不同產(chǎn)地的余甘子提取物中沒食子酸含量測定

◎ 劉賢釗，陳炎歡，范漢龍，程 敏，葉永幸

（1.無限極（中國）有限公司，廣東 江門 529100；2.弘正道（中國）中藥研究有限公司，廣東 廣州 510665）

余甘子是大戟科植物余甘子（Phyllanthus emblica L.）的干燥成熟果實[1]。余甘子提取物是以余甘子為原料，經(jīng)水提取、過濾、濃縮、干燥等工序制成的提取物[2]。余甘子提取物中含有沒食子酸、鞣花酸等成分[3-5]，現(xiàn)代藥理研究表明，余甘子提取物具有提高免疫力[6]、抗氧化[7]、輔助保護肝損傷[8-9]等作用。

目前在國內(nèi)外未有余甘子提取物的官方質(zhì)量評價方法[10]。本研究建立了余甘子提取物的沒食子酸含量測定方法，并測定了不同產(chǎn)地的余甘子提取物中沒食子酸含量，為初步評價余甘子提取物的質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

HP1200型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器，美國Agilent公司；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

沒 食 子 酸 標 準 品（CAS號149-91-7，批 號110831-201906），中國食品藥品檢定研究院，含量以91.5%計；鞣花酸標準品（CAS號476-66-4，批號111959-201903），中國食品藥品檢定研究院，含量以88.8%計；甲醇為色譜純（德國Merck公司）；其他試劑均為分析純，水為純化水。

余甘子提取物由適量余甘子藥材加8倍量水煎煮3次，合并濾液，70 ℃減壓濃縮，經(jīng)噴霧干燥而得。13批余甘子提取物來源于4個廠家，編號1～13。

1.2 方法

1.2.1 沒食子酸含量測定

（1）對照品溶液配制。精密稱取沒食子酸對照品約3 mg于10 mL的棕色容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，即得對照品溶液。

（2）供試品溶液配制。取本品約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲（250 W，40 KHz）提取1 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

（3）沒食子酸含量測定。精密吸取對照品溶液和供試品溶各10 μL，注入液相色譜儀測定。根據(jù)所得對照品溶液和供試品溶液色譜圖中沒食子酸峰面積計算供試品中的沒食子酸含量。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：十八烷基鍵合硅膠柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以甲醇為流動相A，以0.2%磷酸溶液為流動相B。

采用梯度洗脫：0～12 min流動相A由5%上升到17%，流動相B由95%下降到83%；12～17 min保持50%甲醇和50%磷酸溶液；17～22 min保持5%甲醇和95%的磷酸溶液。波長273 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL·min-1；進樣量10 μL；理論塔板數(shù)按沒食子酸計不低于5 000。

1.2.3 方法學考察

（1）線性關系考察。精密稱取沒食子酸對照品18.842 mg置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解制成儲備液，再精密吸取該儲備液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL及10.0 mL分別至10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，測定峰面積。

（2）精密度試驗。取1.2.1項中制備的沒食子酸對照品溶液，重復進樣6次，分別計算峰面積及保留時間的RSD值。

（3）穩(wěn)定性試驗。精密稱取余甘子提取物（批號20191202/12591），按1.2.1項中制備的供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、12 h及24 h測定。

（4）重復性試驗。精密稱取同批號余甘子提取物按1.2.1項中制備的6份供試品溶液，色譜條件測定。

（5）回收率試驗。取沒食子酸對照品112.26 mg置50 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，吸取該對照品溶液2.5 ml、5.0 ml、7.5 ml各3組，分別加入已各自精密稱取同批號余甘子提取物約0.1 g的9個具塞錐形瓶中，按1.2.1制成供回收率測定用供試品溶液，注入液相色譜儀測定，計算沒食子酸的回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關系考察

以沒食子酸對照品的濃度（mg·mL-1）為橫坐標，峰面積為縱坐標，求得回歸方程Y=556.45X-0.121，R2=0.999 9。結(jié)果表明沒食子酸在0.068 4～0.684 3 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關系，見圖1。

圖1 沒食子酸對照品的標準曲線圖

2.2 精密度試驗

以沒食子酸計，保留時間和峰面積的RSD值為0.06%，不對稱度不高于1.2，理論塔板數(shù)約21 000，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗

穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，供試品中沒食子酸峰面積的RSD為0.24%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復性試驗

沒食子酸平均含量為9.75%，RSD為1.00%。分離度大于1.5，表明該方法重復性良好。

2.5 回收率試驗

平均回收率為98.85%（92%～105%），表明該方法準確度良好。

2.6 樣品含量測定

13批余甘子提取物中沒食子酸含量在2.52%～9.75%，平均值約為4.6%，寧波產(chǎn)地的余甘子提取物中沒食子酸含量偏高，為8.96%～9.75%；西安B產(chǎn)地的余甘子提取物中沒食子酸含量最低，約為2.5%，但是每個產(chǎn)地本身數(shù)據(jù)差異較小，結(jié)果見表1。

表1 余甘子提取物沒食子酸含量測定結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

上述方法學驗證表明，測定余甘子提取物中沒食子酸含量的高效液相色譜法的適應性、精密度、線性關系、準確度等均符合要求，該方法穩(wěn)定、可靠，可以作為余甘子提取物中沒食子酸的含量測定方法。從上述研究表明，不同產(chǎn)地的余甘子提取物的沒食子酸含量存在一定差異，這可能與余甘子藥材本身的生長環(huán)境，采收時間，加工工藝等因素有關，有待進一步研究。