趙亞星 白 晨* 敖長(zhǎng)金 呂可欣 徐珊珊 王曉淵 包志碧

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市畜牧工作站，巴彥淖爾 015000)

隨著2020年1月我國(guó)“禁抗令”的實(shí)施，天然、健康、無(wú)殘留、無(wú)毒副作用的植物提取物成為養(yǎng)殖業(yè)和飼料行業(yè)開發(fā)和研究的熱點(diǎn)，并作為飼料添加劑廣泛地應(yīng)用在畜禽養(yǎng)殖中[1]。植物精油是從植物體內(nèi)提煉出的一類揮發(fā)性芳香物質(zhì)，主要包括萜類、酮類、醇類和醛類[2]。作為一種提取物，植物精油主要存在于植物的花、莖、葉、根和果實(shí)中[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加植物精油可影響反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵，能夠降低瘤胃內(nèi)氨態(tài)氮(NH3-N)和乙酸濃度，提高瘤胃內(nèi)丙酸濃度[4]。飼糧中添加植物精油可調(diào)控瘤胃發(fā)酵狀態(tài)，進(jìn)而改善動(dòng)物生產(chǎn)性能和機(jī)體各項(xiàng)機(jī)能。Kholif等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳期母羊飼糧中添加辣椒精油可顯著改善母羊的免疫機(jī)能和健康狀況。Parvar等[6]在肉羊飼糧中添加500 mg/kg的阿魏精油，結(jié)果表明肉羊的干物質(zhì)采食量(DMI)顯著提高，且羊肉中n-3多不飽和脂肪酸含量顯著提高。

沙蔥(AlliummongolicumRegel)，別名蒙古韭，主要生長(zhǎng)在我國(guó)西北部干旱地區(qū)，是一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的蔥屬植物[7]。沙蔥中含有多種活性成分，根據(jù)理化特性可分為黃酮類化合物、多糖和精油等[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥黃酮和沙蔥多糖在提高瘤胃內(nèi)微生物蛋白(MCP)濃度和維持瘤胃液pH等方面均具有積極作用[9-10]。但沙蔥精油對(duì)肉羊瘤胃發(fā)酵的研究鮮有報(bào)道。開展肉羊體內(nèi)試驗(yàn)之前需要確定沙蔥精油是否對(duì)肉羊體外瘤胃發(fā)酵具有負(fù)面作用。因此，本試驗(yàn)旨在研究體外條件下不同水平沙蔥精油對(duì)瘤胃發(fā)酵和底物干物質(zhì)(DM)降解率的影響，為未來(lái)沙蔥精油在肉羊體內(nèi)試驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 沙蔥精油的制備

試驗(yàn)所需的沙蔥粉(沙蔥風(fēng)干后粉碎制得)由阿拉善盟某生物科技有限公司提供。沙蔥精油的制備參照烏仁張嘎[11]的方法。準(zhǔn)確稱取沙蔥粉500 g，按料液比1∶(10～11)浸泡于蒸餾水中1.5 h，超聲波處理20 min，置于圓底燒瓶蒸餾3.5 h，于蒸餾出的液體中加入適量碳酸鈉，用石油醚萃取沙蔥精油，35 ℃回收石油醚，最終得到的淡黃色沙蔥精油保存于-20 ℃冰箱中備用。沙蔥精油得率為0.4%。通過(guò)氣相色譜法測(cè)得沙蔥精油中的主要活性成分為三硫化甲基烯丙基(21.30%)、二甲基三硫(10.77%)、二烯丙基三硫醚(7.65%)、2-甲基己烷(6.09%)等。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

選擇3只體況健康、體重為(37.1±0.5)kg的3月齡杜寒雜交羊作為瘤胃液供體羊。試驗(yàn)羊進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，飼喂全混合日糧，參照我國(guó)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)配制，精粗比為4∶6，全混合日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)羊每天飼喂2次(07:00和18:00)，自由飲水。

表1 全混合日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采取單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在發(fā)酵瓶(100 mL)中添加2 g底物，并分別添加0(對(duì)照組)、0.02(T1組)、0.04(T2組)、0.06(T3組)、0.08(T4組)、0.10(T5組)和0.12 mg(T6組)的沙蔥精油，每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入10 mL瘤胃液和20 mL瘤胃緩沖液。沙蔥精油的添加水平參照包玲玲[9]和張宇宏[13]的試驗(yàn)結(jié)果。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。底物與全混合日糧組成成分相同。培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

1.4 體外發(fā)酵培養(yǎng)

1.4.1 瘤胃緩沖液的配制

瘤胃緩沖液的配制參照Menke等[14]的方法。分別準(zhǔn)確量取微量元素液0.12 mL、碳酸鹽緩沖液237.00 mL、磷酸鹽元素液237.00 mL、指示劑1.22 mL，保持在39 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)，通入二氧化碳(CO2)至飽和，然后加入還原劑溶液(49.50 mL)，并加入蒸餾水使溶液總體積定容到1 000 mL，持續(xù)通入CO2使溶液由藍(lán)色變?yōu)榉圩仙?，最后變?yōu)闊o(wú)色。還原劑溶液需當(dāng)天配制。

表2 瘤胃緩沖液各組分組成

1.4.2 體外發(fā)酵培養(yǎng)

于晨飼前通過(guò)口腔采集器采集供體羊瘤胃液，經(jīng)1層無(wú)菌無(wú)酶紗布過(guò)濾后放入保溫桶中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，采用注射器將瘤胃液與瘤胃緩沖液(瘤胃液10 mL+瘤胃緩沖液20 mL)混合后分裝到100 mL已提前加入2 g底物的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶持續(xù)通入CO2。培養(yǎng)瓶于38 ℃、120×g的恒溫氣浴搖床中培養(yǎng)24 h，到達(dá)規(guī)定時(shí)間后迅速將培養(yǎng)瓶取出，進(jìn)行冰浴，終止發(fā)酵。

1.4.3 樣品收集與處理

收集發(fā)酵前底物，分為3個(gè)平行樣，測(cè)定其營(yíng)養(yǎng)成分。發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液無(wú)損轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中400×g離心，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中備用，下層沉淀物置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中105 ℃烘干24 h。恒重后使用電子分析天平進(jìn)行稱重，計(jì)算底物DM降解率。上清液用于測(cè)定NH3-N、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、MCP濃度。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 飼糧中營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

DM、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、鈣(Ca)、磷(P)含量參考AOAC(1990)[15]的方法測(cè)定，中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量參照Van Soest等[16]的方法測(cè)定。

1.5.2 pH的測(cè)定

發(fā)酵至24 h時(shí)，收集好各組發(fā)酵液，經(jīng)4層紗布過(guò)濾后立即使用預(yù)先校正好的便攜式手持pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.5.3 NH3-N、MCP和VFA濃度的測(cè)定

參照Broderick等[17]的方法測(cè)定發(fā)酵液NH3-N濃度，參照Wu等[18]的方法測(cè)定發(fā)酵液VFA濃度，參照Makkar等[19]的方法測(cè)定發(fā)酵液MCP濃度。

1.5.4 底物DM降解率的測(cè)定

底物DM降解率(%)=100×(發(fā)酵前底物DM含量-發(fā)酵后底物DM含量)/發(fā)酵前底物DM含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行初步整理，采用SAS 9.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 沙蔥精油對(duì)瘤胃體外發(fā)酵液pH及MCP、NH3-N濃度的影響

由表3可見，在體外培養(yǎng)24 h后，T2、T3、T4、T6組的發(fā)酵液pH顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，T1、T5組的發(fā)酵液pH與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。T1、T2、T3組的發(fā)酵液NH3-N濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，T4組的發(fā)酵液NH3-N濃度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，T5、T6組的發(fā)酵液NH3-N濃度與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。T4組的發(fā)酵液MCP濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，T1、T2、T3、T5、T6組的發(fā)酵液MCP濃度與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

2.2 沙蔥精油對(duì)瘤胃體外發(fā)酵液VFA濃度的影響

由表3可見，在體外培養(yǎng)24 h后，T4組的發(fā)酵液丁酸和戊酸濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，T1、T2、T3、T5、T6組的發(fā)酵液丁酸和戊酸濃度與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。T1、T2、T3、T4、T5、T6組的發(fā)酵液總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。各組之間乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸濃度及乙酸/丙酸差異不顯著(P>0.05)。

表3 沙蔥精油對(duì)瘤胃體外發(fā)酵液pH及MCP、NH3-N濃度的影響

表4 沙蔥精油對(duì)瘤胃體外發(fā)酵液VFA濃度的影響

2.3 沙蔥精油對(duì)瘤胃體外DM降解率的影響

由表5可見，在體外培養(yǎng)24 h后，T4和T5組的底物DM降解率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。T1、T2、T3、T6組的底物DM降解率與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

表5 沙蔥精油對(duì)瘤胃體外底物DM降解率的影響

3 討 論

3.1 沙蔥精油對(duì)瘤胃體外發(fā)酵液pH的影響

瘤胃是天然的發(fā)酵罐，可利用在瘤胃內(nèi)棲息的大量微生物降解飼糧中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[20]。瘤胃內(nèi)環(huán)境指標(biāo)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化能力是評(píng)估瘤胃健康和反芻動(dòng)物機(jī)體健康的重要指標(biāo)[21]。

反芻動(dòng)物瘤胃pH的波動(dòng)能夠直接反映瘤胃內(nèi)環(huán)境狀態(tài)，pH的變化受飼糧結(jié)構(gòu)、唾液和瘤胃內(nèi)酸堿物質(zhì)的排出等多種因素的影響[22]。正常的瘤胃pH在5.00～7.50[23]。當(dāng)pH在6.2～6.8時(shí)，瘤胃中纖維降解菌的活性最高；當(dāng)pH在5.2～6.0時(shí)，瘤胃內(nèi)淀粉降解菌的活性最高；當(dāng)pH小于5.5時(shí)，瘤胃內(nèi)原蟲的活性降低，反芻動(dòng)物易發(fā)生瘤胃酸中毒[24]。本試驗(yàn)發(fā)酵液的pH在6.15～6.35波動(dòng)，均處于正常范圍內(nèi)，表明沙蔥精油對(duì)瘤胃微生物正常發(fā)酵代謝沒有產(chǎn)生不利影響。添加沙蔥精油導(dǎo)致pH下降的原因可能是沙蔥精油中的硫化物能夠促進(jìn)發(fā)酵液中微生物對(duì)碳水化合物等底物進(jìn)行降解，進(jìn)而使VFA不斷積累，pH下降。

3.2 沙蔥精油對(duì)瘤胃體外發(fā)酵液NH3-N濃度的影響

NH3-N是瘤胃內(nèi)環(huán)境中一個(gè)重要指標(biāo)，NH3-N濃度能夠反映瘤胃內(nèi)氮的供應(yīng)與利用情況[25]。適宜的NH3-N濃度對(duì)于瘤胃微生物的生長(zhǎng)以及MCP的合成具有重要意義[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，在體外條件下，適合瘤胃微生物生長(zhǎng)的發(fā)酵液NH3-N濃度在5～8 mg/dL[27]。韓正康等[23]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)瘤胃發(fā)酵液NH3-N濃度為8.5 mg/dL，瘤胃微生物利用氮源合成MCP的能力達(dá)到飽和。本試驗(yàn)中，發(fā)酵液NH3-N濃度在6.20～8.07 mg/dL，屬于微生物生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成的最佳范圍，并未對(duì)瘤胃發(fā)酵沒有產(chǎn)生不利影響。在體外培養(yǎng)24 h后，添加0.08 mg沙蔥精油時(shí)發(fā)酵液NH3-N濃度顯著降低，原因可能是沙蔥精油降低了瘤胃微生物對(duì)含氮物質(zhì)的分解作用，導(dǎo)致NH3-N濃度的降低，而未被瘤胃微生物分解的含氮物質(zhì)被微生物利用合成了MCP。

3.3 沙蔥精油對(duì)瘤胃體外發(fā)酵液MCP濃度的影響

瘤胃微生物可將飼糧中的蛋白質(zhì)降解為NH3-N，并利用NH3-N合成MCP為動(dòng)物機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[28]。MCP能夠滿足反芻動(dòng)物蛋白質(zhì)需求量的40%～80%[1]。瘤胃中MCP濃度可反映瘤胃內(nèi)微生物數(shù)量以及攝取和利用NH3-N的能力[29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)24 h后，添加沙蔥精油能夠提高發(fā)酵液MCP濃度，且添加0.08 mg時(shí)效果顯著，究其原因可能是MCP合成需要源源不斷的能量供應(yīng)，能量供應(yīng)充足能夠使瘤胃微生物最大程度利用NH3-N合成MCP。VFA是合成過(guò)程中主要的能量供應(yīng)者，而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加沙蔥精油能夠促進(jìn)發(fā)酵液中微生物對(duì)碳水化合物等底物進(jìn)行降解，使得TVFA濃度顯著增加，為MCP合成過(guò)程提供了更多的能量。原蟲與細(xì)菌存在拮抗作用，有研究發(fā)現(xiàn)植物精油對(duì)原蟲有抑制或殺滅作用[30]。因此，添加沙蔥精油可能通過(guò)抑制原蟲進(jìn)而提高了發(fā)酵液中細(xì)菌數(shù)量，最終提高發(fā)酵液MCP濃度。

3.4 沙蔥精油對(duì)瘤胃體外發(fā)酵液VFA濃度的影響

瘤胃中VFA主要是由微生物發(fā)酵飼糧中碳水化合物生成，可為反芻動(dòng)物提供所需能量的70%～80%[31]。瘤胃內(nèi)VFA的組成是反映微生物消化與代謝的關(guān)鍵指標(biāo)[32]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加0.06和0.08 mg沙蔥精油提高了發(fā)酵液乙酸和丙酸濃度，降低了乙酸/丙酸。乙酸/丙酸是反映瘤胃發(fā)酵模式變化的重要指標(biāo)[33]。當(dāng)乙酸/丙酸>2.5時(shí)為乙酸型發(fā)酵，相反，當(dāng)乙酸/丙酸<2.5時(shí)為丙酸型發(fā)酵[34]。乙酸型發(fā)酵的特點(diǎn)是能量利用率較低，丙酸型發(fā)酵的特點(diǎn)是丙酸產(chǎn)量較高，而丙酸是糖異生的重要前提物質(zhì)，因此，反芻動(dòng)物可以利用更多的丙酸合成葡萄糖為機(jī)體提供能量[35]。在本試驗(yàn)中，體外培養(yǎng)24 h后，添加不同水平的沙蔥精油均降低了發(fā)酵液乙酸/丙酸，且乙酸/丙酸<2.5，表明沙蔥精油可改變瘤胃的發(fā)酵類型，使瘤胃發(fā)酵向丙酸型發(fā)展，為機(jī)體提供更多的能量，有利于提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能和飼料利用率。

3.5 沙蔥精油對(duì)瘤胃體外底物DM降解率的影響

體外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解率能夠反映飼料在發(fā)酵體系中被瘤胃微生物的降解程度，是評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵的重要指標(biāo)之一[14]。體外DM降解率越高，說(shuō)明瘤胃內(nèi)環(huán)境適合微生物繁殖、發(fā)酵，有利于提高飼料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率[33]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，添加低水平的沙蔥精油對(duì)底物DM降解率沒有顯著影響，而添加0.08和0.10 mg沙蔥精油顯著提高了底物DM降解率，這表明沙蔥精油對(duì)底物的降解率與其添加水平密切相關(guān)。添加高水平的沙蔥精油可降低瘤胃發(fā)酵液的pH和MCP的合成效率，進(jìn)而促進(jìn)瘤胃內(nèi)微生物的大量繁殖，影響飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解。

4 結(jié) 論

沙蔥精油對(duì)肉羊體外瘤胃發(fā)酵有積極影響，添加0.08 mg沙蔥精油顯著降低了發(fā)酵液pH和NH3-N濃度，顯著提高了發(fā)酵液MCP、丁酸、戊酸、TVFA濃度以及底物DM降解率。