銅離子對中華絨螯蟹幼蟹的急性致死效應(yīng)及組織顯微結(jié)構(gòu)的影響

童帥旗，付龍龍，蔣琦辰，苗珍，張曉君*，潘建林

（1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州225009；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京210017）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），俗稱河蟹、大閘蟹等，屬于節(jié)肢動物門，甲殼綱，十足目，方蟹科，絨螯蟹屬[1]。中華絨螯蟹的養(yǎng)殖在我國水產(chǎn)業(yè)中有著十分重要的地位，每年為養(yǎng)殖戶創(chuàng)造了可觀的收益[2]。然而由于部分養(yǎng)殖戶用藥的不規(guī)范，導(dǎo)致環(huán)境問題日益突出，向環(huán)境中排放的污染物也逐年增多[3]。

銅是機體生長發(fā)育過程中所必需的微量元素，是甲殼類合成血藍(lán)蛋白所必需的營養(yǎng)元素之一，在細(xì)胞活動中也扮演著重要的角色[4]，但是高濃度的銅會對機體產(chǎn)生毒性效應(yīng)[5]，并且由于銅參與機體的生命活動，更易被吸收，導(dǎo)致在體內(nèi)大量積累[6]。由于銅離子（Cu2+）具有良好的滅藻及殺滅部分寄生蟲的效果，廣泛用于水體消毒[7]。銅是我國養(yǎng)殖水域中超標(biāo)最嚴(yán)重的重金屬之一[8]。因此，現(xiàn)以中華絨螯蟹幼蟹為研究對象，研究了Cu2+對其急性致死效應(yīng)，以及不同濃度Cu2+對其組織顯微結(jié)構(gòu)的影響，為進(jìn)一步評價Cu2+在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的危害提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 試驗材料

試驗用中華絨螯蟹取自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所浦口基地，挑選附肢完好、體表無損傷、活力強、大小均勻且平均體質(zhì)量為（29.24±4.42）g的中華絨螯蟹為試驗對象。中華絨螯蟹從養(yǎng)殖池塘取回后，于玻璃水族箱（80 cm×50 cm×50 cm）中馴化兩周，水溫為21℃，溶解氧質(zhì)量濃度為5 mg/L，光暗比為12 h∶12 h，每天早晚投喂中華絨螯蟹專用飼料。試驗前1 d將中華絨螯蟹移入試驗用塑料箱（60 cm×40 cm×25 cm）中，并停止投喂。試驗用Cu2+是由五水硫酸銅（CuSO4·5H2O2）分析純?nèi)芙舛?，?9.53 g CuSO4·5H2O2溶解于1 L純水中，制備為5 g/L的Cu2+母液。試驗用水均為提前曝氣24 h以上的自來水。

1.2 Cu2+對中華絨螯蟹幼蟹LC50的測定

文獻(xiàn)［9-11］中Cu2+對中華絨螯蟹的半致死濃度設(shè)計預(yù)試驗，根據(jù)預(yù)試驗得出的最大全存活濃度和最低全致死濃度設(shè)計半致死濃度測定試驗。設(shè)Cu2+質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0和4.0 mg/L的4個試驗組進(jìn)行半致死濃度測定[12]，試驗前一天停止投喂，每天各試驗組全部換水，并及時補充Cu2+。

1.3 Cu2+脅迫后肝胰腺及鰓組織病理變化

急性毒性試驗組共四組，其Cu2+質(zhì)量濃度分別為0，0.1，0.2和0.4 mg/L，每組3個平行，每個平行10只中華絨螯蟹，試驗前一天停止投喂，每天各組全部換水。于24，48和96 h各試驗組取6只中華絨螯蟹在冰上處死，取其肝胰腺和鰓組織并用Bouin’s液固定。然后送樣至武漢塞維爾生物科技有限公司，進(jìn)行石蠟包埋切片。

2 結(jié)果

2.1 半致死濃度

根據(jù)中華絨螯蟹幼蟹各時間段的死亡率計算半致死濃度[13]。死亡率及96 h LC50見表1、表2和表3。

表1 Cu2+對中華絨螯蟹幼蟹24～96 h死亡率%

表2 Cu2+對中華絨螯蟹幼蟹24～96 h LC50

表3 96 h LC50置信區(qū)間（a對數(shù)底=10）

2.2 Cu2+脅迫后肝胰腺組織切片觀察

研究顯示，隨著ρ（Cu2+）的升高，中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺組織的病理變化越明顯，見圖1（a）（b）（c）（d）。ρ（Cu2+）=0.1 mg/L處理組表現(xiàn)為肝小管變窄，細(xì)胞中出現(xiàn)空泡；ρ（Cu2+）=0.2 mg/L處理組表現(xiàn)為基膜變薄，肝小管變粗，細(xì)胞中空泡進(jìn)一步增多增大；ρ（Cu2+）=0.4 mg/L處理組表現(xiàn)為基膜與肝小管單層柱狀上皮直接形成空腔，單層柱狀細(xì)胞不規(guī)則腫大，細(xì)胞中普遍出現(xiàn)大量空泡，肝小管中甚至出現(xiàn)細(xì)胞碎片。

2.3 Cu2+脅迫后鰓組織切片觀察

研究顯示，隨著ρ（Cu2+）的升高，中華絨螯蟹幼蟹鰓組織的病理變化就越明顯，見圖2（a）（b）（c）（d）。ρ（Cu2+）=0.1 mg/L處理組表現(xiàn)為鰓葉不規(guī)則增厚，鰓絲血腔增大；ρ（Cu2+）=0.2 mg/L處理組表現(xiàn)為鰓葉不規(guī)則增厚，上皮層損傷，角質(zhì)膜隆起，細(xì)胞核聚集增多；ρ（Cu2+）=0.4 mg/L處理組表現(xiàn)為鰓葉不規(guī)則增厚，上皮層嚴(yán)重?fù)p傷，甚至解體。

圖1不同Cu2+濃度脅迫下中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺變化

圖2不同Cu2+濃度脅迫下中華絨螯蟹幼蟹鰓變化

3 討論

陳細(xì)香等[14]研究指出，Cu2+對于克氏原螯蝦的96 h LC50為5.28 mg/L，比該研究中得出的中華絨螯蟹幼蟹96 h LC50高出許多，表明克氏原螯蝦對于重金屬銅的耐受能力更強。黃鶴忠等[15]研究指出Cu2+對于中華絨螯蟹大眼幼體的96 h LC50為1.50 mg/L，與本研究結(jié)果相近，說明中華絨螯蟹大眼幼體與幼蟹對于重金屬銅有著相近的耐受力。趙云龍等[16]研究指出，Cu2+對于花鰍的96 h LC50為0.298 mg/L，遠(yuǎn)低于本研究中的中華絨螯蟹幼蟹96 h LC50，說明花鰍對于重金屬銅的耐受性相對較低，Cu2+污染可能對其會造成更為嚴(yán)重的危害。Oliva等[17]研究指出，Cu2+對于云斑厚紋蟹的96 h LC50為0.50 mg/L，遠(yuǎn)低于本研究中中華絨螯蟹幼蟹96 h LC50，說明中華絨螯蟹幼蟹的重金屬銅耐受性較強。Yang等[11]研究指出Cu2+脅迫中華絨螯蟹會使其腎小管壁增厚、上皮細(xì)胞變性分離、基底膜與單層柱狀上皮之間形成大空泡、小管腔內(nèi)可見大量碎片，與本研究結(jié)果相似。Na等[18]研究發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦暴露在0.01～0.40 mg/L Cu2+中，會導(dǎo)致其鰓小片腫脹融合、鰓尖異常、鰓內(nèi)小片增生壞死，肝胰腺可見血細(xì)胞增多、基底板增厚、肝小管壞死，與本研究結(jié)果相似，說明Cu2+對甲殼類鰓和肝胰腺危害嚴(yán)重。王濤等[19]的研究指出，暗紋東方鲀暴露在0.1和0.2 mg/L（96 h LC50）Cu2+濃度中，會導(dǎo)致其肝臟血細(xì)胞沉積以及血竇擴張、鰓上皮細(xì)胞增生產(chǎn)生動脈瘤，說明Cu2+對于暗紋東方鲀的毒性要高于中華絨螯蟹幼蟹。

銅雖然是甲殼類生長發(fā)育所必需的微量元素，但過量的攝入還是會對其造成嚴(yán)重的病理損傷。該研究發(fā)現(xiàn)其對中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺及鰓組織的損傷十分嚴(yán)重，可造成形態(tài)變化及功能障礙，對中華絨螯蟹幼蟹正常生長發(fā)育有著嚴(yán)重的危害。