高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定骨炎消方中8種有效成分的含量

李田洋，楊婷婷，張琪，王寶娟，鄭曙光*（.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽 55005；.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴陽 55000）

骨炎消方為貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方，由狗脊、透骨香、飛龍掌血、蜘蛛香、大血藤、小血藤、黑骨藤、雞血藤、伸筋草、骨碎補(bǔ)、杜仲、淫羊藿等12 味藥材組成，具有消腫止痛、祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、通氣散血的功效。臨床常用來治療骨性關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死等疾病，療效顯著[1-4]。方中大血藤、小血藤、黑骨藤、雞血藤為藤本類植物，苗醫(yī)認(rèn)為這類植物細(xì)長蔓延與人體的筋脈相似，大都具有舒通筋脈和通氣散血的作用[5]。雞血藤具有補(bǔ)血的功用[6]，為軟骨提供所必須的物質(zhì)；杜仲、狗脊能補(bǔ)腎強(qiáng)骨，狗脊還可祛風(fēng)除濕；蜘蛛香、透骨香能祛風(fēng)除濕、表出毒邪，使機(jī)體祛除“外毒內(nèi)亂”，恢復(fù)正常的狀態(tài)，蜘蛛香還能理氣和中、調(diào)理脾胃，使氣血能夠得到不斷的補(bǔ)充；飛龍掌血、伸筋草舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)除濕、消腫解毒；淫羊藿、骨碎補(bǔ)補(bǔ)腎強(qiáng)骨，活血止痛。諸藥合用，既能調(diào)節(jié)內(nèi)亂，排除毒素又能打通筋脈，提供氣、血，達(dá)到治愈疾病的目的。

本課題組前期已進(jìn)行骨炎消方制備工藝及臨床療效研究[7-9]，尚未見其有效成分含量測(cè)定的報(bào)道。為了更有效地控制骨炎消方的質(zhì)量，提高臨床療效，本研究建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定骨炎消方中原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、表兒茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹內(nèi)酯等8 種成分的含量，以期為骨炎消方的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為民族民間驗(yàn)方藥物制劑的進(jìn)一步研發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；超聲波清洗器（上海喬躍電子有限公司，JOYN-10A）；水浴鍋（上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DRHH-S8）；萬分之一天平（梅特勒-托利多上海有限公司，ME204E）；十萬分之一天平（日本島津公司，ADW120D）；循環(huán)水式多用真空泵（鄭州科達(dá)機(jī)械儀器設(shè)備有限公司，SHZ-111）。

1.2 試藥

狗脊（批號(hào)：190501）、大血藤（批號(hào)：190301）、小血藤（批號(hào)：190601）、雞血藤（批號(hào)：200301）、伸筋草（批號(hào)：190701）、骨碎補(bǔ)（批號(hào)：200401）、杜仲（批號(hào)：200501）、淫羊藿（批號(hào)：191101）飲片（購自貴州同濟(jì)堂中藥飲片有限公司、貴陽德昌祥藥業(yè)有限公司、貴陽同仁堂藥店）；飛龍掌血、蜘蛛香、黑骨藤、透骨香均（購自貴陽市萬東橋藥材市場(chǎng)），以上藥材均經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王波講師鑒定為正品。原兒茶酸（批號(hào)：H21J9Z64031）、綠原酸（批號(hào)：Y20A11K111541）、原兒茶醛（批號(hào)：TO1013FB14）、咖啡酸（批號(hào)：W16O10B100366）、表兒茶素（批號(hào)：K19J9R66088）、柚皮苷（批號(hào)：24N9Z75896）、淫羊藿苷（批號(hào)：T05D9B76755）、茴芹內(nèi)酯（批號(hào)：Y01025SB14）對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%）；乙腈（色譜純，TEDIA 天地試劑公司）；甲醇（色譜純）、磷酸（優(yōu)級(jí)純）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用AgilentSB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0 ～15 min，18%A；15 ～16 min，19%A；16 ～30 min，33%A；30 ～33 min，35%A；35 ～50 min，48%A）， 流速：0.8 mL·min－1；檢測(cè)波長：270 nm；柱溫：28℃。在此條件下，8 種成分分離度較好（見圖1）。

圖1 混合對(duì)照品溶液（A）和供試品溶液（B）的HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of reference solution （A）and sample solution（B）

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、表兒茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹內(nèi)酯對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別 為0.382、0.264、0.182、0.292、0.16、0.298、0.494、0.846 mg·mL－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

稱取12 味藥材各15 g，加8 倍量水，浸泡2 h后煎煮1 h，濾過，保留濾液Ⅰ；藥渣再加入6 倍量的水，煎煮2 次，每次0.5 h，濾過，得濾液Ⅱ；將濾液Ⅰ和濾液Ⅱ合并，攪拌，使其混合均勻后加熱濃縮成浸膏，制作成浸膏干粉備用。取骨炎消浸膏干粉2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取30 min，取出，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密稱取對(duì)照品原兒茶酸4.012 mg、綠原酸3.134 mg、原兒茶醛2.216 mg、咖啡酸2.564 mg、表兒茶素1.786 mg、柚皮苷3.467 mg、淫羊藿苷5.751 mg、茴芹內(nèi)酯6.847 mg，置于50 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 mL 置10 mL 量瓶中加甲醇至刻度，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果表明各化合物在相應(yīng)范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，見表1。

表1 各種成分的線性關(guān)系Tab 1 Linearity of various constituents

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6 次，計(jì)算原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、表兒茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹內(nèi)酯色譜峰峰面積的RSD（n＝6）分別為1.5%、0.76%、1.6%、1.4%、1.5%、1.4%、1.4%、1.5%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48 h 進(jìn)樣，測(cè)得原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、表兒茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹內(nèi)酯色譜峰峰面積RSD分別為1.9%、1.7%、1.4%、1.1%、1.9%、0.51%、1.3%、0.18%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、表兒茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹內(nèi)酯含量的RSD分別為1.3%、1.5%、1.8%、1.2%、0.79%、1.9%、0.81%、2.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱定同一批骨炎消方浸膏粉粉末6 份，各約1 g，分別精密加入混合對(duì)照品溶液（原兒茶酸1.1005 mg·mL－1、綠原酸0.9546 mg·mL－1、原兒茶醛0.4112 mg·mL－1、咖啡酸0.1708 mg·mL－1、表兒茶素0.1597 mg·mL－1、柚皮苷0.9963 mg·mL－1、淫羊藿苷0.8225 mg·mL－1、茴芹內(nèi)酯0.1224 mg·mL－1）各1 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果8 種成分的平均回收率在97.4%～100.4%，RSD在0.72%～2.9%，符合方法學(xué)要求。

2.4.6 樣品的含量測(cè)定 按“2.3”項(xiàng)下方法制備6批供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分的峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg·g－1，n ＝6)Tab 2 Content determination of various constituent (mg·g－1，n ＝6)

根據(jù)《中國藥典》2020年版一部[10]相關(guān)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與6 批藥材測(cè)得結(jié)果，暫定每1 g 骨炎消方浸膏中含原兒茶酸不少于1.15 mg、綠原酸不少于0.95 mg、原兒茶醛不少于0.38 mg、咖啡酸不少于0.15 mg、表兒茶素不少于0.15 mg、柚皮苷不少于0.95 mg、淫羊藿苷不少于0.68 mg、茴芹內(nèi)酯不少于0.085 mg。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的確定

骨炎消方為民間收集的驗(yàn)方，對(duì)其研究主要集中在臨床應(yīng)用[8-9]及單味藥材的報(bào)道[11-17]，尚未建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。骨炎消方中狗脊、杜仲、伸筋草、蜘蛛香、黑骨藤含有的苯丙素類（綠原酸、咖啡酸）和酚類化合物（原兒茶酸、原兒茶醛）具有抗炎、抗風(fēng)濕、鎮(zhèn)痛作用[11，14，18-21]；大血藤、透骨香具有良好的抗炎、止血、鎮(zhèn)痛作用，其主要活性成分為綠原酸[22-24]；雞血藤中主要藥效成分為黃酮類（表兒茶素），具有抗關(guān)節(jié)炎、改善血液循環(huán)等藥理作用[25]。骨碎補(bǔ)指標(biāo)成分柚皮苷有抗炎、改善骨代謝作用，可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化[26]；淫羊藿中的淫羊藿苷可調(diào)節(jié)骨代謝平衡以增強(qiáng)骨密度及強(qiáng)度，同時(shí)可促進(jìn)微血管修復(fù)以改善股骨頭局部血供[27]；飛龍掌血中豐富的香豆素類（茴芹內(nèi)酯）成分對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、出血等有良好的治療作用[28]。結(jié)合骨炎消方臨床上主要用于治療骨性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死等疾病，因此，選取原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、表兒茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹內(nèi)酯作為指標(biāo)成分。

3.2 色譜條件優(yōu)化

本研究考察了甲醇-0.1%磷酸-水、乙腈-0.1%磷酸水和乙腈-水的流動(dòng)相體系及25℃、28℃和30℃三個(gè)柱溫，當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水，柱溫為28℃時(shí)，分離度好，峰形好，基線穩(wěn)定。比較了30%甲醇、60%甲醇、90%甲醇和甲醇的提取效果，結(jié)果甲醇提取效率高，雜質(zhì)干擾小，峰形良好。研究了檢測(cè)波長為210 nm、254 nm、270 nm和310 nm 的色譜峰情況，當(dāng)波長為270 nm 時(shí)色譜峰分離情況良好，基線較平穩(wěn)。

3.3 小結(jié)

本研究首次建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定骨炎消方中原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、表兒茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹內(nèi)酯的含量，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可用于骨炎消方及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。