牛蒡根提取物指紋圖譜研究

吳瓊，馬群，胡北，崔亞玲，何靜，王卓，許子華（北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，沈陽 110016）

牛蒡根，又稱惡實根，為菊科牛蒡?qū)僦参锱］駻rctium lappaL.的肉質(zhì)直根，牛蒡主要分布于廣西、山東、安徽、遼寧、湖北、浙江等地，有去熱、消腫的功效[1]，常用于感冒、頭痛、咳嗽、咽喉腫痛等疾病。中藥是以多組分多靶點的作用方式對機體代謝網(wǎng)絡(luò)綜合作用而產(chǎn)生結(jié)果，因此用中藥的指紋圖譜來結(jié)合指標(biāo)成分含量對中藥材進行質(zhì)量控制，既可量化、綜合性地闡述中藥的特征，又可以彌補單一有效成分定量控制模式的缺陷[2]。中藥成分復(fù)雜，分離和測定均有一定的難度，因此能否選擇主要的藥物成分進行準(zhǔn)確的分析，直接關(guān)系到對于該中藥質(zhì)量的評價[3]。并且考慮到實際應(yīng)用的情況，成分是否可測又是指標(biāo)成分選擇的前提[4]。近年來，隨著多種多樣的儀器分析技術(shù)的出現(xiàn)，以及其在天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用，牛蒡根中發(fā)現(xiàn)了越來越多的綠原酸類化合物[5]，目前主要發(fā)現(xiàn)的已分離出來的化合物有1，5-二咖啡酰-3-蘋果?？崴?、3，5-二咖啡酰-1-（2-咖啡酰-4-蘋果酰甲酯）-奎尼酸、3，5-二咖啡酰-1-（2-咖啡酰-4-蘋果酰）-奎尼酸等[6]。有藥理學(xué)研究表明，該類化合物具有明顯的神經(jīng)保護、抗癌、抗菌、抗氧化、降血脂及免疫調(diào)節(jié)等作用[7-14]。筆者通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)，目前對牛蒡根藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研究尚不完整，對其化學(xué)成分的測定方法和指紋圖譜研究尚淺。

中藥指紋圖譜是一種綜合的、宏觀的、可量化的手段，可反映中藥化學(xué)成分的整體組成和特征。為進一步完善牛蒡根藥材質(zhì)量評價體系，本研究參考相關(guān)文獻[15-16]，采用高效液相色譜（HPLC）法建立了14 批牛蒡根藥材的HPLC 指紋圖譜，得到能夠標(biāo)示其特性的共有色譜峰圖譜，為牛蒡根藥材的應(yīng)用及其內(nèi)在質(zhì)量的均一性提供全面的質(zhì)量控制依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-16 系列高效液相色譜儀（SPD-16型紫外檢測器、LC-16 型泵、SIL-16 型進樣器、CTO-16 型柱溫箱）（日本島津儀器有限公司）；Shimadzu AUW 120 D 十萬分之一分析天平（日本Shimadzu 公司）；2012 版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（國家藥典委員會）；KQ3200 型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司，150 W，40 kHz）；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（安捷倫）。

1.2 試藥

3，5-二咖啡?？鼘幩釋φ掌罚℉PLC 純度，四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq20020403，純度≥98%）；甲醇、乙腈（色譜純，Sigma 公司）；磷酸（分析級，天津永大化學(xué)試劑有限公司）；95%乙醇（美華公司，沈陽市遼河化工廠）；雙蒸水為自制。

14 批牛蒡根藥材，產(chǎn)地分別為遼寧、山東、安徽、浙江、江西、吉林、廣西、河北、湖北。將各產(chǎn)地編號為S1 ～S14，其中，S1（批號：191115）、S2（批號：191001）產(chǎn)地為安徽；S3（批號：191026）、S4（批號：20191103）產(chǎn)地為廣西；S5（批號：191225）產(chǎn)地為河北；S6（批號：191101）、S7（批號：191201）產(chǎn)地為湖北；S8（批號：191210）產(chǎn)地為吉林；S9（批號：191210）產(chǎn)地為江西；S10（批號：20200326）產(chǎn)地為遼寧；S11（批號：200301）、S12（批號：200115）、S13（批號：200322）產(chǎn)地為山東；S14（批號：200325）產(chǎn)地為浙江。藥材購于遼寧九州通醫(yī)藥有限公司、亳州三峰中藥飲片有限公司。經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥檢室何靜副主任藥師鑒定為菊科植物牛蒡Arctium lappaL.的干燥塊根。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.4%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 ～25 min，10%→15%B；25 ～35 min，15%→20%B，35 ～60 min，20%→30%B）；流速1.0 mL·min－1；檢測波長330 nm；柱溫35℃；檢測時間為60 min；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取適量3，5-二咖啡?？鼘幩釋φ掌罚芊Q定，置于棕色量瓶中，加入少量甲醇，振搖使溶解，后加甲醇定容至刻度，制成每1 mL 含有3，5-二咖啡?？鼘幩?5 μg 的溶液，即得對照品溶液。

2.2.2 牛蒡根提取物的制備 稱取各產(chǎn)地的牛蒡根藥材適量置于圓底燒瓶中，加入10 倍量55%乙醇溶液浸泡過夜，次日回流提取，每次2 h，共2 次，合并提取液并過濾，分產(chǎn)地合并提取液。將各產(chǎn)地的提取液分別加熱濃縮至含藥材1 g·mL－1，4 ℃冰箱保存。

2.2.3 供試品溶液的制備 取濃縮后的提取液4 mL，置10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇定容，靜置24 h，取上清液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜

2.3.1 精密度試驗 取牛蒡根提取物（S6）樣品溶液，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖，將圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系》（2012 版），計算相似度，相似度均為1.000。以6 號峰的保留時間（tR）和峰面積（A）為參照，計算得其他各共有峰相對于6 號峰的tR和A，結(jié)果顯示指紋圖譜中11 個共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD值分別小于0.24%、3.7%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取牛蒡根提取物（S6）樣品溶液，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣，按“2.1”項下色譜條件記錄色譜圖。將其導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系》（2012 版），得到各個樣品的相似度，結(jié)果顯示相似度均大于0.999。以6 號峰的相對保留時間（tR）和相對峰面積（A）為參照，計算得其他各共有峰相對于6 號峰的tR和A的RSD值分別小于0.32%、5.5%，表明牛蒡根提取物供試品溶液在常溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取牛蒡根提取物（S6）樣品溶液，按照“2.2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。將圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系》（2012 版），得到各個樣品的相似度，結(jié)果顯示均大于0.999，以6 號峰的相對保留時間（tR）和相對峰面積（A）為參照，計算得其他各共有峰相對于6 號峰的tR和A的RSD分別小于0.090%、5.0%，表明該種分析方法的重復(fù)性良好。

2.3.4 指紋圖譜建立 取14 批不同產(chǎn)地的藥材，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，根據(jù)“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄HPLC 色譜圖，樣品的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 版）軟件進行分析，以中位數(shù)法生成對照圖譜，時間窗寬度為0.1 min，經(jīng)多點校正、自動匹配后生成牛蒡根提取物指紋圖譜的共有模式如圖1，對照指紋圖譜見圖2。

圖1 14 批次牛蒡根提取物的指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints of 14 batches of Arctium lappa L.root

圖2 牛蒡根提取物HPLC 對照指紋圖譜Fig 2 Common HPLC model fingerprint of Arctium lappa L.root

2.3.5 共有峰的標(biāo)定 通過對14 批牛蒡根提取物中的共有峰進行比對分析，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系》（2012 版）的數(shù)據(jù)匹配功能，在對照指紋圖譜上標(biāo)定共有峰，牛蒡根提取物HPLC 指紋圖譜共有11 個共有峰。同時與對照品色譜圖（見圖3）比對，可確認(rèn)6 號峰為3，5-二咖啡酰奎寧酸。選擇出峰時間適中、峰面積較大、對稱性較好的6 號峰作為參照峰（S），分別計算其他各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果見表1和表2。

表1 牛蒡根提取物共有峰的相對保留時間Tab 1 Relative retention time of common peaks of Arctium lappa L.root

表2 牛蒡根提取物共有峰的相對峰面積Tab 2 Relative peak areas of common peaks of Arctium lappa L.root

圖3 對照品3，5-二咖啡?？鼘幩岬纳V圖Fig 3 HPLC chromatogram of 3，5-dicaffeoylquinic acid

2.3.6 相似度評價 將各個批次的牛蒡根提取物指紋圖譜分別導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 版）軟件，對各批次樣品的指紋圖譜與對照圖譜進行相似度評價。從圖1可以看出14 批牛蒡根藥材的整體圖貌基本一致。14 個產(chǎn)地的牛蒡根藥材的相似度達到了0.966，有較好的相似性，見表3。

表3 牛蒡根提取物相似度Tab 3 Similarity of Arctium lappa L.root

2.3.7 系統(tǒng)聚類分析 分別將14 批牛蒡根提取物樣品的HPLC 指紋圖譜中各自的共有峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 17.0 統(tǒng)計分析軟件，采用組間聯(lián)接法，以歐式平方距離作為分類的依據(jù)，對樣品進行聚類分析，結(jié)果見圖4。當(dāng)歐氏距離大于10時，14 批牛蒡根藥材主要被聚為兩類，Ⅰ類包括S1 ～S9、S11 ～S14，各個批次的樣品相似度較高（0.981 ～0.999），產(chǎn)地包括山東、安徽、浙江、江西、吉林、廣西、河北、湖北，Ⅱ類為S10（遼寧產(chǎn)地，相似度0.966）。表明這14 批樣品不完全相同，存在一定差異，但差異不大（整體在0.966 以上）。

圖4 14 批藥材指紋圖譜聚類分析的樹狀圖Fig 4 Dendrogram of hierarchical clustering analysis of 14 batches of samples

3 討論

本研究對牛蒡根檢測的色譜條件進行了選擇及優(yōu)化，分別考察了甲醇/水、乙腈/水、甲醇/磷酸水、乙腈/磷酸水不同比例洗脫溶劑對HPLC 色譜圖的影響，結(jié)果顯示乙腈-0.4%磷酸水為較優(yōu)溶劑；并進行了全波長掃描，結(jié)果顯示330 nm 下色譜峰的數(shù)量較多，峰面積較大且分離度較好，故選擇330 nm 作為檢測波長。

對提取方法進行考察，比較了提取溶劑（水、甲醇、乙醇）和不同濃度乙醇（55%乙醇、65%乙醇、75%乙醇）溶液的提取效果。發(fā)現(xiàn)以55%的乙醇溶液為溶劑加熱回流提取120 min，提取效果最優(yōu)。同時比較了多種流動相的比例對于牛蒡根提取物的分離效果，結(jié)果表明使用乙腈（B）-0.4%磷酸水（A）梯度洗脫：0 ～25 min，10%～15%B；25 ～35 min，15% ～20%B；35 ～60 min，20%～30%B，并使用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱可以使樣品中各組分得到良好的分離，且保留時間適中。該方法簡潔方便，易于操作，還可減少對色譜儀的損耗，可準(zhǔn)確測定牛蒡根藥材中的指標(biāo)成分。

指紋圖譜中11 個共有峰相對保留時間的RSD值均小于 1.2%，表明本文建立的指紋圖譜研究方法為一種穩(wěn)定的共有模式，可以作為牛蒡根藥材品質(zhì)評價的方法。14 批樣品相對峰面積RSD值較大，說明各批樣品間組分含量差異較大，提示牛蒡根的品質(zhì)與其產(chǎn)地密切相關(guān)，需對牛蒡根化學(xué)成分進行含量測定，闡明藥材品質(zhì)與產(chǎn)地之間的關(guān)系，進一步為臨床使用牛蒡根提供依據(jù)。

從相似度分析結(jié)果可知，除 S10（遼寧）外，其他相似度均在 0.98 以上，說明不同產(chǎn)地的牛蒡根藥材存在一定差異，但差異不大。同時從聚類分析結(jié)果可知，14 批牛蒡根藥材聚為兩類，區(qū)域特征不明顯，與相似度分析結(jié)果相一致，說明牛蒡根藥材質(zhì)量穩(wěn)定。

HPLC 在檢測中藥等物質(zhì)中有很高的的應(yīng)用價值，可以清晰指認(rèn)分離藥物中的各類活性物質(zhì)[17]。本文通過建立牛蒡根藥材的HPLC 指紋圖譜，9 個產(chǎn)地的牛蒡根藥材的圖譜整體外形相近，且相似度也達到了0.966 以上，有較好的相似性。所建立的指紋圖譜，共有峰數(shù)目達到11 個，且分離度較好、保留時間合適，相鄰色譜峰之間的分離度較高，色譜峰強度也較大，且根據(jù)方法學(xué)的驗證結(jié)果均滿足要求。綜上可采用HPLC 法對牛蒡根藥材進行質(zhì)量把控，并對牛蒡根藥材進行綜合宏觀分析，可促進牛蒡根藥材及其相關(guān)制劑的研發(fā)并對其質(zhì)量的控制得到全面提高。