植物油中多環(huán)芳烴的測定及方法驗證
——高效液相色譜法（熒光檢測器）

◎ 李 超，趙雪峰，陶 燕，曹靜杰，賈松濤，郭倩倩，李夢雨，趙林萍

（河南中標(biāo)檢測服務(wù)有限公司，河南 鄭州 450001）

植物脂肪是人類飲食的重要組成部分，是能量和必需脂肪酸的來源，也是脂溶性維生素的載體。油籽、植物油和脂肪制品等脂肪含量高的食物易受多環(huán)芳烴（PAHs）的污染，多環(huán)芳烴具有親脂性，因此在動植物的脂肪細(xì)胞中易于積累。植物油可能會被多環(huán)芳烴污染，如在油品加工過程使用了被污染的萃取溶劑。在一定程度上，油品的污染還可能與環(huán)境污染有關(guān)。在大氣存在多環(huán)芳烴污染的情況下，由于降水，植物在生長季節(jié)可能發(fā)生表面污染，這種污染可能會被轉(zhuǎn)移到最終產(chǎn)品中。許多研究人員發(fā)現(xiàn)，同一種油在不同生產(chǎn)批次中的多環(huán)芳烴含量存在顯著差異[1-2]。

世界衛(wèi)生組織國際化學(xué)品安全規(guī)劃署（IPCS）、歐盟委員會糧食科學(xué)委員會以及糧農(nóng)組織/世衛(wèi)組織食品添加劑專家委員會分別于1998年、2002年和2005年對多環(huán)芳烴進行了評估。國際癌癥研究機構(gòu)將苯并（a）芘歸為第一類致癌物，而將苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽和歸為2B類致癌物（可能對人類致癌的化合物）[3]。

近年來，植物油受到越來越多的消費者青睞，各種菜籽油、葵花籽油、大豆和橄欖油及其混合物產(chǎn)品出現(xiàn)在市場上。研究者越來越關(guān)注對多環(huán)芳烴遺傳毒性、誘變性和致癌性進行研究，為保障食品安全，需要不斷監(jiān)測食品中多環(huán)芳烴的含量，以持續(xù)監(jiān)測安全風(fēng)險。

本文對高效液相色譜法測定多種多環(huán)芳烴的方法進行驗證，進而研究了市場上不同種類植物油中多環(huán)芳烴的污染程度，包括苯并（a）芘（BaP）、苯并（a）蒽（BaA）、苯并（b）熒蒽（BbFA）和?（CHR）等化合物含量的總和，為國家相關(guān)部門制定這些污染物質(zhì)在食品中的限量值提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑和樣品

乙腈、環(huán)己烷、石油醚、甲醇，均為色譜純；氯化鈉、氫氧化鉀、無水亞硫酸鈉（分析純）；符合實驗室用水標(biāo)準(zhǔn)中的一級水；氮氣；中性氧化鋁凈化柱；多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)混合溶液；質(zhì)控樣為橄欖油CRM。

市售的30種菜籽油樣品、10種葵花籽油樣品和12種其他油樣品包括油橄欖果渣油、橄欖油菜籽油調(diào)和油、大豆油以及椰子油。菜籽油樣本包括普通精制成品油、精制初榨菜籽油和冷過濾精制初榨菜籽油，分別為國產(chǎn)（12個樣品）和進口（18個樣品）。分析前，樣品根據(jù)生產(chǎn)廠家的建議進行存儲。液體樣品于室溫放置2 h，固體樣品置于60 ℃水浴中融化。

1.2 儀器與設(shè)備

戴安UltiMate 3000高效液相色譜儀（配熒光檢測器）；PAH C18反相鍵合固定相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

2 分析步驟

2.1 樣品凈化

為了使多環(huán)芳烴萃取物的純度足夠用于色譜分析，采用氧化鋁填充玻璃柱進行純化。將氧化鋁與水的混合物（9∶1，w/w）倒入裝有多孔玻璃的玻璃柱中，在氧化鋁填料上填充無水亞硫酸鈉干燥劑。通過石油醚對凈化柱進行調(diào)節(jié)后，用10 mL石油醚稀釋0.4 g的油脂樣品，將樣品移入氧化鋁柱中，用60 mL石油醚洗脫樣品，流速為1 mL·min-1，棄去最初的20 mL石油醚，收集余下流出物。流出物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，氮吹除去溶劑至近干，用乙腈定容至1 mL，混勻，過0.22 μm有機相微孔濾膜，待色譜儀檢測。

2.2 高效液相色譜分析

用自動進樣器將20 μL樣品注入高效液相色譜中。柱溫保持在35 ℃，流動相為乙腈和水。梯度洗脫時間見表1，流速為1 mL·min-1。激發(fā)和發(fā)射（Ex/Em）波長：BaA和CHR為260 nm/420 nm、BbFA和BaP為290 nm/430 nm。

表1 梯度洗脫時間表

2.3 校準(zhǔn)曲線的制備

采用外標(biāo)法建立校準(zhǔn)曲線。使用多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)混合溶液配制標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，濃度為10 ng·mL-1，分別吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，經(jīng)稀釋后配制成濃 度 點 為0.20 ng·mL-1、0.80 ng·mL-1、4.00 ng·mL-1、8.00 ng·mL-1及10.00 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 樣品分析

質(zhì)量控制過程包括對盲樣和作為質(zhì)控樣的有證標(biāo)準(zhǔn)樣品進行檢測。

3 統(tǒng)計分析

3.1 測定方法的線性工作范圍

對每條多環(huán)芳烴校準(zhǔn)曲線計算濃度限度的變異系數(shù)，然后在0.05顯著水平下使用F-Snedecor檢驗對變異系數(shù)進行檢驗，同時計算相關(guān)系數(shù)。檢出限（LOD）和定量限（LOQ）的計算公式如式（1）和式（2）所示。該方法的靈敏度以校準(zhǔn)曲線的斜率為準(zhǔn)。

式中：Cm-低濃度樣本中多環(huán)芳烴的平均濃度；SD-標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3.2 統(tǒng)計結(jié)果分析

驗證過程中得到的結(jié)果通過Dixon Q檢驗進行識別和剔除異常值，然后對每個多環(huán)芳烴濃度計算下列統(tǒng)計參數(shù)，包括重現(xiàn)因子（正確性）、方差、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴展不確定度、重復(fù)性的置信區(qū)間和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

4 結(jié)果與討論

檢出限（LOD）、定量限（LOQ）和回收率均符合國家標(biāo)準(zhǔn)《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》（GB/T 27417—2017），在0.20～10.00 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，各物質(zhì)的校準(zhǔn)曲線均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.998。這些曲線用于檢驗該方法在0.80 ng·mL-1和8.00 ng·mL-1兩種濃度下的重現(xiàn)性和精密度。相關(guān)測定結(jié)果見表2。根據(jù)表2可以看出該方法適用于測定植物油中4種多環(huán)芳烴含量總和。

表2 方法驗證參數(shù)和評價標(biāo)準(zhǔn)表

標(biāo)準(zhǔn)混合溶液和菜籽油中多環(huán)芳烴的色譜圖分別見圖1和圖2。

圖1 多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)混合溶液色譜圖

圖2 菜籽油中多環(huán)芳烴的色譜圖

菜籽油中測定的苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽、?以及這4種多環(huán)芳烴的含量總和見表3，苯并（a）芘、苯并（a）蒽、?和苯并（b）熒蒽的回收率分別在80%～103%、87%～109%、87%～108%和91%～110%范圍內(nèi)。精制菜籽油中4種多環(huán)芳烴的含量最大值為1.30～2.40 μg·kg-1，精制初榨菜籽油中4種多環(huán)芳烴的含量最大值為1.10～1.95 μg·kg-1，考慮到不確定度，含量差別并不大。冷過濾精制初榨菜籽油中苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽和的含量均低于1 μg·kg-1，4種PAHs含量之和（2.91±0.58） μg·kg-1也顯著低于精制菜籽油和精制初榨菜籽油。

表3 菜籽油樣品中多環(huán)芳烴含量表

在菜籽油中，含量占比最大的多環(huán)芳烴化合物為，其中3個菜籽油樣品中?含量超過1 μg·kg-1，4個精制初榨菜籽油樣品中其含量超過1 μg·kg-1。這一結(jié)果與ALOMIRAH等[4]的研究結(jié)果一致，其研究團隊報道在83%的植物油樣品中檢測出了?。

所有樣品中4種多環(huán)芳烴含量之和均不超過10 μg·kg-1，這 與CIECIERSKA和OBIEDZI SKI的報道一致。CIECIERSKA和OBIEDZI SKI研究發(fā)現(xiàn)精煉工藝在油籽加工過程中起著關(guān)鍵作用，因為其顯著降低了產(chǎn)品中的多環(huán)芳烴含量。菜籽油中苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽和?的污染水平，與其他國家測定的精制植物油中這些化合物的平均水平相當(dāng)[5]。

在檢測的精制葵花籽油中苯并（a）芘含量不超過2.0 μg·kg-1，30%的樣品中苯并（a）芘含量低于方法驗證時測定的檢出限（0.18 μg·kg-1），50%的樣品中苯并（a）芘含量在0.18～0.25 μg·kg-1。在大多數(shù)精制葵花籽油樣品中BaP、CHR和BbFA含量均低于定量限（分別是80%、70%和80%）。多環(huán)芳烴含量最高的油品中分別含有BaP（1.86±0.28）μg·kg-1、BaA（0.92±0.14）μg·kg-1、CHR（1.42±0.21）μg·kg-1、BbFA（1.58±0.24）μg·kg-1。許多研究[1，5]表明食用油通過精制過程，特別是使用混合吸附劑（活化漂白土和活性炭），多環(huán)芳烴的含量會降低。

油橄欖果渣油和添加橄欖油的菜籽調(diào)和油樣品中多環(huán)芳烴含量均適中，苯并（a）芘最小含量低于檢出限，而最大含量分別達(dá)到0.25 μg·kg-1和0.45 μg·kg-1。油橄欖果渣油中4種多環(huán)芳烴含量總和與添加橄欖油的菜籽調(diào)和油中含量之間沒有顯著差異，具體結(jié)果見表。有研究認(rèn)為，多環(huán)芳烴吸附在果實表面，在萃取過程中轉(zhuǎn)移到油脂中，油橄欖果渣油可能是多環(huán)芳烴的重要來源。多環(huán)芳烴含量可作為確定不同植物油品質(zhì)和優(yōu)化精制工藝的重要指標(biāo)。

表4 其他種類植物油中PAHs含量表（單位：μg·kg-1）

粗制大豆油中苯并（a）芘和4種多環(huán)芳烴含量之和均顯著高于精制成品油，含量之和最高為（9.10±1.82）μg·kg-1。YE等[6]在粗制大豆油和精制大豆油中檢測到的PAHs含量明顯較低。他們認(rèn)為由于油經(jīng)過了中和、漂白和脫臭過程，使得苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽的含量降低。未精制的椰子油中多環(huán)芳烴的污染最為嚴(yán)重。

在本研究中，苯并（a）芘含量與4種多環(huán)芳烴含量之和呈現(xiàn)顯著的線性相關(guān)（r=0.947）。不同種類食用植物油樣品中，85.8%的樣品苯并（a）芘含量＜2 μg·kg-1，此外在測定的多環(huán)芳烴中，?的占比最大。

5 結(jié)論

所有被測植物油樣本中含有的苯并（a）芘及苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽、?（4種多環(huán)芳烴的總和）的含量均低于國外標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限值[7]。與成品油相比，非成品油的PAHs污染水平明顯更高；未精制的椰子油中多環(huán)芳烴含量最高；精制菜籽油和精制初榨菜籽油中4種PAHs含量無顯著差異，而冷過濾精制初榨菜籽油中各PAHs的最高含量均顯著低于其他菜籽油。