橘花色苷的β-胡蘿卜素漂白抑制率為65.9%，接枝3,4-二羥基苯甲酸和沒(méi)食子酸后，該值分別上升至79.5%和84.8%。

a-DPPH自由基清除率；b-β-胡蘿卜素漂白抑制率圖4 越橘花色苷及改性花色苷的DPPH清除率和β-胡蘿卜素漂白抑制率Fig.4 DPPH clearance and inhibition ratio in β-carotene bleaching assay of native and acylated bilberry anthocyanins

2.5 花色苷穩(wěn)定性分析

花色苷以其優(yōu)異的抗氧化活性和鮮艷的顏色而聞名，它們?cè)诳諝庵泻苋菀妆谎趸妥兩?。圖5反映了在25 ℃的貯藏條件下，天然花色苷和改性花色苷溶液的褪色率變化。如圖5所示，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷溶液的褪色率不斷上升。顯然，氧化和水解破壞了越橘花色苷的分子結(jié)構(gòu)，生成無(wú)色的甲醇假堿和查爾酮，導(dǎo)致花色苷溶液不斷褪色。

圖5 越橘花色苷及改性花色苷的褪色率Fig.5 The fading degree of native and acylating anthocyanins

與天然越橘花色苷相比，經(jīng)酚酸修飾后的花色苷的褪色率較低，穩(wěn)定性提高。顯而易見(jiàn)，酚酸的接枝抑制了花色苷的氧化和分解。3,4-二羥基苯甲酸和沒(méi)食子酸對(duì)花色苷的保護(hù)作用可能體現(xiàn)在兩個(gè)方面。一方面，作為良好的抗氧化劑，3,4-二羥基苯甲酸和沒(méi)食子酸以其自身的氧化為代價(jià)阻止了花色苷被空氣中的氧氣氧化。由于沒(méi)食子酸的抗氧化能力強(qiáng)于3,4-二羥基苯甲酸，因此Ga-An的褪色率也要顯著(P<0.01)低于Dh-An。另一方面，3,4-二羥基苯甲酸和沒(méi)食子酸分子可能會(huì)堆積在在花青素的苯環(huán)上，阻礙了花色苷的水解，并抑制其構(gòu)型轉(zhuǎn)換及褪色。

3 結(jié)論

為了克服天然花色苷在應(yīng)用過(guò)程中易褪色的問(wèn)題，本文擬通過(guò)3,4-二羥基苯甲酸和沒(méi)食子酸對(duì)天然越橘花色苷進(jìn)行酶法修飾，以提高其穩(wěn)定性。UV-Vis、FTIR分析表明，在脂肪酶(Novozymes 435)的催化作用下，3,4-二羥基苯甲酸和沒(méi)食子酸可通過(guò)?；磻?yīng)接枝到越橘花色苷分子的糖基上。酚酸是良好的天然抗氧化劑，當(dāng)其接枝到花色苷上，大大提高了花色苷的抗氧化活性。酚酸抗氧化活性主要來(lái)自其分子上的酚羥基，每個(gè)3,4-二羥基苯甲酸分子上有2個(gè)酚羥基，而沒(méi)食子酸分子上有3個(gè)酚羥基，因此，Ga-An組的DPPH自由基清除能力和β-胡蘿卜素漂白抑制率要強(qiáng)于Dh-An組。除了抗氧化活性，?；ㄉ盏念伾€(wěn)定性也要顯著高于天然越橘花色苷。一方面，3,4-二羥基苯甲酸和沒(méi)食子酸通過(guò)自身被氧化為代價(jià)阻止了花色苷被空氣中的氧氣氧化。另一方面，酚酸分子可能會(huì)堆積在花青素的苯環(huán)上，阻礙了花色苷的水解，并抑制其褪色。