單 良,徐雨笠,李 玎,童 軍

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，上海 200434)

耳聾嚴(yán)重影響人們的生理心理健康。后天性噪音、老年性、耳毒性藥物及自身免疫性疾病性耳聾發(fā)病率日益增高[1]。耳蝸毛細(xì)胞將聲音刺激轉(zhuǎn)換為生物電信號(hào)，產(chǎn)生聽力，因此科學(xué)家們一直致力于聽毛細(xì)胞的再生和損傷修復(fù)的研究，近年內(nèi)耳基因治療成為熱點(diǎn)，即通過導(dǎo)入內(nèi)耳功能性基因并表達(dá)，促進(jìn)聽毛細(xì)胞的再生或修復(fù)。這些研究已經(jīng)取得一些突破，如Abdolazimi等[2]通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ATOH1促進(jìn)毛細(xì)胞再生，陳嘉偉等[3]經(jīng)圓窗膜鼓階顯微注射的方法將腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染小鼠耳蝸，取得良好效果，給了我們促進(jìn)聽毛細(xì)胞修復(fù)的新理論基礎(chǔ)和思路。瞬時(shí)受體電勢(shì)C通道蛋白6(Transient receptor potential canonical ，TRPC6)可在細(xì)胞膜上構(gòu)成非選擇性陽離子通道，發(fā)揮多種生理功能。在大鼠腦缺血性損傷模型中，TRPC6 蛋白的降解被阻止，進(jìn)而起到保護(hù)神經(jīng)元[4]作用。TRPC6也是腎臟足細(xì)胞重要的裂孔隔膜蛋白，其編碼基因發(fā)生突變可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷[5]。TRPC6同樣被發(fā)現(xiàn)在耳聾康復(fù)中發(fā)揮作用，但Sexton[6]認(rèn)為其作用是通過毛細(xì)胞代謝還是直接通過保護(hù)中樞神經(jīng)元尚無法確定。本研究將探討攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein)的TRPC6過表達(dá)慢病毒(PHBCMV-TRPC-EGFP)經(jīng)大鼠圓窗膜注入后，能否成功轉(zhuǎn)染大鼠毛細(xì)胞，表達(dá)后直接促進(jìn)毛細(xì)胞的修復(fù)，治療大鼠聽力損傷。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SD大鼠25只，雄性，200～250 g，(海軍醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心 許可證號(hào)：SCXK(滬 2012-0007)。聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢查示聽力正常。TRPC6過表達(dá)慢病毒(PHBCMV-TRPC-EGFP)和空病毒(PHBCMV-EGFP)(上海生博生物科學(xué)技術(shù)有限公司)滴度1.81×108 TU/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 噪音性耳聾動(dòng)物制備(上海海軍研究所) 實(shí)驗(yàn)大鼠清醒狀態(tài)下單只放入特制的鼠籠內(nèi)，置于消聲室自由聲場(chǎng)中，接受155dB SPL脈沖噪聲暴露20次，間隔2 s。

1.2.2 SD大鼠分組 25只SD大鼠，4只操作中死亡，余下21只完成噪音性聾模型制作，隨機(jī)分為3組,每組7只：TRPC6組，空病毒組，對(duì)照組，均取左耳為實(shí)驗(yàn)耳。

1.2.3 聽性腦干反應(yīng)(ABR)測(cè)試 大鼠于噪音暴露前及暴露后3，10，20 d進(jìn)行ABR檢測(cè)(上海眼耳鼻咽喉科醫(yī)院聽力中心，0.1 ms短聲，重復(fù)率為11.1次/s，濾波帶寬150～2 000 Hz，疊加1 000次，掃描周期10 ms。電極正極置于頭頂正中皮下，參考電極置于同側(cè)頜面部皮下，地極置于鼻尖皮下。刺激聲經(jīng)耳塞給入。以Ⅲ波消失的刺激強(qiáng)度確定閾值，并至少重復(fù)1次。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)手術(shù)操作 TRPC6組和空病毒組大鼠于噪聲暴露后1 d行耳后進(jìn)路經(jīng)圓窗膜耳蝸?zhàn)⑷胄g(shù)。術(shù)耳向上，背側(cè)進(jìn)路：沿耳廓后溝2 mm 處弧形切口，向深處分離，在面神經(jīng)和二腹肌圍成的三角區(qū)域內(nèi)向深處顯露聽泡，在顯微鏡下用電鉆打開聽泡，暴露圓窗龕[7]，用細(xì)針穿破圓窗膜，見少許血液和清亮的淋巴液流出，用微量注射器將5 uLTRPC6過表達(dá)慢病毒或空病毒緩慢注入耳蝸，理論上2 min。明膠海綿覆蓋圓窗膜，清洗消毒后，封閉聽泡，分層縫合切口。

1.2.5 耳蝸鋪片的制作 耳聾20d ABR檢測(cè)后，各組大鼠麻醉后處死，取出聽泡，暴露耳蝸，在蝸尖挑開一小孔，捅破圓窗膜，并將鐙骨輕推入前庭池以打開前庭窗，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)經(jīng)蝸尖灌注固定耳蝸，然后將耳蝸置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中4 ℃固定24 h，EDTA脫鈣，基底膜鋪片。免疫熒光染法：PBS浸洗5 min 3次。PBST浸洗40 min(37 ℃)。一抗(Santa Cruz)浸洗37 ℃ 1 h，4 ℃過夜。PBS 5 min×3次。二抗(37 ℃)1 h。PBS 5 min×3次，DAPI 10 min，PBS 5 min×3次，封片。熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)情況及毛細(xì)胞的損傷程度。

2 結(jié)果

2.1 ABR閾值測(cè)試結(jié)果 噪音暴露前3組大鼠ABR閾值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.045，P>0.05)。噪音暴露后3 d，3組大鼠ABR閾值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.477，P>0.05)。噪音暴露后10 d，3組大鼠ABR閾值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.437，P<0.05)，其中TRPC6組與空病毒組和對(duì)照組之間差異均有顯著性(P=0.01，P=0.00)，空病毒組與對(duì)照組之間差異無顯著性(P>0.05)。噪音暴露后20 d，3組大鼠ABR閾值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.370，P<0.05)，其中TRPC6組同與空病毒組和對(duì)照組之間差異均有顯著性(P<0.05)，空病毒組與對(duì)照組之間差異無顯著性(P>0.05，見表1)。

表1 ABR閾值測(cè)試結(jié)果

2.2 大鼠耳蝸顯微鏡下大體觀察 全部大鼠于造模20 d后取耳泡觀察，取材時(shí)顯微鏡下見包括二注射組大鼠在內(nèi)全部中耳腔清潔，中耳及內(nèi)耳無炎癥、纖維化、出血等反應(yīng)。

2.3 耳蝸鋪片觀察 全部大鼠在噪音暴露后20 d行耳蝸鋪片觀察。TRPC6治療組和空病毒組大鼠在熒光顯微鏡下和激光共聚焦顯微鏡下觀察，從耳蝸底圈到頂圈均可見清晰輪廓GFP陽性表達(dá)毛細(xì)胞，二微注射組大鼠的內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞都有不同程度的損傷。頂圈毛細(xì)胞缺失最多，中圈次之，底圈最少量缺失。這不同于一些文獻(xiàn)報(bào)道和基底膜行波理論，我們認(rèn)為可能和耳蝸鋪片時(shí)器械是由蝸頂往下推，造成Corti器的機(jī)械損傷有關(guān)，因此我們?cè)趫D片對(duì)比中選取耳蝸中圈鋪片進(jìn)行對(duì)比，以避免操作因素的干擾。TRPC6組與空病毒組相比毛細(xì)胞缺失較輕。對(duì)照組耳蝸鋪片未見熒光表達(dá)細(xì)胞(見圖1)。

噪音暴露后20 d耳蝸鋪片觀察(中圈)，A1、A2： TRPC6組；B1、B2：空病毒組；毛細(xì)胞呈現(xiàn)較明顯的GFP綠色熒光(紅色為激光共聚焦顯微鏡下觀察)×200，TRPC6組較空病毒組毛細(xì)胞缺失減輕；C：對(duì)照組，耳蝸鋪片未見細(xì)胞熒光表達(dá)。圖1 大鼠耳蝸中圈鋪片

3 討論

近年來在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中毛細(xì)胞再生研究有所突破性的成果，如通過調(diào)節(jié)ATOH1表達(dá)誘導(dǎo)了毛細(xì)胞再生[2，8]。但這種實(shí)驗(yàn)中的毛細(xì)胞再生還完全不能等同聽力的恢復(fù)。楊等因此提出了一個(gè)時(shí)間窗的感念，即損傷后10～12d不能修復(fù)將導(dǎo)致毛細(xì)胞不可逆死亡[8]。基因治療是目前內(nèi)耳治療最有前景的方式：編碼好的外源性功能基因，通過載體(病毒、非病毒)導(dǎo)入內(nèi)耳，在內(nèi)耳中表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，從而保護(hù)和再生毛細(xì)胞[9]。基因轉(zhuǎn)染后持續(xù)表達(dá)，解決了功能蛋白局部直接注射成本高、容易降解等難題的限制。同時(shí)耳蝸空間狹小，相對(duì)獨(dú)立，又有多種屏障維持內(nèi)耳微環(huán)境穩(wěn)定，內(nèi)耳又充滿了淋巴液，這些特點(diǎn)使內(nèi)耳非常適合基因?qū)?，并在迷路?nèi)轉(zhuǎn)染，同時(shí)由于蝸殼和血迷路屏障使內(nèi)耳相對(duì)隔絕，減少了病毒的副作用[10]。因此，基因治療具有良好的應(yīng)用前景[11]。

內(nèi)耳基因遞送核心技術(shù)是導(dǎo)入途徑和有效基因載體?；?qū)胪緩侥壳爸饕斜Ａ敉暾麍A窗膜，通過圓窗膜半滲透膜特性方式導(dǎo)入，和開放耳蝸通過微注射或滲透泵持續(xù)灌注方式。圓窗膜滲透方式損傷小，在保護(hù)內(nèi)耳結(jié)構(gòu)方面有優(yōu)勢(shì)，但選擇性透過的特點(diǎn)使其存在相對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)成功率低的問題。微注射途徑需要開放耳蝸，該途徑轉(zhuǎn)染率高，但也存在藥物因?yàn)槟┒说亩亴?dǎo)水管與蛛網(wǎng)膜下腔相通而進(jìn)入腦脊液，造成藥物濃度降低以及污染腦脊液可能[12]。微注射位置主要為經(jīng)圓窗膜和耳蝸底轉(zhuǎn)開放，理論上兩者都有一定的內(nèi)耳損傷，但都仍在可接受范圍。經(jīng)耳蝸底轉(zhuǎn)打孔的方法可轉(zhuǎn)導(dǎo)入前庭階，較圓窗膜途徑轉(zhuǎn)染更迅速，耳蝸及前庭均可獲得了良好轉(zhuǎn)染，而通過圓窗導(dǎo)入一周后轉(zhuǎn)染僅局限于耳蝸[13]，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為圓窗途徑對(duì)內(nèi)耳影響更小[14]。本文研究圓窗途徑，噪音暴露后10d和20d，空病毒組和對(duì)照組大鼠的ABR均值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，驗(yàn)證圓窗膜開孔方法的微創(chuàng)、安全。近年來，也有學(xué)者提出經(jīng)半規(guī)管開口導(dǎo)入途徑可以完全避免感音功能損傷，對(duì)嚙齒動(dòng)物來說，半規(guī)管容易暴露，壁軟，針頭可直接刺入。但由于半規(guī)管容積較小[15]，也存在操作中不確定進(jìn)入膜迷路內(nèi)淋巴還是外淋巴腔隙中，和導(dǎo)入的病毒容易滲漏的缺點(diǎn)[16]。

用于導(dǎo)入基因的載體有非病毒和病毒載體：非病毒載體具有低毒，無免疫原性的，所攜帶的基因不整合到宿主細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)[17]，其中納米材料也有相對(duì)高的轉(zhuǎn)染率[18]。病毒載體有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒等。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期細(xì)胞，而且容量有限。腺病毒載體能夠容納較大的外源基因片斷，然而其轉(zhuǎn)染后可產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此腺病毒治療潛力僅限于誘發(fā)免疫反應(yīng)[19]。慢病毒載體是單鏈RNA病毒，可以感染分裂期、非分裂期細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率高。其可將目的基因整合入細(xì)胞基因組中，在細(xì)胞中長(zhǎng)期、高效且穩(wěn)定地表達(dá)，慢病毒不產(chǎn)生任何有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答[20-21]。EGFP作為報(bào)告基因，可顯示轉(zhuǎn)染效率[22]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到，使用慢病毒載體，術(shù)后20d，熒光顯微鏡下TRPC6組和EGFP空病毒組耳蝸基底膜、毛細(xì)胞均呈現(xiàn)較明顯的免疫熒光顯示。在激光共聚焦顯微鏡下，亦可見耳蝸組織獲得良好的傳染。這些結(jié)果表明慢病毒載體介導(dǎo)了TRPC6基因成功轉(zhuǎn)染耳蝸，并在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

耳蝸微環(huán)境的穩(wěn)定主要依賴K+循環(huán)、Ca2+循環(huán)和谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)的共同維持。其中Ca2+在耳蝸內(nèi)廣泛分布，具有第二信使作用，各種因素的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，均可引發(fā)細(xì)胞損傷[23]。TRPC6可以通過磷酸化的CREB(cAMP)和降低Ca2+超載實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血神經(jīng)元的保護(hù)。目前噪聲性聾的代謝損傷理論主要是噪聲導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞、內(nèi)環(huán)境發(fā)生一系列病理生理改變[23]：在噪聲暴露條件下，毛細(xì)胞發(fā)生去極化，引起毛細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。胞漿內(nèi)游離Ca2+過多改變了外毛細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)特性而導(dǎo)致機(jī)-電轉(zhuǎn)換過程發(fā)生病理改變。而轉(zhuǎn)染后過表達(dá)的TRPC6離子通道可有效降低胞內(nèi)鈣離子濃度的超載，促進(jìn)了毛細(xì)胞修復(fù)。

總之,本實(shí)驗(yàn)中，TRPC6基因?qū)朐胍粜悦@大鼠后ABR閾值恢復(fù)較空病毒組和對(duì)照組更好，噪音暴露后20d，耳蝸基底膜鋪片可見：在顯微鏡下有熒光蛋白表達(dá)的毛細(xì)胞，數(shù)量較多。該結(jié)果提示：TRPC6基因成功導(dǎo)入大鼠耳蝸并表達(dá)，可通過直接促進(jìn)毛細(xì)胞的損傷后的修復(fù)，對(duì)噪音性等聽力損失起到有效的治療作用。