景思佳 鄭慧琳 張 蕾*

1(浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院， 杭州 310023)2(浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同中心，杭州 310023)3(浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，杭州 310023)

引言

肝臟負責(zé)人體中代謝物轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)合成和異源物質(zhì)解毒等重要功能的實現(xiàn)[1]。實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞共同構(gòu)成肝臟，其中非實質(zhì)細胞包括肝星狀細胞、庫普弗細胞、肝竇內(nèi)皮細胞和各種免疫細胞[2]。由于受到藥物損傷、飲食習(xí)慣、病毒感染等多種因素的影響，容易發(fā)生脂肪肝、肝硬化、藥物性肝損傷甚至導(dǎo)致肝癌[3-5]。但由于肝臟內(nèi)部微環(huán)境復(fù)雜，具有顯著的個體差異，很難建立最佳的疾病模型來探索肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療。針對脂肪肝、肝炎、肝纖維化、肝癌等發(fā)病機制的研究以及藥物的研發(fā)，目前主要以體外二維細胞模型和體內(nèi)動物模型為主。體外二維模型即肝細胞株二維培養(yǎng)，表達較低的肝臟特有的合成和代謝相關(guān)酶，與體內(nèi)肝臟生理環(huán)境相差甚遠，且細胞與細胞外基質(zhì)之間缺乏或不存在相互作用，但對于維持生物功能和原位表型以及組織特異性的細胞過程中的相互作用不可或缺[6-7]；體內(nèi)動物模型存在試驗周期長、種屬差異等缺陷，對于大規(guī)模的評估和篩藥過程并不適用[8]，如患者來源的異種移植模型[9-10]，向免疫缺陷小鼠體內(nèi)移植人類肝癌組織，成瘤率低于30%，腫瘤也會隨之進化，導(dǎo)致與人類腫瘤有較大的差異[11-14]。而通過3D類器官培養(yǎng)技術(shù)，構(gòu)建肝臟類器官模型(見表1)，可形成已分化組織的復(fù)雜空間形態(tài)，維持細胞的生理功能，在細胞構(gòu)成、組織結(jié)構(gòu)和特定功能等方面與人肝臟的生理病理環(huán)境更為相似。

表1 肝臟類器官的優(yōu)勢Tab.1 The advantage of liver organoids

在肝臟類器官的形成過程中，首先通過誘導(dǎo)前腸內(nèi)胚層分化形成肝祖細胞，在外源因子BMP、FGF、OSM、HGF等的響應(yīng)下，調(diào)節(jié)多種信號通路，促進肝祖細胞增殖，并遷移到中胚層形成肝芽。在形成肝芽和肝葉的過程中，可通過加入肝成熟外源因子，使肝祖細胞向肝細胞和膽管細胞分化(見圖1)。肝臟類器官能更好地模擬肝臟的代謝合成功能，如糖原代謝、脂質(zhì)代謝、類固醇代謝、藥物代謝、白蛋白分泌、尿素合成等；可高表達肝細胞相關(guān)的藥物代謝酶、核受體及肝特異性標志物，如ALB、AAT、HNF-4α、HNF-3β等。

圖1 肝臟類器官的構(gòu)建Fig.1 The construction of liver organoids

1 肝臟類器官的研究進程

類器官保留了細胞間的接觸，從而促成了它們的相互作用和自我聚集，是一種簡化后的微型器官。類器官的微環(huán)境由細胞因子和細胞外基質(zhì)組成，細胞因子調(diào)控多種信號通路，與細胞的增殖、自我更新和分化相關(guān)，并借助細胞外基質(zhì)的作用，自組織特異性的類器官形成，使其在真實器官的結(jié)構(gòu)和功能方面得到有效的反映[15]。肝臟類器官既可以模擬肝臟特有的功能[16-17]，也可以模擬生理條件下藥物在體內(nèi)長期暴露后對肝臟的損傷和累積性毒性[18]，并可結(jié)合熒光成像技術(shù)來實現(xiàn)藥物的高通量評價[19]。肝臟類器官的發(fā)展非常迅速，如圖2所示。2013年，Hans Clevers等[27]首次對人肝臟類器官進行研究，發(fā)現(xiàn)通過激活Wnt信號通路，利用Lgr5+的肝臟干細胞，可成功構(gòu)建肝臟類器官，并通過分化和移植實驗，證明其具有肝細胞的功能活性。雖然構(gòu)建的肝臟類器官僅具有肝臟的部分基礎(chǔ)功能，但卻為后續(xù)研究與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。2019年，使用iPSC衍生的肝臟類器官的研究表明，由于再現(xiàn)了肝臟固有的免疫反應(yīng)，所以促成了乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)和丙肝病毒(hepatitis C virus, HCV)的自然進入[31]。雖然肝臟類器官較真實地再現(xiàn)了宿主病毒的相互作用，但它們是否可用于篩選抗病毒個性化治療還有待進一步研究。隨后，利用類器官進行多器官的聯(lián)合培養(yǎng)也成為一種研究方向。Takebe等[32]在世界上首次利用iPSC成功培育出了3種互相連接的類器官，包括肝臟、胰腺和膽管，為研究人類器官早期形成的復(fù)雜相互作用過程提供了可能。

圖2 肝臟類器官的發(fā)展進程Fig.2 The development of liver organoids

1.1 肝臟類器官的種子細胞

多種細胞可作為種子細胞進行肝臟類器官的培養(yǎng)(見表2)，肝癌細胞如HepG2細胞，常被用于肝細胞體外功能的研究，且可能具有肝細胞不具有的基質(zhì)重建能力[59]，常被用于藥物肝毒性檢測[61]。以肝癌細胞為種子細胞的類器官在一定程度上反映了肝癌患者某些方面的異質(zhì)性——癌細胞組成、表型、治療反應(yīng)等[62]，但由于其相對恒定的遺傳信息，無法充分個性化地顯示其肝臟的病理狀態(tài)。而利用原代肝細胞進行類器官的培養(yǎng)，可以保留遺傳信息的異質(zhì)性，被認為是肝臟體外研究的最佳標準。然而，人原代肝細胞較難獲得，而且分離得到的肝細胞的功能很難在體外維持。在體外培養(yǎng)時，由于缺乏合適的微環(huán)境和無法維持長期的培養(yǎng)[63]，會導(dǎo)致肝細胞脫分化，使肝細胞功能喪失，從而限制了肝細胞用于體外類器官的培養(yǎng)。以誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)或成體干細胞(adult stem cell, ASC)為種子細胞，一直是肝臟類器官的研究方向。iPSC由體細胞重編程而得，具有自我更新能力和多向分化潛能，可以產(chǎn)生大量特定的細胞類型，基于iPSC的系統(tǒng)可以用于研究體外復(fù)雜細胞的相互作用，且iPSC衍生的肝細胞具有藥物代謝能力，適用于檢測早期藥物的肝毒性，并有望用于個性化治療。但是，基于iPSC建立的肝臟類器官經(jīng)長期培養(yǎng)后往往會出現(xiàn)基因組突變等問題，而ASC建立的肝臟類器官的染色體和基因組較為穩(wěn)定，可作為肝臟類器官潛在的優(yōu)勢種子細胞類型[64]。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)作為一種ASC，在體外具有多向分化潛能，可分化為肝細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、肝星狀細胞、成纖維細胞、脂肪細胞等，參與肝臟類器官的構(gòu)建[19]。在保持肝臟類器官細胞多樣性的同時，基于間充質(zhì)干細胞建立的肝臟類器官又可以長期培養(yǎng)，用于大規(guī)模的藥物篩選[65]?；陂g充質(zhì)干細胞和間充質(zhì)干細胞分化而得的各細胞構(gòu)建的肝臟類器官，可以保證來自同一個體，使整體染色體和基因組保持一致。故這些細胞對于肝臟類器官的開發(fā)應(yīng)用(見圖3)，如基于肝臟類器官的藥物篩選平臺和疾病模型(包括脂肪肝、肝纖維化和肝癌類器官等模型)的建立，都有重要意義。

圖3 肝臟類器官的開發(fā)及應(yīng)用Fig.3 The development and application of liver organoids

表2 肝臟類器官的種子細胞Tab.2 The seed cells of liver organoids

1.2 肝臟類器官的構(gòu)建方式

類器官的自發(fā)形成通過生理性的內(nèi)源機制來實現(xiàn)，且細胞與基質(zhì)間的相互作用是必不可少的。近年來，許多生物材料(見表3)被用于體外類器官培養(yǎng)，構(gòu)建安全、穩(wěn)定、可塑性強的活性生物材料將為肝臟類器官生長研究提供更大的時間和空間彈性。水凝膠作為一種生物材料，表現(xiàn)出各向異性的板層結(jié)構(gòu)和不同大小的孔隙，可用于模擬肝臟的結(jié)構(gòu)。研究表明，在利用肝細胞脫細胞外基質(zhì)水凝膠進行三維培養(yǎng)后，所形成的具有三維結(jié)構(gòu)的類器官能夠?qū)崿F(xiàn)對藥物的代謝[81]；但其能夠維持肝細胞功能的時間仍較短，不能滿足長期的研究需求。以肝細胞脫細胞外基質(zhì)水凝膠進行肝臟類器官培養(yǎng)的技術(shù)目前并不成熟，其制備方式、是否與其他成熟水凝膠混用及培養(yǎng)方式仍有待研究。作為肝臟類器官培養(yǎng)，基質(zhì)膠是最常見也是較為成熟的一種細胞外基質(zhì)。Takebe等[82]將混合細胞放在基質(zhì)膠中共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其自組裝成肝芽；形成的肝芽具有血管化和功能化，但未形成膽管結(jié)構(gòu)，與人成熟肝臟仍有一定的差距。Broutier等[83]利用基質(zhì)膠，形成了具有膽道祖細胞特征的三維類器官，并可向肝系分化，在長期培養(yǎng)后仍能保持穩(wěn)定的遺傳特征。對于疾病建模、藥物篩選等，需要大量具有完全持續(xù)分化功能的人肝細胞。Wang等[77]通過建立化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基或限定化學(xué)成分的(無血清、無飼養(yǎng)層)培養(yǎng)基，以基質(zhì)膠為細胞外基質(zhì)，產(chǎn)生了可擴展的肝臟類器官，能夠穩(wěn)定地維持雙能干/祖細胞的表型特征，并具有向功能性肝細胞或膽管細胞分化的能力。目前，基質(zhì)膠培養(yǎng)肝臟類器官的方式相對較為成熟，且培養(yǎng)的肝臟類器官在穩(wěn)定性、功能性等方面表現(xiàn)出優(yōu)異性，但在基質(zhì)膠中培養(yǎng)的細胞非常脆弱且易碎，因此在大規(guī)模生產(chǎn)時存在問題。而生物反應(yīng)器在類器官的大規(guī)模生產(chǎn)中具有一定的優(yōu)勢，并能夠增加氧和營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，防止細胞沉降等，從而克服了靜態(tài)培養(yǎng)體系固有的局限性[84]。利用生物反應(yīng)器——旋轉(zhuǎn)瓶，可建立一種高效的Lgr5+干細胞的類器官培養(yǎng)方法，結(jié)果顯示成熟的肝細胞標記物較靜態(tài)的類器官有較高的上調(diào)，細胞色素P450活性達到與肝細胞相當(dāng)?shù)乃絒85]，有望實現(xiàn)肝臟類器官的大量生產(chǎn)。在未來的研究中，將基質(zhì)膠與生物反應(yīng)器結(jié)合來培養(yǎng)肝臟類器官，既能快速穩(wěn)定地形成肝臟類器官，又能實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，從而應(yīng)用于臨床實際。

表3 生物材料在肝臟類器官培養(yǎng)中的應(yīng)用Tab.3 Application of biological materials in liver organoids culture

2 肝臟類器官具有疾病建模能力

目前，利用肝臟類器官成功建立的疾病模型主要包括酒精性/非酒精性肝病模型、脂肪變性模型、肝纖維化模型、肝癌模型等。2015年，Hach等[86]利用從成人肝臟組織中分離得到的基因組穩(wěn)定的干細胞建立了肝臟類器官，不僅其具有分化活性，而且還通過建立A1AT缺陷的疾病模型，證明其可以緩解肝細胞的功能活性。雖然該研究目前僅限于建立了肝臟疾病模型，對于肝臟類器官在其他領(lǐng)域的應(yīng)用仍是空白，但也為通過肝臟類器官研究人類肝臟再生、人類肝臟疾病機制、毒理學(xué)或藥物測試開辟了一條新途徑。2019年，Guan等[87]通過肝臟類器官建模，發(fā)現(xiàn)了一條對早期肝臟發(fā)育至關(guān)重要的途徑，即磷脂酰乙醇胺生物合成，基于這一發(fā)現(xiàn)，開發(fā)了一種用于治療原發(fā)性肝癌的新型聯(lián)合藥物。從機制研究出發(fā)，肝臟類器官的形成過程為詳細分析調(diào)控肝臟發(fā)育各個階段的途徑提供新思路；開發(fā)的新型聯(lián)合藥物可作為原發(fā)性肝癌的臨床藥物，為原發(fā)性肝癌患者提供新的治療方案。在作為肝纖維化和非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)模型方面，肝臟類器官也具有巨大的潛力。肝纖維化與肝星狀細胞的狀態(tài)變化相關(guān)，肝星狀細胞作為肝臟內(nèi)的特異性間充質(zhì)細胞，當(dāng)肝臟受到損傷時，靜止的肝星狀細胞向增生性肌纖維肝星狀細胞分化。Leite等[88]通過肝細胞和肝星狀細胞的共同混合培養(yǎng)產(chǎn)生肝臟類器官，在單次或重復(fù)暴露于促纖維化化合物烯丙醇和甲氨蝶呤14天后，表現(xiàn)出纖維化特征，如星狀細胞活化、膠原分泌和沉積。由分化的肝細胞和原代肝星狀細胞培養(yǎng)的肝臟類器官是第一個模擬藥物誘導(dǎo)肝纖維化的體外方法，這對于研究肝纖維化的形成和改善具有重要意義。但是，僅僅通過激活細胞因子介導(dǎo)的星狀細胞來研究纖維化表型，并不能代表人體復(fù)雜的肝臟疾病，Wang等[77]通過整合的肝臟類器官，開發(fā)了酒精性肝病模型，可表現(xiàn)酒精性肝病相關(guān)的病理變化，如氧化應(yīng)激產(chǎn)生、炎性介質(zhì)釋放、脂肪變性和纖維化；其構(gòu)建的模型可以完全模擬酒精性肝病的病理生理變化和發(fā)病機制，未來可以通過引入免疫細胞，構(gòu)建更為準確的體外類器官疾病模型，進一步分析脂肪性肝炎。脂肪在肝細胞中的積累和脂毒性，對非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)的炎癥和纖維化的發(fā)展具有重要作用。2019年，Ouchi等[89]建立肝臟脂肪變性類器官模型，結(jié)果表明其脂質(zhì)代謝相關(guān)的代謝物明顯增加，表現(xiàn)出脂滴積聚、甘油三酯升高和線粒體損傷。在構(gòu)建該模型時，研究人員引入了由iPSC分化而來的免疫細胞——Kupffer細胞，使得該模型可以用來代表更為普遍的環(huán)境依賴性纖維化表型，如脂肪性肝炎。肝臟類器官也可通過基因工程模擬人類肝癌的初始變化，并監(jiān)測組織學(xué)變化[90]。由成體干細胞、誘導(dǎo)性多能干細胞、肝細胞等產(chǎn)生的肝臟類器官具有疾病建模能力，為肝臟類器官作為藥物篩選和肝毒性測試的平臺提供了一個機會。

3 肝癌類器官具有對藥物的敏感性

肝癌是最常見的癌癥相關(guān)死亡原因之一，但目前缺乏能夠再現(xiàn)腫瘤病理變化的體外模型用于篩選治療藥物，而肝癌類器官模型可以最大限度地模擬親代腫瘤的基因組及組織學(xué)結(jié)構(gòu)和腫瘤發(fā)生機制[91]。Buzzelli等[92]利用結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)肝轉(zhuǎn)移瘤來源的類器官，對5-氟尿嘧啶、伊立替康或奧沙利鉑等藥物進行了抗腫瘤效果的篩選，結(jié)果表明這些藥物可以明顯延緩腫瘤類器官的生長，所構(gòu)建的CRC肝轉(zhuǎn)移類器官可用于評價晚期患者的藥物反應(yīng)和化療耐藥情況。但目前人體多發(fā)的肝癌仍是原發(fā)性肝癌，故篩選治療原發(fā)性肝癌的藥物至關(guān)重要。Broutier等[52]首次制造出人類原發(fā)性肝癌類器官，所建立的肝癌類器官來自8個個體，代表了癌癥中最常見的3種亞型：肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、膽管癌(cholangiocarcinoma, CC)和HCC/CC合并癌(combined hepatocel-lular-cholangiocarcinoma, CHC)，并證實ERK抑制劑SCH772984可作為新型的潛在治療劑，用于治療原發(fā)性肝癌(primary liver cancer, PLC)。但該培養(yǎng)體系仍存在局限性，無法研究腫瘤細胞基質(zhì)和免疫系統(tǒng)的相互作用，從而無法確定ERK抑制劑SCH772984在更大范圍肝癌中的有效性。Cao等[93]在建立肝臟類器官后，以二乙基亞硝胺誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤，并證明索拉非尼和瑞格菲尼可成功抑制肝癌類器官的生長。該研究覆蓋了多達129種肝臟和肝癌樣本，提高了藥物篩選的可靠性，但局限于小鼠，所以成功篩選的兩種敏感性藥物對于人體肝臟是否同樣適用仍是未知。Sun等[91]通過向肝臟類器官引入其他致癌基因和腫瘤抑制因子來建立肝癌模型，并發(fā)現(xiàn)Crenigacestat和Nifuroxazide使肝癌細胞數(shù)量和相關(guān)基因的表達大幅下降。以肝癌類器官篩選藥物正作為藥物發(fā)現(xiàn)過程的一種替代方法被進一步研究，使得預(yù)測患者對特異性藥物的反應(yīng)成為可能。

4 肝臟類器官適用于藥物肝毒性檢測

藥物或其中間代謝物可造成對肝臟的毒性作用，即藥物性肝損傷(drug-induced liver injury, DILI)，易引發(fā)急性肝衰竭，導(dǎo)致藥物撤出市場[94]。因此，在藥物研發(fā)過程中進行藥物肝毒性的評估是必不可少的，而肝臟類器官將會是藥物肝毒性篩選的良好模型。Sgodda等[95]發(fā)現(xiàn)，肝臟類器官對具有肝毒性的乙酰氨基酚有高敏感性，且有很高的重復(fù)性。Bell等[96]證明，肝細胞三維培養(yǎng)模型在肝毒素的慢性暴露下，其敏感性急劇增加，其中一種藥物在三維模型中重復(fù)給藥后表現(xiàn)出肝毒性，而在過去的體外二維模型中并未檢測到肝毒性，表明構(gòu)建的三維模型更適用于藥物肝毒性的評估；并且其在三維培養(yǎng)中保留了個體間的差異，可被用于研究藥物對具有特定基因型的肝細胞的毒性反應(yīng)。Chakraborty等[97]發(fā)現(xiàn)，免疫細胞參與藥物肝毒性的發(fā)生，而免疫系統(tǒng)的參與是某些藥物的肝損傷作用發(fā)生的主要原因[98]。Kostadinova等[99]發(fā)現(xiàn)，將肝細胞與免疫細胞混合培養(yǎng)，所建立的三維肝臟培養(yǎng)模型在被特定的肝毒性物質(zhì)孵育后，與肝細胞二維培養(yǎng)模型相比，能更好地檢測出體內(nèi)藥物誘導(dǎo)毒性，包括物種特異性藥物效應(yīng)。因此，研究藥物的肝毒性，可以通過免疫細胞與肝細胞或其他細胞的共培養(yǎng)建立的肝臟類器官模型來實現(xiàn)。2019年，Mun等[33]由iPSC為種子細胞的肝臟類器官模型發(fā)現(xiàn)，在以CYP3A4-和CYP1A2/2E1-介導(dǎo)的肝毒性藥物的作用下，該模型較二維培養(yǎng)模型呈現(xiàn)顯著的敏感性；由于其具有極性膽管樣結(jié)構(gòu)，可用于預(yù)測肝膽抑制藥物的膽汁淤積毒性、肝細胞毒性以及DILI的混合型毒性，且適用于大規(guī)模的藥物肝毒性檢測。未來可借助高通量篩選建立肝臟類器官生物信息庫，通過肝臟類器官生物信息的篩選進行新藥肝毒性的測試。

5 總結(jié)與展望

目前，國內(nèi)外研究主要圍繞著Lgr5+干細胞、iPSC誘導(dǎo)的肝細胞混合間充質(zhì)干細胞和血管內(nèi)皮細胞、臨床組織樣本等進行肝臟類器官的培養(yǎng)，不斷創(chuàng)造各種新型生物材料作為細胞外基質(zhì)，以支撐肝臟類器官的三維生長，不斷探索各細胞因子的混合使用比例與時間，以促進類器官的分化，并借助組織工程技術(shù)重塑肝組織的完整性，提供了一個3D環(huán)境來更準確地再現(xiàn)體內(nèi)環(huán)境，旨在提供一個模擬肝臟發(fā)育、疾病發(fā)生和癌癥進展的模型，部分取代動物模型來檢測臨床藥物的有效性和安全性。

但是，目前對于肝臟類器官的研究仍處于早期發(fā)展階段，利用基質(zhì)培養(yǎng)，其組成沒有定義，在培養(yǎng)中引入變量，對于其在臨床上的應(yīng)用是有限制的。類器官的微環(huán)境本質(zhì)上是異質(zhì)性的，其周圍的細胞接受了最多的營養(yǎng)和氧氣，而靠近中心的細胞通常是缺氧的[33,99-101]，在培養(yǎng)過程中難以控制其形狀、細胞成分，不能完全概括肝臟中存在的多種細胞類型及成熟程度，即無法完全實現(xiàn)成熟肝臟的功能，以及器官的免疫化、血管化和神經(jīng)支配。肝臟類器官的實際表型更接近于膽管細胞[102]，需要有更好的條件將這些細胞分化為成熟的肝細胞，否則可能限制肝臟類器官在疾病模型或藥物篩選等方面的適用性，只能部分替代動物建立疾病模型，且由肝臟類器官所建立的疾病模型能否保持疾病的表觀遺傳特征，即能否用于疾病的發(fā)生與發(fā)展，仍是未知的。

因此，需要從不同方面解決肝臟類器官培養(yǎng)過程中存在的問題，如優(yōu)化3D培養(yǎng)體系、不同方式聯(lián)合培養(yǎng)、不同細胞以最佳混合比例及種類共培養(yǎng)等。需要進一步研發(fā)新的生物合成材料或無基質(zhì)培養(yǎng)平臺，使細胞能夠在三維結(jié)構(gòu)中自聚集而不丟失它們的發(fā)育命運。進一步開發(fā)共培養(yǎng)體系，如利用上皮細胞與內(nèi)皮細胞、間充質(zhì)干細胞和免疫細胞的相互作用，創(chuàng)造更復(fù)雜的類器官系統(tǒng)，積極參考和應(yīng)用腸道類器官在這方面的研究成果[103-104]。肝臟類器官系統(tǒng)還可結(jié)合基因組編輯技術(shù)，確定肝臟疾病引起的突變?nèi)绾斡绊懜闻K發(fā)育和發(fā)病機制。目前研發(fā)的各類肝臟類器官模型，為研究人類肝臟及其相關(guān)疾病創(chuàng)造了機會，從肝臟疾病的疾病建模到藥物肝毒性等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面都具有良好的前景。