兩種色譜法檢測小麥粉中曲酸的含量

◎ 周書來，景 贊，吳 麗

（1.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 樂山 614000；2.樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，四川 樂山 614000）

曲酸（Kojic Acid），又名鞠酸，化學(xué)名稱為2-羥甲基-5-羥基-γ-吡喃酮，分子式為C6H6O4，是一種具有抗菌作用的有機(jī)酸，可由微生物好氧發(fā)酵得到[1]。曲酸對(duì)多種金屬離子有螯合作用，能干擾多酚氧化酶酶促反應(yīng)[2]，因此曲酸具有良好的抗酶促褐變性能。自曲酸發(fā)現(xiàn)以來，許多學(xué)者一直致力于曲酸在食品中的應(yīng)用研究，經(jīng)查閱文獻(xiàn)表明，曲酸在食品防腐、保鮮、護(hù)色等方面具有良好的性能[3-7]，此外，曲酸還能抑制食品中的亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為致癌的亞硝胺[1,8]。雖然曲酸具有以上優(yōu)良性能，但其安全性卻不容忽視，陳永紅等[9]以小鼠為研究對(duì)象，體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在一定時(shí)間內(nèi)高濃度曲酸可以導(dǎo)致DNA損傷；聶西度等[10]表示曲酸分子中的羥基可以使人體積累游離基，具有致癌性；世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)于2017年10月27日公布的致癌物清單中，曲酸作為3類致癌物位列其中，對(duì)人類致癌性可疑。

小麥粉作為小麥的初加工品，在生產(chǎn)、貯藏的過程中易發(fā)生酶促褐變，影響產(chǎn)品外觀，降低食用品質(zhì)與營養(yǎng)價(jià)值，因此，一些生產(chǎn)廠家通常會(huì)在生產(chǎn)過程中添加適量食品添加劑（例如面粉處理劑）抑制褐變，改善小麥粉色澤和食用品質(zhì)，但也存在某些不法商販違規(guī)將曲酸、噻二唑、過氧化苯甲酰等非食品原料直接添加到小麥粉中或小麥粉品質(zhì)改良劑中，從中牟利。小麥粉的品質(zhì)及其安全性一直受到監(jiān)管部門的高度重視。2017年11月原國家食藥總局發(fā)布《關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)小麥粉質(zhì)量安全監(jiān)管的公告》（2017年第132號(hào)）要求嚴(yán)禁生產(chǎn)企業(yè)在小麥粉中添加過氧化苯甲酰、次磷酸鈉、硫脲、間苯二酚、過硫酸鹽、噻二唑以及曲酸等非食品原料[11]。小麥粉中是否添加曲酸是評(píng)價(jià)小麥粉安全性的重要內(nèi)容之一，因此，找到合適的檢測方法對(duì)小麥粉中曲酸含量（添加量）進(jìn)行定量測定具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文利用高效液相色譜和氣相色譜分別建立檢測方法，并比較評(píng)價(jià)兩種方法的可靠性和準(zhǔn)確性，為曲酸含量不同的樣品提供合適的備選檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉（作為基質(zhì)空白，用相應(yīng)的高效液相色譜法和氣相色譜法檢測，均未出現(xiàn)曲酸目標(biāo)峰），購于本地超市；曲酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：BOOC1427），純度99.9%，購于BEIJING MANHAGE BIOTECHNOLOGY COMPANY；乙腈、甲醇、丙酮為色譜純，購于北京百靈威科技有限公司；乙酸乙酯為色譜純，購于賽默飛世爾科技有限公司；磷酸為分析純，購于成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；TG2-20B高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-700超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；2010Plus氣相色譜儀，日本島津有限公司；EV331旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；ME204T102電子天平（精密度：0.000 1 g），梅特勒-托利多。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

高效液相色譜法：精密稱取曲酸12.3 mg，用少量乙腈溶解，移至10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻后得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放置在4 ℃的冰箱中保存。

氣相色譜法：精密稱取曲酸10.8 mg，用少量丙酮溶解，移至10 mL容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻后得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放置在4 ℃的冰箱中保存。

1.4 樣品溶液的制備

高效液相色譜法：將小麥粉樣品充分混勻后，準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.000 1 g），置于50 mL具塞塑料離心管中，精確加入10 mL乙腈，密塞，振蕩搖勻2 min，超聲15 min，取出4 mL于10 mL具塞塑料離心管中，以10 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液經(jīng)0.25 μm的有機(jī)微孔濾膜過濾后上機(jī)測定。

氣相色譜法：準(zhǔn)確稱取混勻后的樣品2 g（精確至0.000 1 g），置于50 mL具塞塑料離心管中，精確加入10 mL甲醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶劑，密塞，振蕩搖勻2 min，超聲10 min，再以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min，精密移取上清液5 mL于50 mL雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1 mL乙酸乙酯溶解，取溶液經(jīng)0.25 μm的有機(jī)微孔濾膜過濾后上機(jī)測定。

1.5 檢測條件

高效液相色譜法：色譜柱為Inertsil ODS-3 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92）；二極管陣列檢測器檢測，檢測波長269 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL。

氣相色譜法：色譜柱為SH-Rxi-17毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；升溫程序：從0 ℃升溫到100 ℃，保持1 min，再升溫到280 ℃保持10 min；進(jìn)樣口溫度280 ℃；FID檢測器溫度300 ℃；進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣（分流比5.0），進(jìn)樣體積1 μL；載氣為高純氮?dú)?，線速度為40 cm·s-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性試驗(yàn)

在上述高效液相色譜條件下，檢測空白樣品（溶劑：乙腈）、標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液，色譜圖分別見圖1、圖2和圖3。

圖1 空白樣品液相色譜圖

圖3 加標(biāo)樣品液相色譜圖

由色譜圖可知，溶劑對(duì)曲酸的測定干擾小，標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液在相應(yīng)保留時(shí)間處有相應(yīng)峰，且目標(biāo)峰與其他峰分離良好，因此，該液相色譜條件適用性良好。

在上述氣相色譜條件下，檢測空白樣品（溶劑：乙酸乙酯）、標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液，色譜圖分別見圖4、圖5和圖6。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖

圖4 空白樣品氣相色譜圖

圖5 標(biāo)準(zhǔn)溶液氣相色譜圖

圖6 加標(biāo)樣品氣相色譜圖

由色譜圖可知，空白圖譜基線較平穩(wěn)，標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液在相應(yīng)保留時(shí)間處有相應(yīng)峰，且目標(biāo)峰與其他峰分離良好，因此，該氣相色譜條件適用性良好。

2.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

高效液相色譜法：分別精密移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.06 mL、0.10 mL及0.15 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻后得到系列濃度標(biāo)準(zhǔn)使用液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。將標(biāo)準(zhǔn)使用液在建立的液相色譜條件下進(jìn)行檢測，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=27.468x-4.151，r=0.999 6。這說明曲酸在0～18.45 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以3倍的信噪比計(jì)算方法的檢出限，以10倍的信噪比計(jì)算方法的定量限，得到高效液相色譜法的檢出限和定量限分別為0.19 mg·kg-1和0.64 mg·kg-1。

氣相色譜法：分別精密移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL及1.00 mL于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻后得到標(biāo)準(zhǔn)使用液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。將標(biāo)準(zhǔn)使用液在建立的氣相色譜條件下進(jìn)行檢測，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=1157.9x+30.825，相關(guān)系數(shù)r=0.997 8。這說明曲酸在0～108 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以3倍的信噪比計(jì)算方法的檢出限，以10倍的信噪比計(jì)算方法的定量限，得到氣相色譜法的檢出限和定量限分別為12.1 mg·kg-1和40.3 mg·kg-1。

2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

高效液相色譜法：向準(zhǔn)確稱取的小麥粉空白樣品中分別加入40 μL、60 μL和100 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按照液相條件下樣品溶液制備方法制備提取液，分別平行測定3次，計(jì)算得到加標(biāo)回收率范圍為87.5%～89.0%。

氣相色譜法：準(zhǔn)確稱取的小麥粉空白樣品中分別加入80 μL、120 μL和160 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按照氣相條件下樣品溶液制備方法制備提取液，分別平行測定3次，計(jì)算得到加標(biāo)回收率范圍為88.2%～90.2%。

2.4 精密度試驗(yàn)

高效液相色譜法：精密移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.01 mL，按2.2方法配成標(biāo)準(zhǔn)使用液，在液相色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，得到曲酸RSD（n=6）為0.83%，表明精密度良好。

氣相色譜法：精密移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.20 mL，按2.2下方法配成標(biāo)準(zhǔn)使用液，在氣相色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，得到曲酸RSD（n=6）為0.85%，表明精密度良好。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)分別建立了一種檢測小麥粉中曲酸含量的高效液相色譜法和氣相色譜法。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，這兩種方法都具有簡便易行、專屬性強(qiáng)、出峰時(shí)間短、溶劑消耗少、準(zhǔn)確度和精密度較高、線性關(guān)系良好等特點(diǎn)，適合小麥粉中曲酸含量的檢測。兩種方法相比較，高效液相色譜法的靈敏度要高于氣相色譜法，所以在測定小麥粉中的曲酸含量時(shí)，可根據(jù)樣品中曲酸含量的不同，選擇不同的方法。含量較低時(shí)，使用高效液相色譜法要準(zhǔn)確些；含量高時(shí)，可以使用高效液相色譜法或氣相色譜法。