史建磊 熊自立 蘇世聞 張海利 宰文珊

摘要：【目的】對栽培番茄和野生番茄NBS-LRR類抗病基因家族進(jìn)行全基因組鑒定及表達(dá)分析，為NBS-LRR類抗病基因功能研究及其在植物抗病育種中的應(yīng)用提供理論參考?！痉椒ā繎?yīng)用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)方法，從栽培番茄和野生番茄[潘那利番茄（Solanum pennellii）和醋栗番茄（Solanum pimpinellifolium）]基因組中鑒定出NBS-LRR類抗病基因家族成員，明確其類型，并進(jìn)行序列特征、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化及生物脅迫下表達(dá)模式分析?！窘Y(jié)果】從栽培番茄、潘那利番茄和醋栗番茄基因組中分別鑒定獲得238、202和217個(gè)NBS-LRR類抗病基因家族成員，根據(jù)這些抗病基因編碼的結(jié)構(gòu)域差異，將其分為TNL（TIR-NBS-LRR）、CNL（CC-NBS-LRR）、RNL（RPW8-NBS-LRR）、TN（TIR-NBS）、CN（CC-NBS）、RN（RPW8-NBS）、NL（NBS-LRR）和N（NBS）8種類型，其中TNL、CNL和RNL型基因分別為58、87和13個(gè)。番茄NBS-LRR類抗病蛋白整體呈弱酸性，具有不穩(wěn)定性和親水性，以絲氨酸（Ser）磷酸化為主，二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體。栽培番茄和野生潘那利番茄的NBS-LRR類抗病基因不均勻地散布在13條染色體（0號虛擬染色體～12號染色體）上，分別有58.47%和52.48%的基因形成多個(gè)基因簇，有35.59%和22.77%的基因形成串聯(lián)重復(fù)。栽培番茄和2個(gè)野生番茄共477個(gè)NBS-LRR類抗病蛋白可聚為十大類群，其中N端為TIR的蛋白基本聚在一起，但N端為CC和RPW8結(jié)構(gòu)域的蛋白未能很好分開，聚在多個(gè)類群中;NL和N型基因散布于各類群中。在477個(gè)番茄NBS-LRR類抗病基因中共發(fā)現(xiàn)115對直系同源基因和8對旁系同源基因，主要分布在4號和5號染色體上，其中51.57%的NBS-LRR類抗病基因以同源基因形式存在，大多數(shù)Ka/Ks均小于1，說明其進(jìn)化中主要受到純化選擇?；谵D(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)（RNA-Seq）分析結(jié)果表明，多數(shù)NBS-LRR類抗病基因能響應(yīng)不同細(xì)菌脅迫?！窘Y(jié)論】番茄NBS-LRR類抗病基因具有成簇存在的特點(diǎn)，在進(jìn)化過程中經(jīng)重復(fù)擴(kuò)張，已形成大量同源基因，且能響應(yīng)多種細(xì)菌脅迫。

關(guān)鍵詞： 番茄;NBS-LRR類抗病基因;序列特征;染色體定位;系統(tǒng)進(jìn)化;生物脅迫;基因簇;基因重復(fù)

中圖分類號： S641.203.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）05-1158-09

Abstract：【Objective】Genome-wide identification and expression analysis of NBS-LRR disease-resistantgenes in cultivated tomatoand its wild relatives were performed，to provide a theoretical basis for the research on the function of NBS-LRR disease-resistant genes and the application in plant disease resistance breeding. 【Method】NBS-LRR disease-resistant gene family members were identified and analysed on classification， sequence characteristics， chromosome location， phylogeny， and expression patterns under biotic stresses from cultivated（Solanum lycopersicum） and two wild（S. pennellii and S. pimpinellifolium） tomato species genomes using bioinformatics and comparative genomics methods. 【Result】In total，238，202 and 217 NBS-LRR disease-resistant genes were identified in cultivated tomato and S. pennellii and S. pim-pinellifolium genomes，respectively. Based on the differences in the domains encoded by these disease-resistant genes， they were divided into eight types，which were TNL（TIR-NBS-LRR）， CNL（CC-NBS-LRR）， RNL（RPW8-NBS-LRR）， TN（TIR-NBS）， CN（CC-NBS）， RN（RPW8-NBS）， NL（NBS-LRR） and N（NBS），with 58 TNL，87 CNL and 13 RNL genes，respectively. NBS-LRR disease-resistant genes were weakly acidic in general， and were unstable and hydrophilic，with serine（Ser） phosphorylation and secondary structure of alpha-helix and random coil，which were mainly located in the nucleus，cytoplasm and chloroplast. Chromosome localization revealed that the NBS-LRR disease-resistant genes in cultiva-ted tomato and S. pennellii genomes were unevenly distributed on 13 different chromosomes（virtual chromosome 0-chromosome12），with 58.47% and 52.48% genes forming multiple gene clusters，35.59% and 22.77% genes forming tandem duplicates，respectively. Systematic clustering divided 477 NBS-LRR disease-resistant genes in the three genomes into ten groups，the N-terminal TIR-type genes were basically clustered together，but CC-and RPW8-type genes were not well separated and clustered in multiple groups; NL- and N-type genes were scattered in various groups. Gene homology analysis revealed 115 pairs of orthologous genes and 8 pairs of paralogous genes in 477 NBS-LRR disease-resistantgenes， equivalent to 51.57% of NBS-LRR genes had a homologous gene，and that they were mainly distributed on chromosomes 4 and 5， with most Ka/Ks values being less than 1，indicating that purification selection had occurred in evolution. It revealed that the most NBS-LRR disease-resistant genes could respond to different bacterial stresses by transcriptome sequencing（RNA-seq）data analysis. 【Conclusion】The tomato NBS-LRR disease-resistant genes exist in cluster. During the evolution，a large number of homologous genes have appeared through gene expansion. Also，they can respond to a variety of bacterial stresses.

Key words：tomato; NBS-LRR disease-resistant gene;sequence characteristics; chromosomal localization;phyletic evolution;biotic stress; gene cluster;gene duplication

Foundation item： Major Science and Technology Project for Breeding New Agricultural（Vegetable） Varieties in Zhejiang（2016C02051-1-2）; Wenzhou Basic Scientific Research Project（N20180003）; General Scientific Research Pro-ject of Education Department in Zhejiang（Y201840413）

0 引言

【研究意義】植物在自然進(jìn)化過程中面對病原微生物的侵染已形成一整套識別與防御機(jī)制，在此過程中抗病基因發(fā)揮著非常重要的作用。NBS-LRR是植物中最大抗病基因家族之一，目前已克隆的抗病基因多為NBS-LRR類抗病基因家族成員（Dangl and Jones，2001）。NBS-LRR類抗病蛋白具有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（Nucleotide-binding site，NBS）和富亮氨酸重復(fù)（Leucine-rich repeat，LRR）典型特征結(jié)構(gòu)域（劉云飛等，2014a，2014b），通過與病原效應(yīng)子結(jié)合，觸發(fā)ETI（Effector-triggered immunity）免疫反應(yīng)，從而抑制病原在植物細(xì)胞中的定殖與擴(kuò)展。番茄（Solanum lycopersicum）是世界主要蔬菜作物和科研模式植物之一，同時(shí)其近緣野生種中含豐富的抗病蟲和抗逆資源，鑒定與評價(jià)番茄NBS-LRR類抗病基因，對研究其數(shù)目特征、遺傳進(jìn)化和生物功能具有重要理論意義;同時(shí)在相關(guān)抗病基因深入挖掘的基礎(chǔ)上，對番茄栽培品種性狀改良和優(yōu)良新品種選育也具有積極實(shí)踐意義。【前人研究進(jìn)展】隨著越來越多植物基因組測序的完成，水稻（Oryza sativa）（Bai et al.，2002）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）（Meyers et al.，2003）、苜蓿（Medicago sativa）（Ameline-Torregrosa et al.，2008）、馬鈴薯（S. tuberosum）（Lozano et al.，2012）、玉米（Zea mays）（Cheng et al.，2012）、番茄（劉云飛等，2014b）、獼猴桃（Actinidia chinensis）（文歡和劉永立，2015）、大麥（Hordeum vulgare）（Habachi-Houimli et al.，2018）、蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite）（蔣卉等，2018）、桑樹（Morus alba）（劉潮等，2019）、谷子（李任建等，2020）等多種植物NBS-LRR類抗病基因已被鑒定。研究結(jié)果顯示，NBS-LRR類抗病蛋白主要包含由氨基端（N端）到羧基端（C端）的TIR/CC、NBS和LRR 3個(gè)結(jié)構(gòu)域（Meyers et al.，2003），有的還含有RPW8等結(jié)構(gòu)域（Xiao et al.，2001）。其中，NBS又稱NB-ARC，是最保守的結(jié)構(gòu)域，由8個(gè)保守基序組成（Meyers et al.，2003），通過結(jié)合水解ATP和GTP并進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)隨后的病原物識別（Fenyk et al，2012）;LRR由多個(gè)亮氨酸或脯氨酸和天冬氨酸組成（Lozano et al.，2012），是最主要的病原物特異識別區(qū)，通過蛋白互作識別病原物并決定抗病基因的?；院涂共∽V（Bai et al.，2002）。根據(jù)N端是否存在TIR（Toll/interleukin-1 receptor like）結(jié)構(gòu)域，可將NBS-LRR類抗病基因分為TNL（TIR-NBS-LRR）和nTNL（non-TIR-NBS-LRR）兩大類，后者通常會編碼卷曲螺旋（Coiled-coil）結(jié)構(gòu)，也稱為CNL（CC-NBS-LRR）（Meyers et al.，2003）。但并非所有NBS-LRR類抗病蛋白均具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，通常會缺少N端或C端結(jié)構(gòu)域?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前番茄全基因組測序已完成（Sato et al.，2012），為在全基因組水平上鑒定NBS-LRR類抗病基因提供了基礎(chǔ)條件。目前盡管已有番茄NBS-LRR類抗病基因家族的全基因組鑒定，但鮮見有關(guān)野生番茄NBS-LRR類抗病基因家族的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】應(yīng)用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)方法，從栽培番茄和野生番茄[潘那利番茄（S. pennellii）和醋栗番茄（S. pimpinellifolium）]基因組鑒定出NBS-LRR類抗病基因家族成員，明確其類型，并進(jìn)行序列特征、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化及生物脅迫下表達(dá)模式分析，為番茄相關(guān)基因功能驗(yàn)證及其在抗病育種中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 番茄NBS-LRR類抗病基因家族成員鑒定

從茄科基因組網(wǎng)站SGN（http：//solgenomics.net/）下載番茄基因組序列及其注釋信息，并利用BioEdit 7.2.5構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫。在Pfam（http：//pfam.xfam.org/）中下載NB-ARC（PF00931）氨基酸序列，并以此為靶序列進(jìn)行BLASTp（E-value<1）比對檢索，獲得候選基因。然后通過Pfam、SMART和COILS Server鑒定TIR、CC、RPW8、NBS和LRR等結(jié)構(gòu)域，將不含NBS結(jié)構(gòu)域編碼序列的候選基因排除。

1. 2 番茄NBS-LRR類抗病基因序列特征分析

利用ExPASy在線網(wǎng)站的Compute pI/MW工具計(jì)算蛋白分子量和理論等電點(diǎn)（pI）;以ProtParam在線網(wǎng)站進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)預(yù)測;利用ProtScale分析蛋白質(zhì)親/疏水性;運(yùn)用NetPhos 3.1 Server在線程序分析蛋白磷酸化位點(diǎn);采用ExPASy在線網(wǎng)站的SOPMA預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu);利用WoLF PSORT在線工具進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測;并以WebLogo 3在線工具繪制保守序列Logo圖。

1. 3 番茄NBS-LRR類抗病基因定位

結(jié)合SGN網(wǎng)站中的基因注釋信息，利用MapDraw 2.1進(jìn)行基因染色體定位并繪制其分布圖。隨后對番茄NBS-LRR類抗病基因進(jìn)行基因簇和串聯(lián)重復(fù)分析，劃分基因簇的原則：（1）2個(gè)相鄰基因間距小于200 kb;（2）2個(gè)相鄰基因間其他基因不多于8個(gè)（Meyers et al.，2003;Yang et al.，2008）;判斷串聯(lián)重復(fù)的原則：（1）相鄰基因距離小于100 kb;（2）基因間相似度大于70%（Huang et al.，2012）。采用在線程序PAL2NAL（http：//www.bork.embl.de/pal2nal/index.cgi？example=Yes#RunP2N）計(jì)算基因間的選擇壓力。

1. 4 番茄NBS-LRR類抗病基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

首先提取出NBS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，利用ClustalX 1.83進(jìn)行多序列比對，再以MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）（參數(shù)設(shè)置：Bootstrap method 1000，Poisson model，and Pairwise deletion）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，去除Bootstrap支持率低于50%的節(jié)點(diǎn)。采用DNAMAN 7.0計(jì)算序列間的相似性。

1. 5 番茄NBS-LRR類抗病基因表達(dá)分析

從番茄功能基因組數(shù)據(jù)庫TFGD（http：//ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/TFGD/digital/home.cgi）下載番茄轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）數(shù)據(jù)（D007），利用MeV 4.9.0繪制基因的表達(dá)熱圖，并分析基因的表達(dá)模式。

2 結(jié)果與分析

2. 1 番茄NBS-LRR類抗病基因家族成員鑒定結(jié)果

從栽培番茄及野生潘那利和醋栗番茄的基因組序列中分別檢索獲得238、202和217個(gè)NBS-LRR類抗病基因。根據(jù)這些抗病基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域差異，將其分為TNL（TIR-NBS-LRR）、CNL（CC-NBS-LRR）、RNL（RPW8-NBS-LRR）、TN（TIR-NBS）、CN（CC-NBS）、RN（RPW8-NBS）、NL（NBS-LRR）和N（NBS）8種類型（表1）。其中，N型基因最多，為226個(gè)，占NBS-LRR類抗病基因總數(shù)（657個(gè)）的34.4%;TNL、CNL和RNL型基因分別為58、87和13個(gè)，共計(jì)158個(gè)。

2. 2 番茄NBS-LRR類抗病蛋白理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位結(jié)果

158個(gè)番茄TNL、CNL和RNL型NBS-LRR類抗病蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位如表2所示。栽培番茄TNL型蛋白的氨基酸數(shù)為856～2871個(gè)，分子量為98.40～325.87 kD，pI為5.43～8.77，不穩(wěn)定系數(shù)為37.88～51.45，磷酸化氨基酸平均為136個(gè)，其中絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）分別占比67.11%、22.58%和10.30%;nTNL型蛋白的氨基酸數(shù)為696～2613個(gè)，分子量為79.05～298.53 kD，pI為4.85～9.03，不穩(wěn)定系數(shù)為37.93～50.34，磷酸化氨基酸數(shù)平均為100個(gè)，其中Ser、Thr和Tyr分別占比64.69%、27.07%和8.24%。潘那利番茄TNL型蛋白的氨基酸數(shù)為673～2871個(gè)，分子量為76.33～326.23 kD，pI為5.48～8.96，不穩(wěn)定系數(shù)為37.25～52.73，磷酸化氨基酸數(shù)平均為118個(gè)，其中Ser、Thr和Tyr分別占比66.87%、22.78%和10.34%;nTNL型蛋白的氨基酸數(shù)為617～1687個(gè)，分子量為69.79～194.21 kD，pI為5.34～8.62，不穩(wěn)定系數(shù)為39.82～52.41，磷酸化氨基酸數(shù)平均為101個(gè)，其中Ser、Thr和Tyr分別占比67.42%、24.80%和7.78%。醋栗番茄TNL型蛋白的氨基酸數(shù)為973～2871個(gè)，分子量為111.40～325.79 kD，pI為5.42～9.23，不穩(wěn)定系數(shù)為40.45～51.45，磷酸化氨基酸數(shù)平均為128個(gè)，其中Ser、Thr和Tyr分別占比67.02%、22.86%和10.11%;nTNL型蛋白的氨基酸數(shù)為645～2595個(gè)，分子量為73.57～296.37 kD，pI為4.85～8.91，不穩(wěn)定系數(shù)為38.96～49.79，磷酸化氨基酸數(shù)平均為95個(gè)，其中Ser、Thr和Tyr分別占比64.29%、27.14%和8.56%。番茄NBS-LRR類抗病蛋白整體上呈弱酸性，且具有不穩(wěn)定性和親水性，以Ser磷酸化為主，其二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，主要定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體。

對番茄TNL、CNL和RNL型NBS-LRR類抗病蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，繪制得到相應(yīng)氨基酸序列的Logo圖（圖1-A、圖1-B和圖1-C）。保守氨基酸組成的NBS結(jié)構(gòu)域P-loop、Kinase2、RNBS-B和GLPL，TNL和nTNL型NBS-LRR類抗病基因不完全一致，如TNL型基因NBS保守結(jié)構(gòu)域的Kinase2一般以天冬氨酸（Asp）結(jié)尾，而nTNL型一般以色氨酸（Trp）結(jié)尾。說明番茄NBS-LRR類抗病基因在進(jìn)化過程中具有較高的保守性。

2. 3 番茄NBS-LRR類抗病基因染色體定位結(jié)果

通過獲取番茄NBS-LRR類抗病基因的注釋信息（醋栗番茄基因組注釋不完整，故未作分析），分別將栽培番茄的236個(gè)（另外2個(gè)基因不能確定染色體位置）和野生潘那利番茄的202個(gè)NBS-LRR類抗病基因分別不均勻地散布于12條染色體和0號虛擬染色體上（圖2-A和圖2-B）。番茄NBS-LRR類抗病基因集中在染色體端部，且具有成簇分布的特點(diǎn)。栽培番茄各染色體的基因數(shù)為1（0號虛擬染色體）～45（11號染色體）個(gè)，平均為18.15個(gè)，其中138個(gè)（58.47%）基因形成47個(gè)基因簇，平均每簇有2.94個(gè)基因，4號染色體10簇37個(gè)基因，最大簇7個(gè)基因，6號和4號染色體成簇基因均超過80.00%，其他染色體成簇基因數(shù)為0～16個(gè);同時(shí)，84個(gè)（35.59%）基因?yàn)榇?lián)重復(fù)基因，以4號染色體的串聯(lián)重復(fù)基因最多，為29個(gè)，6號染色體上串聯(lián)重復(fù)基因比例最大，為76.92%。潘那利番茄各染色體的基因數(shù)為3（0號虛擬染色體）～31（11號染色體）個(gè)，平均為15.54個(gè)，其中，106個(gè)（52.48%）基因形成39個(gè)基因簇，平均每簇2.72個(gè)基因，11號染色體11簇24個(gè)基因，4號染色體7簇23個(gè)基因，6號染色體最大簇8個(gè)基因，11號、4號和6號染色體成簇基因均超過70.00%，其他染色體成簇基因數(shù)為0～14個(gè);同時(shí)，46個(gè)（22.77%）基因?yàn)榇?lián)重復(fù)基因，以4號染色體最多，為17個(gè)，6號和4號染色體上串聯(lián)重復(fù)基因均超過50.00%。整體來看，番茄4號、6號和11號染色體NBS-LRR類抗病基因成簇和串聯(lián)重復(fù)特點(diǎn)最明顯。

2. 4 番茄NBS-LRR類抗病蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

提取NBS-LRR類抗病蛋白NBS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，去掉氨基酸序列過短的180個(gè)蛋白，對477個(gè)NBS-LRR類抗病蛋白進(jìn)行多重序列比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些抗病蛋白含有多個(gè)相對保守的氨基酸位點(diǎn)，如24-I、26/29/31/127/188-G、32-K、33/34/133/134-T、36/192-A、47/166-F、102/105/152/160/189/191/200/234-L、106/107-D、128/230-S、135-R、190-P和208-W等。由系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3）可知，栽培番茄和2個(gè)野生番茄共477個(gè)NBS-LRR類抗病蛋白可聚為十大類群，其中，N端為TIR結(jié)構(gòu)域的蛋白中僅有1個(gè)蛋白聚在Ⅰ類群，其他65個(gè)蛋白聚在Ⅴ類群;N端為CC結(jié)構(gòu)域的蛋白聚在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅹ等6個(gè)類群;N端為RPW8結(jié)構(gòu)域的蛋白聚在Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ和Ⅸ等4個(gè)類群。因此，N端為TIR的蛋白基本聚在一起，但N端為CC和RPW8結(jié)構(gòu)域的蛋白未能很好分開，聚在多個(gè)類群中;NL和N型基因散布于各類群中。

結(jié)合477個(gè)番茄NBS-LRR抗病基因的聚類分析結(jié)果及其核苷酸序列相似性，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)115對直系同源基因和8對旁系同源基因，占比51.57%，主要分布在4號和5號染色體上。其中，栽培番茄分別與野生醋栗番茄和潘那利番茄形成97（84.35%）和11（9.57%）對直源基因，2個(gè)野生番茄間形成7（6.09%）對直源基因，且同源基因?qū)λ谌旧w對應(yīng)，4號和5號染色體分別為27和16對，其他染色體為5～9對。野生潘那利番茄和栽培番茄各自分別形成7和1對旁源基因。計(jì)算同源基因間非同義（Ka）和同義（Ks）替換率及Ka/Ks值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4對直源基因（Solyc04 g009120.2和Sopim04g009120、Solyc04g009130.3和Sopim04g009130、Solyc11g069020.2和Sopim11g06 9020、Solyc12g044190.2和Sopim12g044190）及2對旁源基因（Sopen10g029640和Sopen10g029660、Sopen11g028600和Sopen11g028610）的Ka/Ks值大于1，說明這6對同源基因受到自然正選擇作用，其他同源基因?qū)a/Ks值均小于1，為純化選擇。[Ⅰ][Ⅹ][Ⅸ][Ⅶ][Ⅵ][Ⅴ][Ⅳ][Ⅲ][Ⅱ][Ⅷ]

2. 5 番茄NBS-LRR類抗病基因在細(xì)菌脅迫下的表達(dá)情況

從54個(gè)栽培番茄TNL、CNL和RNL型NBS-LRR類抗病基因（其他5個(gè)基因數(shù)據(jù)缺失，2個(gè)野生番茄對應(yīng)注釋不可用，故未作分析）的表達(dá)聚類熱圖（圖4）可看出，不同基因可明顯分為兩大類群，其中，Ⅰ類群的16個(gè)基因表達(dá)量較低，Ⅱ類群的38個(gè)基因表達(dá)量較高。其中，31個(gè)基因在4或5種生物脅迫下有較高表達(dá)量，10個(gè)基因在所有生物脅迫下表達(dá)量均較低。Solyc02g082050.3和Solyc01g087200.3在2種假單胞菌和根癌農(nóng)桿菌脅迫下有較高表達(dá)量，Solyc08g0055 10.2在根癌農(nóng)桿菌脅迫下表達(dá)量最高，Agrobacterium tumefaciens和DC3000hrcQ-UfliC脅迫下基因表達(dá)量整體偏低。[Ⅰ][Ⅱ]

3 討論

植物NBS-LRR類抗病基因的數(shù)量和結(jié)構(gòu)，在某種程度上代表了其識別病原物的能力。部分基因NBS結(jié)構(gòu)域不完整，可能與基因進(jìn)化過程中的丟失、假基因化或功能異化有關(guān)。本研究從栽培番茄及野生潘那利番茄和醋栗番茄中分別鑒定獲得238、202和217個(gè)NBS-LRR類抗病基因，共計(jì)657個(gè)，根據(jù)這些基因結(jié)構(gòu)的差異進(jìn)一步將其劃分為8種類型（TNL、CNL、RNL、TN、CN、RN、NL和N），各類型中的分布數(shù)目各不相同，其中，TNL、CNL和RNL型基因數(shù)分別為58、87和13個(gè)。前人在與番茄同屬的馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)419個(gè)NBS-LRR類抗病基因，其中TNL型基因37個(gè)、CNL型基因65個(gè)，二者比值為0.57（Lozano et al.，2012），與本研究中TNL和CNL型基因數(shù)比值（0.67）基本一致，但明顯高于擬南芥的TNL和CNL型基因數(shù)比值1.80（Meyers et al.，2003）。這種不均勻分布可能是基因進(jìn)化和植物環(huán)境適應(yīng)的自然選擇結(jié)果。RNL型蛋白包含RPW8結(jié)構(gòu)域，與植物廣譜抗性密切相關(guān)（Xiao et al.，2003）。磷酸化作為重要的蛋白表觀修飾，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（唐文武等，2017）。而本研究發(fā)現(xiàn)番茄NBS-LRR類抗病蛋白以Ser磷酸化為主，主要是通過改變蛋白結(jié)構(gòu)激活酶活性。此外，本研究對番茄NBS-LRR類抗病基因的NBS結(jié)構(gòu)域進(jìn)行保守性分析，發(fā)現(xiàn)P-loop、Kinase2、RNBS-B和GLPL序列具有較高的相似性，與擬南芥（Meyers et al.，2003）和蝴蝶蘭（蔣卉等，2018）相關(guān)研究結(jié)果一致，表明不同物種NBS-LRR類抗病基因在進(jìn)化過程中具有較高的保守性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NBS保守結(jié)構(gòu)域的Kinase2末端的氨基酸（Asp或Trp）是區(qū)分CNL和TNL型的關(guān)鍵因素（Lozano et al.，2015）。本研究的染色體定位結(jié)果顯示，栽培番茄和野生潘那利番茄的NBS-LRR類抗病基因不均勻地散布在12條染色體和0號虛擬染色體上，其中以4號、5號和11號染色體較多，且主要位于染色體兩端，因此這些基因在進(jìn)化過程中可能更易變異;栽培番茄和野生潘那利番茄均有超過50.00%的基因成簇分布，且分別有35.59%和22.77%的基因?yàn)榇?lián)重復(fù)基因。可見，番茄NBS-LRR類抗病基因具有在染色體上成簇分布的特征，以4號、6號和11號染色體最突出，與擬南芥（Meyers et al.，2003）和馬鈴薯（Lozano et al.，2012）研究結(jié)果相似。基因簇形式有利于抗病基因間的序列交換，且串聯(lián)重復(fù)通常出現(xiàn)在基因簇中，表明串聯(lián)重復(fù)在NBS-LRR抗病基因家族的擴(kuò)張中具有重要作用，也是基因簇形成的主要原因（Liu et al.，2007;劉云飛等，2014a）。

本研究通過構(gòu)建番茄NBS-LRR類抗病蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，大部分N端為TIR結(jié)構(gòu)域的NBS-LRR類抗病蛋白聚類在一起，但N端為CC和RPW8結(jié)構(gòu)域的蛋白未能很好分開，其中以N端為CC結(jié)構(gòu)域的蛋白擴(kuò)張程度最大，散布于6個(gè)類群，其原因可能是含TIR結(jié)構(gòu)域的編碼基因在進(jìn)化過程中發(fā)生丟失現(xiàn)象，或含CC結(jié)構(gòu)域的編碼基因起源更早（Tarr and Alexander，2009）。一般而言，同一進(jìn)化分支上的基因具有較高相似性，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹包含不同染色體上基因組成的混合進(jìn)化分支，反映出這些基因在染色體上的擴(kuò)張情況，可能是基因產(chǎn)生新功能的源泉;同一進(jìn)化分支包含不同物種基因，說明NBS-LRR類抗病基因可能按照物種特異性的方式進(jìn)行擴(kuò)張。本研究對番茄NBS-LRR類抗病基因與已克隆的NBS-LRR類抗病基因（Liu et al.，2007）進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示，NBS-LRR類抗病基因Solyc04g008130.2與Hero、Solyc06g008450.3與Mi-1、Solyc09g098130.2與Sw-5、Solyc09g018220.2與Tm-2、Solyc05g007850.2與Bs4、Solyc11g071995.1與I-2的相似性均在80%以上，說明其具有類似抗病蟲害功能。115對直系同源基因主要源自栽培番茄與野生醋栗番茄之間，且主要分布在4號和5號染色體上，證明其具有較高的遺傳相似性;8對旁系同源基因中有5對是串聯(lián)重復(fù)形成，其中1對來自栽培番茄、4對來自野生潘那利番茄。串聯(lián)重復(fù)基因中同源性偏低，可能與篩選條件過嚴(yán)有關(guān)，也可能是基因重復(fù)后在長期演化中發(fā)生了功能異化。除了6對同源基因外，其他同源基因（95.12%）的Ka/Ks均小于1，表明其受純化選擇作用，基因進(jìn)化動力可能是遺傳漂變（Edwards，2000）。

基于RNA-Seq的番茄NBS-LRR類抗病基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，大多數(shù)基因在4～5種生物脅迫下表達(dá)量較高。雖然抗病基因表達(dá)促使植株產(chǎn)生抗性，但大量抗病基因的高表達(dá)會導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡，因此為減少植物負(fù)擔(dān)，抗病基因表達(dá)量通常較其他基因低（Zhai et al.，2011）。同時(shí)，抗病基因的轉(zhuǎn)錄可能通過小RNA調(diào)控（Fei et al.，2013），或進(jìn)化為假基因甚至在基因組中丟失?？梢姡参镌谂c環(huán)境長期互作中形成了完善的自我調(diào)節(jié)機(jī)制，以保證個(gè)體生存與群體繁衍。對于番茄NBS-LRR類抗病基因家族仍需進(jìn)行針對性地生物學(xué)功能鑒定及挖掘，以推動相關(guān)抗病基因的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

4 結(jié)論

番茄NBS-LRR類抗病基因具有成簇存在的特點(diǎn)，在進(jìn)化過程中經(jīng)重復(fù)擴(kuò)張，已形成大量同源基因，且能響應(yīng)多種生物脅迫。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）