HPLC-FLD法測定不同產(chǎn)地林蛙卵和林蛙油中雌二醇的含量

劉芳馨，王月潔，許佳明，李季澤，趙寰宇，徐陽，鮑慧瑋*（.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春307；.白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系，吉林 白城 37000）

中國林蛙（Rana temporaria chensinensisDavid）是一種廣泛分布于中國東北的兩棲動物[1]，是我國傳統(tǒng)名貴補品，最早記載于《飲片新參》[2-3]，性涼、味咸、入肺腎經(jīng)，具有養(yǎng)肺滋腎的功效。中國林蛙中雌蛙輸卵管干燥后取其脂肪狀物即為林蛙油，去油后殘留大量副產(chǎn)物，如林蛙卵等。林蛙卵和林蛙油中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、脂肪酸等營養(yǎng)成分[4-6]，具有降血脂、抑制血小板聚集、抗自由基等作用，林蛙油被稱為“軟白金”“林中之寶”“動物人參”“北方燕窩”[7-9]。

雌二醇（estradiol，E2，結(jié)構(gòu)見圖1）是林蛙卵和林蛙油中最具代表性的甾體類激素[10]，它可以緩解因為年齡增長、機體功能下降而導(dǎo)致的雌激素分泌不足[11-12]，此外，雌激素還能影響機體的代謝、促進子宮的蛋白質(zhì)合成等[13]。由于雌二醇具有熒光吸收特性，因此本文建立HPLC-FLD法測定不同產(chǎn)地林蛙卵和油中雌二醇的含量，為林蛙卵和林蛙油的安全食用、產(chǎn)品研發(fā)提供參考。

圖1 雌二醇化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of estradiol

1 材料

1.1 試藥

東北地區(qū)林蛙油和林蛙卵，從各中藥材市場購買，由長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室肖井雷副教授鑒定為蛙科動物中國林蛙Rana temporaria chensinensisDavid 雌蛙的干燥輸卵管和卵，來源見表1。雌二醇對照品（批號：100182-201205，含量以98%計，中國食品藥品檢定研究院）。

甲醇[色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；磷酸（分析純，北京化工廠）；純凈水（杭州娃哈哈股份有限公司）。

1.2 儀器

Agilent LC1100 高效液相色譜儀，配備FLD檢測器（美國安捷倫公司）；鼎力DFY-500（搖擺式）多功能高速中藥粉碎機（溫州頂力醫(yī)療器械有限公司）；DHG-9123A 型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；KQ-250 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（55∶45，V/V）；流速1.0 mL·min－1；柱溫為40℃；熒光檢測器激發(fā)波長為282 nm，發(fā)射波長為315 nm；進樣量為20 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取雌二醇對照品5.42 mg，加甲醇超聲溶解并稀釋至250 mL 量瓶，搖勻，備用；精密吸取1 mL，加甲醇稀釋至10 mL，制得2.168 μg·mL－1雌二醇的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

分別取干燥的林蛙油和林蛙卵樣品，粉碎，過100 目篩，稱取粉末約2 g，加入20 mL 甲醇超聲（250 W，40 kHz）提取30 min，過濾，重復(fù)操作2 次，合并濾液后60 ℃旋轉(zhuǎn)濃縮至5 mL，制得林蛙油和林蛙卵供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

將雌二醇對照品溶液、林蛙油和林蛙卵供試品溶液按照“2.1”項下色譜條件進行分析，得到色譜圖見圖2。其中，在與對照品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上，供試品溶液有相同保留時間的色譜峰，而且待測成分色譜峰與相鄰色譜峰均分離完全，理論塔板數(shù)以雌二醇計算均大于3000。

圖2 林蛙油和林蛙卵的HPLC-FLD 色譜圖Fig 2 HPLC-FLD chromatogram of oil and eggs of Rana Dybowskii

2.5 方法學(xué)試驗

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密移取“2.2”項下雌二醇對照品溶液0.1、0.5、1、2.5、5、10 mL，加甲醇至10 mL，制得6 個不同質(zhì)量濃度的雌二醇對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣分析。以雌二醇濃度為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸，得到回歸方程為Y＝523.6X－61.66（r＝0.9999），表明雌二醇質(zhì)量濃度在0.22 ～21.68 μg·mL－1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2 精密度試驗 將雌二醇對照品溶液按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6 次，記錄色譜峰面積。計算雌二醇色譜峰面積的RSD值為0.67%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 將林蛙卵供試品溶液室溫放置，分別于0、2、4、6、8、12 h 時按照“2.1”項下色譜條件進行分析，記錄色譜峰面積。計算雌二醇色譜峰面積的RSD值為1.5%，表明林蛙卵供試品溶液在12 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.5.4 重復(fù)性試驗 取批號為JY20180901 的林蛙卵樣品，按照“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。計算雌二醇的平均含量為7.058 μg·g－1，RSD值為1.7%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.5.5 加樣回收試驗 取批號為JY20180901 的林蛙卵樣品6 份，粉碎，每份約1 g，置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入質(zhì)量濃度為7.12 μg·mL－1的雌二醇對照品溶液1 mL，再按照“2.3”項下方法制備，在“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。計算雌二醇的平均加樣回收率為100.4%，RSD值為1.4%，表明該方法具有良好的準確度。

2.6 樣品含量測定

稱取9 個批次的林蛙卵和林蛙油樣品各約2 g，分別制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進行測定，結(jié)果見表1。

表1 林蛙中雌二醇含量(μg·g－1，n ＝3)Tab 1 Estradiol content in Rana Dybowskii (μg·g－1，n ＝3)

3 討論

林蛙卵和林蛙油中主要含有的激素類成分為乙酸雄甾酮、前列腺素、美屈孕酮、雌二醇等，其中雌二醇含量較高[10]，且具有良好的藥效作用。本文建立HPLC-FLD 法測定林蛙卵和林蛙油中雌二醇的含量，并對不同產(chǎn)地9 批林蛙卵和林蛙油樣品進行測定，發(fā)現(xiàn)不同批次樣品中雌二醇含量差異比較大，且總體雌二醇含量較低。雖然動物藥的差異性較大，但是建立的含量測定方法仍可快速、穩(wěn)定地檢測出雌二醇的含量，可作為監(jiān)控林蛙卵和林蛙油中雌激素水平及評價林蛙卵和林蛙油質(zhì)量的依據(jù)。

本試驗曾考察了色譜柱型號（Extend C18色譜柱、Alltima C18色譜柱、Agilent TC C18色譜柱），流動相體系（甲醇-水、乙腈-水），色譜柱溫度（30、35、40、45℃）和流速（1.0、1.5、2.0 mL·min－1）對雌二醇色譜峰分離度、峰形、出峰時間的影響[14-16]，結(jié)果采用本研究色譜條件時得到的色譜峰峰形最佳，與相鄰色譜峰分離最完全，且出峰時間適中，適合作為林蛙卵和林蛙油中雌二醇檢測的色譜條件。

在檢測器和檢測波長選擇時，對比了熒光檢測器和紫外檢測器，紫外檢測器較為常用，但是對于一些具有熒光的物質(zhì)，熒光檢測器的靈敏度更高，更適用于一些較低含量的熒光物質(zhì)，故本試驗選擇熒光檢測器測定林蛙油和林蛙卵中含量較低的雌二醇。采用HPLC-FLD 法測定雌二醇，并對激發(fā)波長和發(fā)射波長進行篩選，最終發(fā)現(xiàn)熒光檢測器激發(fā)波長為282 nm，發(fā)射波長為315 nm，測定效果較好，雌二醇色譜峰有較高吸收，與附近色譜峰分離較好。

在供試品提取方法選擇時，分別考察超聲提取法、回流提取法、浸漬提取法，其中超聲提取法和回流提取法提取效果最佳，而超聲提取法在提取效率方面更具優(yōu)勢。隨后考察不同提取溶劑，例如甲醇、95%乙醇、無水乙醇等，最終發(fā)現(xiàn)甲醇提取效果最佳，干擾較少。