王 然, 朱傳雪, 岳俊陽, 劉永勝

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

巢湖位于安徽省中部,隸屬長江水系下游湖泊,是我國五大淡水湖之一。由于近年來工業(yè)、農業(yè)及生活廢水的大量排放,使得巢湖水體中氮、磷等元素嚴重超標,富營養(yǎng)化程度加劇,從而導致湖水中藻類生物(主要是藍藻)的異常繁殖,形成水華現象[1-2]。已有研究顯示巢湖藍藻水華的分布具有明顯的季節(jié)性,并且極易受到天氣和風向的影響,但主要集聚于西部水域的湖濱帶[3]。每年夏季,巢湖大面積暴發(fā)的藍藻水華不僅造成水體功能下降和水質性缺水,而且還會散發(fā)強烈的異味,嚴重影響周邊的農業(yè)生產和居民的身心健康[4]。

目前,用于巢湖藍藻治理的主要技術包括物理方法、化學方法和生物方法三大類[5-7]。其中,物理方法(如人工打撈)仍然是水華集中暴發(fā)時的主要除藻手段,卻無法從根本上緩解水華現狀。生物方法因其靈敏長效、環(huán)境友好、生態(tài)安全性高而被認為是一種最具前景的預防治理途徑,但能夠成熟應用的技術還不多,往往處于初始研究階段。因此對巢湖藍藻水華集中暴發(fā)時優(yōu)勢種群的分離、鑒定和生長特性研究至關重要。

微囊藻屬于藍藻門色球臻科徽囊藻屬,是一類全球性分布的藍藻,也是淡水水華中常見的優(yōu)勢藻類[8-9]。巢湖藍藻水華中,微囊藻在數量和發(fā)生頻率上均占優(yōu)勢,并且呈現季節(jié)性特征。文獻[10]研究表明在夏、秋兩季微囊藻在水華藍藻中占絕對優(yōu)勢,其生物量可達7.96×108個/L。微囊藻是小型且沒有鞘包裹的球狀細胞,但在自然水體中,微囊藻細胞通常會相互聚集在一起,形成肉眼可見的群體菌落。根據其在水華發(fā)生過程中是否產生毒素,微囊藻可分為產毒微囊藻和非產毒微囊藻兩類。其中,產毒微囊藻釋放的微囊藻毒素(microcystin,MC)會影響水體中動物和植物的正常生長,甚至能夠通過飲用水和食物鏈等途徑進入人體,引發(fā)肝炎等疾病,嚴重威脅人類的身心健康[11-15]。

本文通過將巢湖水華暴發(fā)時水華區(qū)域的藍藻進行分離、純化鑒定得到巢湖藍藻中的優(yōu)勢菌株銅綠微囊藻,并研究了銅綠微囊藻的產毒特點及在光照、溫度和pH值等不同條件下的生長特性,以探索不同生態(tài)條件對巢湖水華的影響。為預測巢湖水華爆發(fā)時間及多發(fā)水域,并改善巢湖水體的富營養(yǎng)化現狀,減輕水華污染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藍藻的收集

藍藻采集于巢湖水華暴發(fā)時西湖岸周邊的巢湖水體(北緯N31°34′46″,東經E117°18′39″),取樣地點如圖1所示,圖1紅色箭頭指示為取樣地點。

圖1 藍藻水體采樣地點示意圖

1.1.2 培養(yǎng)基的配置

本文共使用了3種不同的培養(yǎng)基,包括BG-11、MA和Knop培養(yǎng)基,3種培養(yǎng)基的pH值分別為7.0、8.0、7.5。培養(yǎng)基配方分別見表1～表3所列。其中,表1中母液質量濃度應稀釋100倍使用。若配置固體培養(yǎng)基,則在相應的液體培養(yǎng)基基礎上添加1.5%的瓊脂。所有培養(yǎng)基都經121 ℃高溫高壓條件下滅菌20 min,而后冷卻備用。

表1 BG-11培養(yǎng)基 單位:g/L

表2 MA培養(yǎng)基 單位:mg/L

表3 Knop培養(yǎng)基

1.2 方法

1.2.1 藻類的分離和純化培養(yǎng)

對采集自巢湖藍藻水華暴發(fā)時的水樣進行離心(5 000 r/min),使湖水、浮渣和藻細胞分層,除去湖水和浮渣,并利用低濃度碳酸氫鈉溶液重懸藻細胞沉淀以洗滌藻類,棄去上清,反復多次至上清透亮為止。最后,用無菌水對獲得的藻細胞重懸,并進行梯度稀釋后,置于BG-11固體培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng)。對于菌落形態(tài)一致,生長占優(yōu)勢的單一菌落進行富集培養(yǎng),而對有雜菌共生、尚未純化的菌落繼續(xù)稀釋劃線,直至菌落形態(tài)一致。

1.2.2 菌種細胞形態(tài)觀察

肉眼觀察液體培養(yǎng)基中藻的形態(tài)、顏色和生長情況等;同時觀察固體培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài),包括菌落生長速度、形狀、大小、表面質地、隆起程度、透明度、邊緣和顏色等;借助光學顯微鏡觀察有無細胞核或其他細胞器等藻類形態(tài),以大致區(qū)分到“門”,并拍照記錄。

1.2.3 菌種分子水平鑒定

利用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)技術,分別使用細菌通用引物16S rRNA/23S rRNA和藻藍蛋白基因間隔序列ITS的特異引物對分離到的純種藻細胞進行目的基因的擴增,引物信息見表4所列。然后,對PCR擴增產物進行測序,并將測序結果提交NCBI核酸序列數據庫進行Blast比對。下載比對得分最高的9條結果記錄,并保存為“fasta”格式文件,用MEGA 10.0[16]制作基因進化樹,進一步對分離到的藻細胞進行分類。

表4 引物信息

1.2.4mcyB目的基因的克隆

使用Primer5軟件,設計微囊藻合成酶基因(Mcy)中的關鍵DNA片段mcyB的上下游引物,見表4所列,并進行體外聚合酶鏈式擴增反應(PCR),分離純化PCR產物,并連接到PEASY-Blunt載體上,挑取單克隆進行陽性鑒定,最后送測序。

1.2.5 藻細胞計數

藻細胞的數量采用XB-K-25型血球計數板進行計數。在血球計數板的兩邊各滴加10 μL的藻細胞溶液,置于Olympus顯微鏡視野下對其中25個、大格400個小格進行計數,采用每邊各計1次,取平均值記錄(計數方法為記上不記下、記左不記右,單位為104個/mL)。

1.2.6 統(tǒng)計分析

本文采用Microsoft Excel 2013軟件對實驗中所測數據進行統(tǒng)計分析和圖表制作。所有處理均重復3次,分析結果以(平均值±標準差)表示。

2 結果與分析

2.1 巢湖藍藻優(yōu)勢菌種的分離、純化和鑒定

2.1.1 藍藻的分離純化和形態(tài)觀察

采取稀釋劃線法,經不斷反復純化轉接,共獲得3個單一菌落,根據時間依次編號為CH1、CH2和CH3。通過光學顯微鏡觀察(放大40倍),3株藻細胞均呈深綠色,形狀為球形,群體內細胞大小相似,原生質體為灰綠色,未見細胞核,如圖2所示。將獲得的菌株回接到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)數天后,藻細胞溶液呈現均勻分布的綠色,且靜置生長始終無沉淀形成。本實驗觀察到的結果符合銅綠微囊藻(M.aeruginosa)的形態(tài)特征和生長情況。

圖2 CH1、CH2和CH3在顯微鏡下的形態(tài)

2.1.2 銅綠微囊藻的分子鑒定

使用16S通用引物、16S rRNA-23S rRNA引物和藻藍蛋白基因間隔序列ITS的特異引物分別對3株藻細胞進行體外PCR擴增后送測序。所獲得序列經DNAMAN比對完全一樣,統(tǒng)一取名為CHSEQ,并提交NCBI數據庫進行序列比對,進一步確定這3株藻細胞均為銅綠微囊藻(M.aeruginosa)。下載序列比對得分最高的9條結果記錄,使用MEGA軟件(版本10.0)構建進化樹,如圖3所示。

圖3 基于藻藍蛋白基因間隔區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

從圖3可以看出,本實驗所獲得的CHSEQ序列與銅綠微囊藻M.aeruginosaUAM-VMA-7處于同一分支,表明它們的序列同源性最高。

2.2 銅綠微囊藻的生長特性研究

2.2.1 銅綠微囊藻標準曲線的制定

將生長至對數期的銅綠微囊藻進行梯度稀釋,并用分光光度計逐一測量,同時在顯微鏡下進行計數,以不同藻細胞的數量及其吸光度值作標準曲線,如圖4所示。通過計算,得出銅綠微囊藻的細胞數和吸光值之間換算的標準曲線方程式為:

圖4 銅綠微囊藻吸光度與個數換算標準曲線

y=3 144.7x+2.234 7。

2.2.2 培養(yǎng)基對銅綠微囊藻生長的影響

本文分別使用BG-11、MA和Knop 3種不同培養(yǎng)基對銅綠微囊藻進行培養(yǎng)。12 d后統(tǒng)計不同培養(yǎng)基中單位體積的藻細胞數如圖5所示。由圖5可知,BG-11培養(yǎng)基中,藻細胞在第3天即進入對數生長期,同時對數期內藻細胞增長率為217.3%;而MA和Knop培養(yǎng)基中,藻細胞則分別在第4天和第6天進入對數生長期,且增長率僅為143.4%和150.8%。此外,在BG-11培養(yǎng)基中,銅綠微囊藻的細胞數最終可達到每單位體積1.6×107個,而MA和Knop培養(yǎng)基中藻細胞數最終為每單位體積1.0×107和8.0×106個。由此表明BG-11培養(yǎng)基更適于銅綠微囊藻的生長。

圖5 不同培養(yǎng)基對銅綠微囊藻生長的影響

2.2.3 光照時間對銅綠微囊藻生長的影響

由于一天內最大光照時長為16 h,本實驗比較了光照6、8、10、12、14、16 h對銅綠微囊藻生長的影響,如圖6所示。由圖6可知，銅綠微囊藻在6 ～16 h的不同光照時長下藻細胞增長率分別為31.6%、47.1%、91.5%、109.9%、125.0%、132.4%。表明光照時間與銅綠微囊藻的生長呈現正相關,光照時間的延長會促進銅綠微囊藻的生長,當光照時間達16 h時,銅綠微囊藻生長速度最快。因而在探究溫度條件的實驗中采用光照16 h。

圖6 光照時間對銅綠微囊藻生長的影響

2.2.4 培養(yǎng)溫度對銅綠微囊藻生長的影響

固定光照時間為16 h,比較培養(yǎng)溫度分別為20、25、30、35 ℃對銅綠微囊藻生長的影響如圖7所示。由圖7可知，銅綠微囊藻的最適生長溫度為30 ℃,平均增長率達到162.5%。

圖7 溫度對銅綠微囊藻生長的影響

2.2.5 光照和溫度對銅綠微囊藻生長的影響

為了比較光照和溫度對銅綠微囊藻生長的協同作用,設計了光照(12、14、16 h)及溫度(20、25、30 ℃)的兩因素三水平試驗,結果如圖8所示。統(tǒng)計培養(yǎng)基中單位體積藻細胞數,由圖8可知，藻細胞在培養(yǎng)條件為光照時長16 h、溫度30 ℃時增速最快。

圖8 溫度、光照對銅綠微囊藻生長的影響

2.2.6 pH值對銅綠微囊藻生長的影響

通過向培養(yǎng)基中加入鹽酸或氫氧化鈉,調節(jié)培養(yǎng)基pH值由5.0到9.0變化,比較培養(yǎng)基中單位體積銅綠微囊藻細胞數，如圖9所示。由圖9可知,隨著培養(yǎng)基pH值的增加,銅綠微囊藻藻細胞的平均增長速率分別為0、16.5%、118.5%、103.5%和53.9%。由此可知,pH值為7.0的培養(yǎng)條件更適合銅綠微囊藻生長。在此條件下藻細胞密度最大,為1.5×107個/mL。而在pH值為5.0的條件下,藻細胞增速幾乎為0,說明銅綠微囊藻的生長基本被抑制。

圖9 不同pH值培養(yǎng)基對銅綠微囊藻生長的影響

2.2.7 銅綠微囊藻對不同抗生素的抗性

向BG-11培養(yǎng)基中分別加入卡納霉素(Kana)、利福平(Rif)、四環(huán)素(Tet)、氨芐霉素(Amp)和慶大霉素(Gen)5種抗生素,比較銅綠微囊藻的生長情況如圖10所示。

圖10 不同抗生素對銅綠微囊藻生長的影響

由圖10可知,銅綠微囊藻對抗生素比較敏感,5種抗生素均能不同程度地抑制其生長。但是研究發(fā)現,銅綠微囊藻對四環(huán)素的抗性較強,比空白組而言被抑制率僅為5.75%,而其余4種抗生素抑制率則高達95.08%～99.86%。

2.3 銅綠微囊藻生長曲線的測定

依據2.2節(jié)中的結果,選用BG-11培養(yǎng)基培養(yǎng)銅綠微囊藻,將培養(yǎng)基pH值調至7.0,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內光照16 h/d,每隔24 h測定1次藻細胞個數,連續(xù)測定12 d直到生物量增長小于5%,繪制生長曲線如圖11所示。由圖11可知,銅綠微囊藻符合典型的細菌生長曲線,并在培養(yǎng)第2天進入對數期,在第11天進入穩(wěn)定期。

圖11 銅綠微囊藻生長曲線

2.4 銅綠微囊藻的毒性鑒定

用TOX1P/TOX1M引物對分離所得的銅綠微囊藻進行擴增,電泳檢測結果如圖12所示,由圖12可知,1 500 bp區(qū)域可擴增出條帶,經測序比對發(fā)現,與mcyB基因序列一致,說明從巢湖分離的微囊藻屬的銅綠微囊藻含mcyB基因,具有產生微囊藻毒素的能力。

圖12 mcyB基因片段的克隆

3 討 論

本實驗通過稀釋涂布平板法從巢湖藍藻水華暴發(fā)時的水體中分離到3株單一菌落,經細胞形態(tài)和特異基因鑒定,表明所分離的3株菌落為同一種銅綠微囊藻株系。進一步對分離得到的銅綠微囊藻單一藻株進行生長特性的研究,確定了該銅綠微囊藻的最適生長條件為pH=7.0、溫度30 ℃下光照16 h,這與巢湖藍藻水華暴發(fā)的主要因素相一致。在自然水體中,溫度和光照的變化是影響水生生物生長繁殖的重要生態(tài)因子。銅綠微囊藻作為暖水性種藻類,它的最適生長溫度在30 ℃左右。而巢湖處于北緯30°左右,水溫季節(jié)性變化明顯,但在夏季6—10月其水溫基本能夠維持在20～30 ℃,這也是巢湖藍藻集中暴發(fā)、迅速生長的時期[17]。同時,光照影響藻類的垂直分布，研究表明,不同藻類對于光照強度的要求不同,銅綠微囊藻對光強需求較高,一般生活在水體表層,并且光照時間越長越有利于其生長。

溫度和光照作為藻類生長繁殖的重要影響因子,它們在現實水體中往往是協同發(fā)揮作用[18]。在夏季,巢湖水體不僅溫度高,而且光照強度大、時間長。本實驗通過設定溫度梯度(20、25、30 ℃)和光照時間梯度(12、14、16 h)兩因素試驗,發(fā)現同一溫度條件下,光照時長對銅綠微囊藻的生長具有顯著影響。當培養(yǎng)溫度為銅綠微囊藻的適宜生長溫度(25～30 ℃)時,光照時長每增加2 h,藻細胞數可增加2.5×106個/mL;而培養(yǎng)溫度為20 ℃時,光照時長每增加2 h僅能增加藻細胞數9.7×105個/mL。很多研究表明,在低溫(20 ℃以下)和高溫(35 ℃以上)條件下,銅綠微囊藻的光合作用相關酶類的酶活性降低,且光合系統(tǒng)Ⅱ的電子傳遞速率下降,導致其光合利用率下降,最終使得單位時間光照下藻細胞的生長能力較低[19-21]。

此外,每年巢湖水質調查結果表明,巢湖水pH值在7.5～8.2之間,呈現弱堿性。本實驗結果顯示銅綠微囊藻的最適生長pH值為7.0～8.0,而當pH值降至酸性條件時,銅綠微囊藻的生長量會急劇降低,這也進一步闡明了銅綠微囊藻作為巢湖水華優(yōu)勢藻種的原因[22]。在銅綠微囊藻對抗生素抗性的研究中,發(fā)現常見抗生素幾乎能顯著抑制藻細胞的生長,唯有四環(huán)素沒有明顯的效果。文獻[23]研究發(fā)現,由于生活中抗生素的濫用以及污水處理廠無法將其有效去除,巢湖水域呈現嚴重的抗生素污染現狀,尤其是四環(huán)素類抗生素,其在水體中的殘留量最高,已達3.5～42.3 ng/L。隨著逐年物種進化,巢湖銅綠微囊藻極可能對四環(huán)素類抗生素產生了很強的抗性,這與本實驗的研究結果一致。

文獻[24]通過基因分型和代謝物化學分型深入探究了微囊藻的種群多樣性和不同種微囊藻藻毒素(MC)產生的變化,揭示了種群差異的根源是基因水平差異。一般地,藻細胞中MC的產生與否是由微囊藻合成酶基因(Mcy)決定。本實驗通過PCR技術以Mcy基因內部的關鍵DNA片段mcyB對所獲得的銅綠微囊藻藻株進行擴增和測序,發(fā)現結果呈現陽性,說明該藻株中含有Mcy基因,具有產生MC的潛在危險。文獻[25]經固相萃取和高效液相色譜檢測,也證實巢湖水體中的銅綠微囊藻菌株可產生毒性最強的MC-LR,與本實驗的分子生物學實驗結果一致。

4 結 論

本文通過一系列實驗對巢湖藍藻的優(yōu)勢菌種銅綠微囊藻的生長特性進行了研究,表明銅綠微囊藻的生長和繁殖主要受到外部環(huán)境(如溫度、光照和pH值等)的影響。其中,溫度和光照對銅綠微囊藻生長的影響具有明顯的協同效應。在抗生素干擾實驗室中,發(fā)現銅綠微囊藻對四環(huán)素類抗生素具有極強的抗性,或許與近年來巢湖水體中大量積累的四環(huán)素有關。因此,在巢湖水治理過程中應加大管控力度,減少抗生素類物質的殘留,避免藍藻抗性的產生。另外,通過分子生物學手段,成功克隆到微囊藻合成酶基因的片段mcyB,證實巢湖銅綠微囊藻具有產毒能力,會對巢湖周邊居民的身體健康產生危害。了解巢湖銅綠微囊藻的基本生長特性,將有助于政府及相關部門科學地、有針對性地防治巢湖水華。