巨鹿杏中β-胡蘿卜素的HPLC分析及多地域杏果中含量比對(duì)

◎ 劉崢顥，龐艷蘋，楊麗萍

（1.河北大學(xué) 質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督學(xué)院，河北 保定 071002；2.保定市供水公司，河北 保定 071002）

類胡蘿卜素廣泛存在于植物性食品尤其是深色蔬菜水果中，其中最重要的是β-胡蘿卜素。β-胡蘿卜素屬四萜類化合物，是維生素A的前體[1]。維生素A是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)人的生長發(fā)育、新陳代謝都起著非常重要的作用[2]。亞洲人飲食中有65%～85%的維生素A來自β-胡蘿卜素。與維生素A不同，攝入大劑量的β-胡蘿卜素在體內(nèi)不會(huì)蓄積中毒。研究表明，β-胡蘿卜素具有預(yù)防多種腫瘤和心血管等疾病的作用，有利于提高機(jī)體免疫機(jī)能、抗衰老，尤其是對(duì)降低腫瘤發(fā)生率有顯著效果，因此對(duì)一些食物中的β-胡蘿卜素含量進(jìn)行研究，有助于人們對(duì)食物進(jìn)行選擇，從而提高人們的健康水平。

從國內(nèi)外研究結(jié)果分析，與其他食物相比，杏果肉含有豐富的β-胡蘿卜素[3]，因此可以將杏中β-胡蘿卜素的含量作為杏營養(yǎng)價(jià)值的參考指標(biāo)。

巨鹿縣位于河北省南部，屬溫帶半干旱、半濕潤大陸季風(fēng)區(qū)。平均日照時(shí)數(shù)2 767.4 h，四季分明，光熱充沛，氣溫適中，雨熱同季，適宜杏樹的生長。巨鹿縣杏產(chǎn)業(yè)自1986年起步以來，已成為巨鹿縣最大的支柱產(chǎn)業(yè)[4]。

目前，對(duì)食品中β-胡蘿卜素含量的測定方法主要有紙層析法[1]、薄層層析-分光光度法[5]、紫外分光光度法[6]、高效液相色譜法[7]等。其中，紙層析法比較煩瑣，分析時(shí)間長；薄層層析法與紫外分光光度法分別以不同方法對(duì)樣品中的β-胡蘿卜素進(jìn)行提取和分離，然后根據(jù)分光光度法對(duì)β-胡蘿卜素進(jìn)行定量測定，過程復(fù)雜；高效液相色譜法則以其快速、簡便、靈活、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，逐步廣泛的應(yīng)用于胡蘿卜素的研究分析中[8]。本文在國家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對(duì)β-胡蘿卜素的提取與檢測步驟進(jìn)行了簡化與改進(jìn)，并對(duì)各產(chǎn)地的杏中β-胡蘿卜素的含量進(jìn)行比對(duì)，以確定巨鹿杏與其他杏中β-胡蘿卜素含量的差異性，為巨鹿杏的質(zhì)量特征因子分析和品質(zhì)保證以及質(zhì)量特征體系的建立提供理論依據(jù)，凈化市場，維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

杏樣品選用色澤橙黃、無腐蝕及病變的成熟果實(shí)，其中JL-ST-DHX的為大紅杏，其余杏品種全部為串枝紅杏。杏樣品的產(chǎn)地、品種與代號(hào)見表1。

表1 杏的代號(hào)與產(chǎn)地表

1.1.2 試劑

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)），甲醇（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）、石油醚（沸程30～60 ℃）、丙酮（分析純）、NaCl（分析純）均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器和設(shè)備

島津LC-10AT高效液相色譜儀；島津SPD-15C紫外-可見檢測器；色譜柱為Agilent XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）不銹鋼柱；KQ-500 DE型數(shù)控超聲波清洗器（山東省昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16G飛鴿牌系列離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取5.00 mgβ-胡蘿卜素，用少量氯仿溶解，石油醚定容至100 mL，再從中取1 mL定容至10 mL，所得到的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)濃度為5.0 μg·mL-1。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL和8 mL，定容至10 mL，分別得到濃度為0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、3.0 μg·mL-1和4.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品的前處理

選取同一產(chǎn)地的杏3個(gè)，在每個(gè)杏上均勻選取3個(gè)點(diǎn)切割稱量，準(zhǔn)確稱量4.0 g。將稱量好的樣品移至研缽中，加入石油醚研磨。待研磨液呈黃色后，將提取液轉(zhuǎn)入100 mL左右燒杯中，再向研缽中加入丙酮，按石油醚同樣的方法研磨提取，并將提取液一并轉(zhuǎn)入上述燒杯中。如此用石油醚、丙酮交替提取至杏肉無色，合并所有杏肉及提取液，轉(zhuǎn)入離心管中，以12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心20 min。離心停止后，將離心管中的上層液體轉(zhuǎn)入加有飽和食鹽水的分液漏斗中，并用丙酮清洗內(nèi)壁附有無色果肉的離心管，確保上層清夜全部轉(zhuǎn)入分液漏斗，與上述提取液合并。將分液漏斗中的液體搖勻，避光靜置。待液體分層明顯，將下層水溶液放入另一分液漏斗中再提取，上層液體轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，并用吸管吸取丙酮對(duì)上述分液漏斗進(jìn)行清洗，如此反復(fù)直至提取液無色為止。合并所有提取液于上述25 mL容量瓶中，定容后，進(jìn)行高效液相色譜分析（HPLC）。

1.2.3 高效液相色譜條件

流動(dòng)相為甲醇-乙酸乙酯（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：448 nm；紙速：2 mm·min-1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量為7.5 μL，這樣可以實(shí)現(xiàn)待測組分的良好分離[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)4.5 μm濾膜過濾，濃度由小到大依次進(jìn)樣，以7.5 μL為進(jìn)樣量進(jìn)行高效液相色譜分析。以β-胡蘿卜素含量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=98 200X+8 373.8，r=0.999 8，線性范圍為0.5～4.0 μg·mL-1。采用保留時(shí)間對(duì)照法和標(biāo)準(zhǔn)追加法確定β-胡蘿卜素峰的位置，由此可實(shí)現(xiàn)β-胡蘿卜素峰的分離與識(shí)別，具體見圖1。

從圖1中可以看出，β-胡蘿卜素的出峰時(shí)間在6～7 min，峰結(jié)束時(shí)間為7～8 min。

圖1 β-胡蘿卜素液相色譜分離圖

2.2 方法的回收率

準(zhǔn)確稱取某一產(chǎn)地的杏20.0 g，將其研磨碎并混合均勻；將此樣品平均分成5份，每份質(zhì)量相等。分別加入0 μg、20 μg、40 μg、80 μg和100 μg的β-胡蘿卜素，按2.1.3進(jìn)行提取、定容，測定β-胡蘿卜素的回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，β-胡蘿卜素的平均回收率為99.22%，變異系數(shù)為5.17%，表明該方法有較高的準(zhǔn)確度，能夠滿足分析要求。

2.3 方法的精密度

準(zhǔn)確稱取某一產(chǎn)地的杏4.0 g，按1.2.2進(jìn)行提取，定容。以7.5 μL的進(jìn)樣量進(jìn)樣5次，進(jìn)行精密度分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，5次β-胡蘿卜素測定結(jié)果的平均值為63.22 μg，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.03%，變異系數(shù)為3.2%，表明儀器精密度良好。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)表

2.4 方法的穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱取某一產(chǎn)地的杏4.0 g，按2.1.3進(jìn)行提取，定容。分別以0.5 h、1 h、2 h、8 h、24 h、48 h的時(shí)間間隔進(jìn)樣7次，進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表4可知，檢測樣品在48 h內(nèi)β-胡蘿卜素含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.33，表明檢測樣品在48 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表

2.5 杏中β-胡蘿卜素含量的測定結(jié)果與分析

分別準(zhǔn)確稱取9種不同型號(hào)的杏各4.0 g。按1.2.2進(jìn)行提取，定容。以7.5 μL為進(jìn)樣量，對(duì)杏提取液進(jìn)行高效液相色譜分析。根據(jù)所測定的β-胡蘿卜素的峰面積，及標(biāo)準(zhǔn)品所得的回歸方程計(jì)算出各個(gè)產(chǎn)地杏中β-胡蘿卜素的含量，結(jié)果見表5。

表5 各產(chǎn)地杏中β-胡蘿卜素含量的測定表

續(xù)表5

由以上分析可得，在所研究的幾個(gè)產(chǎn)地的杏中，來自巨鹿上疃村城關(guān)鎮(zhèn)的大紅杏，其β-胡蘿卜素含量最低，平均值為3.52 μg·g-1；β-胡蘿卜素含量最高的產(chǎn)地為巨鹿棘園紅休閑觀光采摘園，其平均值為20.89 μg·g-1，約為大紅杏含量的6倍；而巨鹿縣其他產(chǎn)地中，β-胡蘿卜素含量相對(duì)較高，分別達(dá)到大紅杏的4.58倍、4.67倍；巨鹿縣以外的產(chǎn)地中，β-胡蘿卜素含量最高的是滿城城郊，其含量達(dá)到大紅杏的4.81倍，而其余產(chǎn)地，β-胡蘿卜素含量分別為大紅杏的3.88倍、3.42倍、3.06倍、3.09倍，含量較低。

2.6 聚類分析法

對(duì)測試樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，如圖2所示，得到較好的分類結(jié)果。當(dāng)距離為25時(shí)，可將不同產(chǎn)地的杏分為2類，巨鹿大紅杏聚為1類，串枝紅杏聚為1類，表明以β-胡蘿卜素含量為原始變量可以較好的區(qū)分大紅杏和串枝紅杏這兩個(gè)品種。當(dāng)距離較小時(shí)，巨鹿其他采集點(diǎn)的杏聚為2類，其他產(chǎn)地滿城、易縣、淶水、房山聚為2類，表明巨鹿杏和其他產(chǎn)地杏有較好的區(qū)分度，但由于產(chǎn)地相近，個(gè)別產(chǎn)地聚類出現(xiàn)偏差，尤其是非巨鹿杏產(chǎn)地低區(qū)分度不高。

圖2 巨鹿杏與其他地域杏中β-胡蘿卜素含量聚類分析樹狀圖

3 結(jié)論

本研究利用高效液相色譜法對(duì)幾個(gè)產(chǎn)地杏中β-胡蘿卜素含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明，以石油醚和丙酮為提取劑，對(duì)樣品進(jìn)行多次研磨而后經(jīng)過離心、分液可以對(duì)杏中的β-胡蘿卜素進(jìn)行很好的提取和分離；測量結(jié)果的平均回收率為99.22%，穩(wěn)定性為2.14%，精密度也可達(dá)到3.20%。綜上所述，此方法具有較高的回收率，同時(shí)也具有較好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。與其他方法相比，此法大大縮短了樣品的處理時(shí)間，簡化了處理步驟，提高了測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

通過對(duì)河北省邢臺(tái)市巨鹿縣縣內(nèi)主要杏品種的研究，并與保定滿城、易縣、淶水以及北京房山的杏進(jìn)行比對(duì)后可以看出，巨鹿杏中除大紅杏以外，其他品種（串枝紅杏）β-胡蘿卜素含量相對(duì)較高；巨鹿上疃村城關(guān)鎮(zhèn)（巨鹿鎮(zhèn)）的大紅杏，在各產(chǎn)地中β-胡蘿卜素含量最低，但其β-胡蘿卜素含量穩(wěn)定，范圍為3.07～4.08 μg·g-1，平均值為3.52 μg·g-1；巨鹿棘園紅休閑觀光采摘園的杏中β-胡蘿卜素含量較高且較穩(wěn)定，其含量值在19.73～22.04 μg·g-1，平均值達(dá)到大紅杏的6倍；巨鹿上疃村城關(guān)鎮(zhèn)（巨鹿鎮(zhèn)）的杏中，β-胡蘿卜素含量雖不穩(wěn)定，但存在β-胡蘿卜素含量較高者，其含量達(dá)到25.42 μg·g-1，位居各產(chǎn)地含量之首，因此β-胡蘿卜素含量可以作為研究巨鹿杏的特征值之一，通過聚類分析法獲得較好的結(jié)果。

本研究對(duì)β-胡蘿卜素的提取和測量方法進(jìn)行了改進(jìn)，為杏中β-胡蘿卜素含量快速測定及巨鹿杏的品質(zhì)特征性研究提供了理論依據(jù)，對(duì)杏品質(zhì)保真研究和質(zhì)量保證具有較高的應(yīng)用價(jià)值和極大的現(xiàn)實(shí)意義。