高效液相色譜法測(cè)定小麥粉中玉米赤霉烯酮的不確定度評(píng)定

◎ 趙 飛

（遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，遼寧 沈陽(yáng) 110000）

測(cè)量不確定度評(píng)定是按照實(shí)際檢測(cè)過(guò)程和相關(guān)信息對(duì)檢測(cè)結(jié)果的分散性進(jìn)行評(píng)估的一種方式[1]。測(cè)量不確定度可以客觀的評(píng)價(jià)檢測(cè)數(shù)據(jù)，尤其是當(dāng)檢測(cè)數(shù)據(jù)處于臨界值時(shí)，進(jìn)行不確定度評(píng)定可以保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[2]。

玉米赤霉烯酮，又稱F-2毒素，是玉米赤霉菌的代謝產(chǎn)物[3-4]。玉米赤霉烯酮易污染玉米、小麥等谷物，尤其是當(dāng)這些谷物儲(chǔ)存不當(dāng)時(shí)更易被污染[5]。它對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、腎臟等有毒害作用。因此本文嚴(yán)格按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定》（GB 5009.209—2016）[6]操作，對(duì)其檢測(cè)結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)估，為實(shí)驗(yàn)室出具的玉米赤霉烯酮檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）、ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，0.5 μm，美國(guó)安捷倫公司）、BSA224S-CW電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）、GM200高速粉碎機(jī)（德國(guó)萊馳公司）、FJ300-SH均質(zhì)器（德國(guó)IKA公司）、TTL-DCII氮吹儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）、X1R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Thermo公司）。

乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水，均為一級(jí)水；玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（濃度為100.2 μg·mL-1，ROMER公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確吸取1.0 mL玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋配制成濃度為1.02 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存。用70%乙腈溶液將上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為10 ng·mL-1、25 ng·mL-1、50 ng·mL-1、75 ng·mL-1和100 ng·mL-1，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液臨用現(xiàn)配。

1.2.2 液相色譜參考條件

色 譜 柱：ZORBAX SB-C18色 譜 柱（4.6 mm×150 mm，0.5 μm）；流動(dòng)相：乙腈∶水=70∶30（v/v）；流速：0.7 mL·min-1；柱溫：30 ℃；激發(fā)波長(zhǎng)：274 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：440 nm；進(jìn)樣體積：100 μL。

1.2.3 樣品前處理

稱取40 g試樣（精確至0.1 g）于均質(zhì)杯中，加入4 g氯化鈉、100 mL提取液，高速攪拌提取2 min，過(guò)濾。移取10 mL濾液于40 mL水中，經(jīng)玻璃纖維濾紙過(guò)濾至澄清；準(zhǔn)確移取10 mL上述濾液至免疫親和柱上，直至有部分空氣進(jìn)入，用5 mL水淋洗柱子一次，再準(zhǔn)確加入1.5 mL甲醇洗脫，流速為1滴/s。收集洗脫液于玻璃試管中，55 ℃下氮?dú)獯蹈?，?.0 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，過(guò)膜待測(cè)。

1.2.4 數(shù)學(xué)模型的建立

樣品中玉米赤霉烯酮的含量按式（1）計(jì)算。

式中，ω-樣品中玉米赤霉烯酮的含量，μg·kg-1；ρ-由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣品溶液中玉米赤霉烯酮的濃度，ng·mL-1；ρ0-空白溶液中玉米赤霉烯酮的濃度，ng·mL-1；V-樣品定容體積，mL；c-系數(shù)；A-試樣溶液中玉米赤霉烯酮的色譜峰面積；AS-標(biāo)準(zhǔn)溶液中玉米赤霉烯酮的色譜峰面積；m-稱樣量，g；P-加標(biāo)樣品回收率。

2 標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評(píng)定

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度ur(s)

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度ur(c1)

通過(guò)查看玉米赤霉烯酮的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，得到該標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)不確定度U=0.2%，k=2，則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的不確定度ur(c2)

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制中用到1 mL的A級(jí)單標(biāo)線吸量管、10 mL容量瓶，允許誤差分別為±0.008 mL、±0.020 mL，按照均勻分布考慮，取則吸量管和容量瓶引入的不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制室的溫度通?？刂圃冢?0±5）℃，20 ℃下乙腈的膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1，由實(shí)驗(yàn)室溫度變化引起體積變化的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜上，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制過(guò)程引入的不確定度為：

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的不確定度ur(c3)

標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程中各分量的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程引入的不確定度表

根據(jù)各分量，標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度ur(c4)

本方法對(duì)濃度依次為10 ng·mL-1、25 ng·mL-1、50 ng·mL-1、75 ng·mL-1和100 ng·mL-1的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以響應(yīng)值峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，校準(zhǔn)曲線方程見表2，并對(duì)陰性樣品加標(biāo)進(jìn)行6次平行測(cè)定，測(cè)得結(jié)果分別為52.0 ng·mL-1、52.6 ng·mL-1、53.2 ng·mL-1、53.3 ng·mL-1、53.0 ng·mL-1和52.8 ng·mL-1，平均值為52.8 ng·mL-1，由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度可由式（2）計(jì)算。

表2 碘化鉀飽和溶液的放置時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響表

表2 玉米赤霉烯酮校準(zhǔn)曲線表

式中，ur(c4)-曲線擬合引入的不確定度；S(A)-標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)物質(zhì)信號(hào)殘差的標(biāo)準(zhǔn)差；b-校準(zhǔn)曲線的斜率；p-樣品溶液檢測(cè)次數(shù)（6次）；n-標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)（5次）；c0-校準(zhǔn)曲線校正后待測(cè)樣品中玉米赤霉烯酮濃度的平均值，ng·mL-1；ci-標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)玉米赤霉烯酮濃度理論值，ng·mL-1；標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)玉米赤霉烯酮濃度的平均值，ng·mL-1。

其中，S(A)可按公式（3）計(jì)算。

式中，n-校準(zhǔn)曲線的點(diǎn)數(shù)；Ai-標(biāo)準(zhǔn)溶液各濃度點(diǎn)的峰面積；A-根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的理論峰面積。

由校準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur(c4)=0.001 88。

綜上，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

2.2 樣品稱量引入的不確定度ur(m)

采用分度為0.1 g的天平稱量待測(cè)樣品，該天平在0～50 g稱量范圍內(nèi)的最大允許誤差為±0.05 g，樣品稱量過(guò)程引入的相對(duì)不確定度為：

2.3 樣品前處理引入的不確定度ur(V)

樣品前處理過(guò)程中采用100 mL量筒，其容量允差為±1.0 mL，在（20±5）℃條件下，由此引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

移取10 mL提取液的濾液，并加入40 mL水稀釋混勻，10 mL單標(biāo)線吸量管和50 mL刻度吸量管的容量允差為±0.020 mL、±0.10 mL，稀釋過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

準(zhǔn)確移取10 mL濾液至免疫親和柱上凈化，最后用1.0 mL流動(dòng)相復(fù)溶，10 mL和1 mL單標(biāo)線吸量管的容量允差為±0.020 mL、±0.007 mL，稀釋過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

該過(guò)程引入的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 重復(fù)性引入的不確定度ur(R)

開展加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，添加量為70.0 μg·kg-1，測(cè)定值分別為65.0 μg·kg-1、65.7 μg·kg-1、66.5 μg·kg-1、66.6 μg·kg-1、66.2 μg·kg-1和66.0 μg·kg-1，平均值為66.0 μg·kg-1。按照A類評(píng)定，應(yīng)用貝塞爾公式計(jì)算，待測(cè)物的實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.590，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.5 回收率引入的不確定度ur(P)

向不含玉米赤霉烯酮的小麥粉中加標(biāo)，添加量為70.0 μg·kg-1，通過(guò)前處理并檢測(cè)計(jì)算，得回收率分別為92.9%、93.9%、95.0%、95.1%、94.6%和94.3%，平均值為94.3%，按照A類評(píng)定應(yīng)用貝塞爾公式計(jì)算待測(cè)物的實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.843%，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

用t來(lái)檢驗(yàn)確定平均回收率是否與1有顯著差異，當(dāng)n=6，自由度為5時(shí)，在置信概率為95%時(shí)，t0.95(5)=2.571，該回收率下即t＞2.571，需要用回收率對(duì)結(jié)果進(jìn)行修正?；厥章室氲南鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3 合成不確定度

采用本方法檢測(cè)小麥粉中玉米赤霉烯酮的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

玉米赤霉烯酮的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4 擴(kuò)展不確定度的計(jì)算和檢測(cè)結(jié)果的表示

在95%置信概率下，擴(kuò)展因子k=2，則采用本方法檢測(cè)小麥粉中玉米赤霉烯酮的擴(kuò)展不確定度為U95=k×ur(x)=3.60 μg·kg-1，小麥粉中玉米赤霉烯酮的檢測(cè)結(jié)果表示為（66.0±3.60）μg·kg-1；k=2。

5 結(jié)論

采用食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定小麥粉中玉米赤霉烯酮含量，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)定。通過(guò)評(píng)定，該實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程引入的不確定度貢獻(xiàn)最大。因此，在實(shí)驗(yàn)室采用該方法開展玉米赤霉烯酮檢測(cè)時(shí)，要注意選用合適的量具，并定期開展檢定校準(zhǔn)，嚴(yán)格控制標(biāo)準(zhǔn)溶液配制室溫度，切實(shí)減小不確定度分量，保證檢測(cè)數(shù)據(jù)的科學(xué)性和合理性。