陜西省布魯氏菌菌株多位點(diǎn)序列分析研究

聶守民，羅波艷，孫養(yǎng)信，范鎖平，常文輝，孫 杰，安翠紅

布魯氏菌病(Brucellosis)簡(jiǎn)稱布病，是由布魯氏菌屬(Brucella)的細(xì)菌通過(guò)破損皮膚黏膜、吸入等方式侵入機(jī)體后引發(fā)的一種人獸共患的傳染病[1]。布魯氏菌病雖病死率不高但嚴(yán)重危害人民身體健康，同時(shí)嚴(yán)重影響畜牧業(yè)、旅游業(yè)、國(guó)際貿(mào)易的發(fā)展，還會(huì)帶來(lái)食品安全隱患。陜西省為國(guó)家劃定的布病一類(lèi)地區(qū)，人間布魯氏菌病發(fā)病水平常年居高不下，防控形勢(shì)不容樂(lè)觀[2]。

布魯氏菌的基因組較保守，對(duì)人間布魯氏菌病分離菌株進(jìn)行遺傳進(jìn)化特征分析，有利于掌握各菌株之間的親緣關(guān)系，從而制定科學(xué)有效的防控措施[3]。多位點(diǎn)序列分型(Multiple locus sequence typing，MLST)技術(shù)是一種以細(xì)菌的7個(gè)或以上的管家基因進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)比對(duì)核苷酸序列發(fā)現(xiàn)差異，達(dá)到區(qū)分細(xì)菌型別的目的[4-7]。MLST作為一種分子分型方法，其可操作性高，分辨能力高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，便于在不同的實(shí)驗(yàn)室之間進(jìn)行比較，從而廣泛的應(yīng)用于細(xì)菌型別和遺傳進(jìn)化特征的研究[8]。本研究通過(guò)MLST對(duì)陜西省自1958年至2020年分離的77株布魯氏菌菌株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，為更好的防控本省人間布魯氏菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 分離菌株信息 77株分離菌株系1958年、1973-1974年、1978年、2005年、2008年、2014-2020年分離自陜西省除漢中市外的9個(gè)地級(jí)市分別是西安市、咸陽(yáng)市、榆林市、延安市、渭南市、銅川市、寶雞市、安康市、商洛市。47株為羊種3型，10株羊種1型，7株羊種2型，10株羊種變異型，2株牛種生物型，1株豬種1型。菌株由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所鑒定和保存。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)參考菌株信息 羊種16M、牛種544A、豬種1330S由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所惠贈(zèng)，剩余13株標(biāo)準(zhǔn)參考菌株等位基因型結(jié)果來(lái)源于參考文獻(xiàn)[9]。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 生物安全柜，恒溫培養(yǎng)箱，高速離心機(jī)，PCR擴(kuò)增儀，水平電泳儀，凝膠成像儀，移液槍。

1.4 試劑耗材 核酸提取試劑盒；超純水；2×PCR擴(kuò)增混合液(2×TSINGKE Master Mix，北京擎科生物科技有限公司西安分公司)；瓊脂糖；5×TBE電泳緩沖液；DNA染料；DNA Marker(100 bp Plus DNA Ladder Marker，全式金生物技術(shù)有限公司)；96孔PCR板；Ep管；不同規(guī)格槍頭。

1.5 菌株核酸制備 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)將分離菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生物安全柜內(nèi)取10 μL菌落至裝有200 μL超純水的Ep管中混勻，蓋好管蓋必要時(shí)可用封口膜，放置于金屬浴中，80 ℃、1 h滅活，按照核酸提取試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行核酸提取。核酸提取結(jié)束后測(cè)定濃度(A260/A280)，-20 ℃低溫保存。

1.6 選擇MLST位點(diǎn) 本研究參考文獻(xiàn)[9]選擇9個(gè)布魯氏菌基因片段作為MLST的靶標(biāo)基因：7個(gè)管家基因(gap：3-磷酸甘油醛酸脫氫酶、aroA：3-磷酸莽草酸羧乙烯基轉(zhuǎn)移酶、gyrB：DNA促旋酶B亞基、glk：葡萄糖激酶、trpE：鄰氨基苯甲酸合成酶、dnaK：伴侶蛋白、cobQ：鈷啉胺酸合成酶)、1個(gè)基因間區(qū)(int-hyp：假設(shè)蛋白基因間區(qū))、1個(gè)外膜蛋白基因(omp25：外膜蛋白25)。

1.7 合成引物 根據(jù)9個(gè)基因片段的序列(表1)由北京擎科生物科技有限公司西安分公司進(jìn)行引物合成。

表1 MLST引物名稱、序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

1.8 PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增體系30 μL：2×PCR擴(kuò)增混合液15 μL、10 μmol/L引物各1 μL、核酸模板1 μL、超純水12 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性(95 ℃5 min)；變性-退火-延伸(95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán))；延伸(72 ℃ 10 min)。

1.9 擴(kuò)增產(chǎn)物分析與測(cè)序 擴(kuò)增結(jié)束后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增是否成功。擴(kuò)增出特異性條帶的產(chǎn)物直接送北京擎科生物科技有限公司西安分公司進(jìn)行雙向測(cè)序，獲得拼接序列。

1.10 序列比對(duì)分析 將9個(gè)布魯氏菌基因片段的拼接序列分別與MLST的標(biāo)準(zhǔn)等位基因序列進(jìn)行比對(duì)(https://pubmlst.org/organisms/brucella-spp/)，確定分離菌株的ST型。利用BioNumerics(Version7.6)軟件，通過(guò)UPGMA(平均連鎖聚類(lèi)法)對(duì)分離菌株進(jìn)行分析，用最小生成樹(shù)(Minimum spanning tree)進(jìn)行高級(jí)聚類(lèi)分析，探討其進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 生物型別 共檢測(cè)77株布魯氏菌，包括羊種1型10株，羊種2型7株，羊種3型47株，羊種變異型10株，牛種生物型2株，豬種1型1株，其中羊種3型最多，占61.04%。1958-2008年，19株布魯氏菌生物型多樣，其中羊種3型僅3株，占15.79%；2014-2020年，58株布魯氏菌中羊種3型有44株，占75.86%(表2、表3)。

表2 陜西省77株分離菌株時(shí)間分布情況

表3 陜西省77株分離菌株地區(qū)分布情況

2.2 ST比對(duì)結(jié)果 77株分離菌株比對(duì)出現(xiàn)3種ST型，分別為ST2、ST8、ST14。1958年和2005年各有1株牛種生物型菌株(58055、05045)結(jié)果為ST2型，1974年1株豬種1型菌株(74012)鑒定為ST14型；其余羊種菌株比對(duì)結(jié)果均為ST8型，占96.10%。2014-2020年，58株羊種布魯氏菌均為ST8型(表2)。

表4 陜西省77株布魯氏菌分離株MLST結(jié)果

2.3 BioNumerics分析結(jié)果 利用BioNumerics(Version7.6)軟件，構(gòu)建聚類(lèi)圖及最小生成樹(shù)，77株菌形成3個(gè)分支，ST14為1支，ST2為1支，ST8為1支，不同ST型的標(biāo)準(zhǔn)株各自形成1支。最小生成樹(shù)顯示本研究的74株布魯氏菌分離株(羊種1型、2型、3型、變異型)與標(biāo)準(zhǔn)株63/9(羊種2型)的ST型一致，聚為一簇，同種群布魯氏菌親緣關(guān)系較近，聚為一簇，說(shuō)明ST型與布魯氏菌生物種型具有一定相關(guān)性。ST型與布魯氏菌傳統(tǒng)分型結(jié)果稍有差異，但總體上基本一致(圖1、圖2)。

圖1 陜西省77株布魯氏菌分離株MLST聚類(lèi)分析

圖2 陜西省77株布魯氏菌分離株MST分析

3 討 論

陜西省屬于國(guó)家劃定的布魯氏菌病一類(lèi)地區(qū)，上世紀(jì)50年代曾在我省廣泛流行，疫情嚴(yán)重地區(qū)人畜感染率達(dá)50%。20世紀(jì)80—90年代，由于加大防控力度，疫情降至歷史最低水平。近年來(lái)，隨著奶山羊、肉羊產(chǎn)業(yè)的大力發(fā)展，家畜飼養(yǎng)量不斷增加，動(dòng)物及其產(chǎn)品流通頻繁等因素的影響，人間布魯氏菌病的發(fā)病數(shù)量不斷上升。布病不僅嚴(yán)重阻礙畜牧業(yè)發(fā)展，也危及到人民身體健康和公共衛(wèi)生安全，我省的防控形勢(shì)越來(lái)越嚴(yán)峻。

對(duì)布魯氏菌分離株進(jìn)行生物種型鑒定、分子分型研究、遺傳進(jìn)化特征分析等可以更好地了解流行菌株之間的關(guān)聯(lián)，為合理有效的防控人間布魯氏菌病提供科學(xué)依據(jù)。布魯氏菌種型鑒定依靠的是血清凝集技術(shù)，該技術(shù)不但要求操作者要有豐富的經(jīng)驗(yàn)還對(duì)實(shí)驗(yàn)生物安全有很大的要求。而多位點(diǎn)序列分型(Multiple locus sequence typing，MLST)就克服了以上的不足，它是一種很好地分子分型研究及遺傳進(jìn)化分析的技術(shù)，是以測(cè)序?yàn)榧夹g(shù)基礎(chǔ)，分辨能力高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好[10-11]。MLST自1998年首次被提出來(lái)以后[12]，基于以上優(yōu)勢(shì)在病原微生物領(lǐng)域得到了快速發(fā)展。Adrian等[9]利用MLST技術(shù)研究了30個(gè)不同國(guó)家的160株菌發(fā)現(xiàn)了27個(gè)ST型，國(guó)內(nèi)新疆、內(nèi)蒙古等也分別利用該技術(shù)對(duì)本地區(qū)的布魯氏菌分離株進(jìn)行了研究[13-16]。本研究對(duì)了解陜西省布魯氏菌分離株的遺傳進(jìn)化特征具有重要意義。

陜西省的布魯氏菌分離株生物種型有羊種3型、羊種1型、羊種2型、羊種變異型、牛種生物型、豬種1型，羊種3型構(gòu)成比為61.04%，2005-2020年羊種3型是主要流行菌株；ST型別包括ST2、ST8、ST14，ST8型構(gòu)成比為96.10%，說(shuō)明ST8型是我省主要的流行菌株序列型。羊種生物型分離菌株的ST型均為ST8，說(shuō)明羊種生物型菌株MLST分型比較穩(wěn)定。2株ST2分別于1958、2005年從綏德、橫山人血中分離到，2株菌的分離時(shí)間前后相差47年，1株ST14型的豬種1型布魯氏菌于1972年從鄠邑鹿血中分離得到，自此也未再發(fā)現(xiàn)。說(shuō)明MLST能夠很好的將不同種的布魯氏菌進(jìn)行區(qū)分，結(jié)果可靠。1958年、1973-1979年2個(gè)時(shí)間段內(nèi)分離得到15株布魯氏菌，為羊種1型6株、羊種2型7株、豬種1型1株、牛種生物型1株，未分離到羊種3型，ST型結(jié)果為ST2、ST8(86.67%)、ST14。2005-2008年、2014-2020年兩個(gè)時(shí)間段內(nèi)分離得到62株布魯氏菌為羊種1型4株、羊種3型47株、羊種變異型10株、牛種生物型1株、ST型結(jié)果為ST2、ST8(占98.39%)。后兩個(gè)時(shí)間段內(nèi)未再出現(xiàn)豬種1型及羊種2型，在今后人間布病的防控工作中應(yīng)予以關(guān)注。

本研究建立了陜西省布魯氏菌MLST序列數(shù)據(jù)庫(kù)，為下一步做好布魯氏菌病的防控提供了科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：無(wú)