◎ 馮慧慧,楊亞琴,余明霞,曹 秀,李圓圓,郝學(xué)飛
(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(鄭州),河南 鄭州 450002)
隨著人們生活水平的提高,畜禽肉類食品在人們?nèi)粘o嬍辰Y(jié)構(gòu)中所占的比例逐漸增大,隨之而來的畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留問題引起了人們高度的重視。由于現(xiàn)在畜禽產(chǎn)品養(yǎng)殖規(guī)模大、密度高,疾病傳播速度快,為有效預(yù)防和控制疾病的發(fā)生和發(fā)展,抗生素類[1]、抗病毒類[2]等藥物的使用在養(yǎng)殖業(yè)中已經(jīng)不可避免。但由于某些養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)員專業(yè)技能不足,缺少獸藥使用的專業(yè)知識(shí),沒有嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行投放,或者沒有控制好藥物的使用量和時(shí)間,造成獸藥在養(yǎng)殖業(yè)中濫用,導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品體內(nèi)的藥物經(jīng)食用后在人體富集,對(duì)人體健康構(gòu)成威脅。
目前國內(nèi)關(guān)于畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[3-5]大多是針對(duì)單一類別化合物的檢測(cè),完成一個(gè)樣品多種獸藥殘留檢測(cè)需要進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn),存在耗時(shí)、耗力、污染環(huán)境且效率低等問題;且現(xiàn)在所用的獸藥呈現(xiàn)多樣化特征,結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異較大,多種藥物同時(shí)檢測(cè)成為獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)的難題。近年來,研究者一直在探索更簡單、更準(zhǔn)確的方式進(jìn)行檢測(cè),多種獸藥殘留同時(shí)檢測(cè)技術(shù)也取得一定進(jìn)展[6-17]。
本研究是以雞肉為基質(zhì),對(duì)40種獸藥進(jìn)行同時(shí)分析,在前處理方法中結(jié)合使用津楊公司新型強(qiáng)效除脂型ECS固相萃取柱進(jìn)行凈化,研制出了前處理簡單易操作、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方案,節(jié)約了檢測(cè)成本,大幅度提高了檢測(cè)效率,為雞肉中多種獸藥快速篩查工作提供技術(shù)支持。
Shimadzu LC-MS/MS 8050液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司);色譜柱C18柱(100 mm×2.0 mm,3 μm)(日本資生堂公司);PGC 4502i電子天平[精確至0.01 g,艾德姆衡器(武漢)有限公司];AE 240電子天平[精確至0.01 mg,梅特勒-托利多公司];飛鴿GL-21B高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);QGC-36T氮?dú)獯蹈蓛x(上海泉島公司);SKQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);SK-1快速混勻器(金壇市白塔新寶儀器廠);Milli-Q超純水儀(美國Milliore公司)。
乙腈、甲醇:色譜純(德國Merck公司);甲酸銨:色譜純(德國CNW公司);甲酸:色譜純(賽默飛世爾科技公司);固相萃取柱:ECS(200 mg/ 6 mL,吳橋津楊過濾器材廠);40種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品 (德國Dr. Ehrensorfer公司和BE PURE公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水;雞肉樣品:市售。
(1)樣品提取。準(zhǔn)確稱取事先均質(zhì)好的雞肉樣品2 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,渦旋混勻1 min,室溫下超聲提取30 min,于高速離心機(jī)8 000 r·min-1離心5 min,取上清液待過柱凈化。
(2)樣品凈化。將全部上清液轉(zhuǎn)移至ECS固相萃取柱凈化,保持流速1~2滴/s,收集全部濾液,40 ℃氮?dú)獯抵两桑尤?.5 mL乙腈超聲溶解,補(bǔ)加0.5 mL的0.2%甲酸水溶液,渦旋混勻,過0.22 μm微孔濾膜,待上機(jī)測(cè)定。
1.4.1 色譜條件
色譜柱:資生堂C18柱(100 mm×2.0 mm,3 μm); 柱溫:40 ℃;進(jìn)樣體積:2 μL;流動(dòng)相A路:5 mmol·L-1甲酸-甲酸銨水溶液;流動(dòng)相B路:甲醇∶乙腈(V∶V=1∶1);流速:0.2 mL·min-1;梯度洗脫程序見表1。
表1 液相梯度洗脫程序表
1.4.2 質(zhì)譜條件
電離方式:ESI(除地塞米松為負(fù)離子模式,其他化合物均為正離子模式);掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);霧化氣:空氣,3.0 L·min-1;干燥氣:氮?dú)猓?0.0 L·min-1;加熱氣:空氣,10.0 L·min-1;離子源接口溫度:300 ℃;脫溶劑管溫度:250 ℃;加熱模塊溫度:400 ℃;各化合物質(zhì)譜采集信息詳見表2。
表2 40種化合物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)表
續(xù)表2
取5份空白雞肉經(jīng)前處理氮吹近干后的殘余物,依次配制加入2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1和50 ng·mL-1的40種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL,完全溶解后制得空白雞肉匹配基質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作液總離子流圖見圖1。
圖1 40種藥物總離子流圖
以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),各個(gè)化合物定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,40種藥物的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99。
將空白雞肉樣品進(jìn)行2.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1濃度加標(biāo)后,按照上述前處理方法處理后上機(jī),平行測(cè)定6份樣品,考察回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),具體結(jié)果見表3。
表3 40種化合物添加回收率和RSD結(jié)果表(單位:%)
續(xù)表3
采用向空白雞肉樣品中逐級(jí)降低添加目標(biāo)化合物的方法來確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。以定量離子3倍信噪比(S/N=3)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)化合物濃度作為檢出限,以10倍信噪比(S/N=10)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度為定量限。40種藥物的定量限為0.2~1.0 μg·kg-1,均可滿足日常檢測(cè)的要求。
用本文所建立的方法,對(duì)超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上購買的15份雞肉樣品進(jìn)行檢測(cè),有1份樣品檢出恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶,含量分別為8.74 μg·kg-1和40.6 μg·kg-1,均未超過食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 31650—2019)對(duì)于食品中獸藥殘留最大限量要求,為合格樣品。檢測(cè)過程中通過空白添加的方式進(jìn)行質(zhì)控,其中恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶的回收率分別為90.2%和85.4%,符合國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)回收率范圍的要求,進(jìn)一步說明該方法數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠,適用于雞肉中多種獸藥殘留同時(shí)檢測(cè)。
根據(jù)40種獸藥的化學(xué)性質(zhì),通過電噴霧離子源正離子和負(fù)離子模式掃描分析得到40種獸藥的前體離子;再對(duì)前體離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描得到產(chǎn)物離子,選取其中豐度最強(qiáng)、干擾較小的2個(gè)離子碎片作為監(jiān)測(cè)離子,并對(duì)其電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。
針對(duì)所檢測(cè)藥物的性質(zhì),多種獸藥殘留檢測(cè)時(shí)多選擇甲醇、乙腈等溶液或不同酸度的甲醇、乙腈作為提取溶劑。本文比較了甲醇和乙腈作為提取劑時(shí)的實(shí)驗(yàn)過程和回收率(加標(biāo)含量為10.0 μg·kg-1),當(dāng)選用甲醇作為提取劑時(shí),發(fā)生提取液出現(xiàn)白色渾濁、用固相萃取柱凈化時(shí)速度偏慢等問題,說明其沉淀蛋白和去除脂肪的能力較弱,且回收率低于用乙腈作為提取液時(shí)的回收率。隨后又考察不同酸度的乙腈(乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.2%甲酸-乙腈、0.5%甲酸乙腈)作為提取劑,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著酸度不斷提高,喹諾酮類化合物的回收率呈小幅度上升趨勢(shì),但磺胺類藥物回收率隨著酸度增加呈下降趨勢(shì),其他種類藥物變化不大。統(tǒng)籌考慮,實(shí)驗(yàn)選用乙腈做為提取劑,提取效果優(yōu)于其他提取試劑的提取效果。
本實(shí)驗(yàn)中所采用津楊過濾器材廠提供的新型ECS固相萃取柱進(jìn)行凈化,能夠有效去除雞肉中蛋白、脂肪、磷脂等干擾物,減少對(duì)目標(biāo)化合物的影響。與傳統(tǒng)的固相萃取柱相比,不需要活化、淋洗、洗脫等步驟,節(jié)約人力和大量的有機(jī)試劑,減少人體傷害和環(huán)境污染。
本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用新型固相萃取柱凈化,通過對(duì)前處理?xiàng)l件和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化,最終建立了同時(shí)檢測(cè)雞肉中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、抗病毒類、鎮(zhèn)定劑及糖皮質(zhì)激素等6大類共40種藥物的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)方法,并對(duì)所建方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證和實(shí)際樣品檢測(cè),進(jìn)一步驗(yàn)證該方法適用于大批量雞肉樣本中多種獸藥殘留同時(shí)檢測(cè)的需要,能夠快速、準(zhǔn)確提供檢測(cè)數(shù)據(jù),為有效控制雞肉產(chǎn)品質(zhì)量提供技術(shù)支撐,保障食品安全。