高寧寧 李曉慧 康利允 常高正 梁慎 徐小利 李海倫 王慧穎 趙衛(wèi)星

摘要：【目的】利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)51份西瓜抗、感病毒病種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，為加速西瓜抗病毒病新品種的選育進(jìn)程提供理論參考。【方法】利用篩選出的多態(tài)性引物對(duì)51份抗、感病毒病西瓜種質(zhì)進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，利用NTsys-pc 2.1e中的非加權(quán)組平均法（UPGMA）計(jì)算獲得遺傳相似系數(shù)，利用PopGene Version 3.2計(jì)算不同類型西瓜的遺傳多樣性參數(shù)?！窘Y(jié)果】從500對(duì)SRAP引物組合中篩選出18對(duì)擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定且多態(tài)性較高的引物，共擴(kuò)增出402條清晰可辨的條帶，其中多態(tài)性條帶271條;平均每對(duì)引物可擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰的條帶22.33條，其中多態(tài)性條帶15.06條，平均多態(tài)性比率達(dá)67.41%。觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）為1.6766、有效等位基因數(shù)（Ne）為1.3033、Neis基因多樣性指數(shù)（H）為0.1878、Shannons信息指數(shù)（I）為0.2931，除感病毒型西瓜種質(zhì)的Na高于抗病毒型西瓜種質(zhì)外，感病毒型西瓜種質(zhì)的其他遺傳多樣性指數(shù)均低于抗病毒型西瓜種質(zhì)，表明抗病毒型西瓜種質(zhì)的遺傳多樣性較感病毒型西瓜種質(zhì)豐富?？共《拘团c感病毒型西瓜種質(zhì)的遺傳一致度為0.8924，遺傳距離為0.1138。供試西瓜種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.95。在遺傳相似系數(shù)0.78處，可將51份供試西瓜種質(zhì)劃分為四大類群，抗病毒型西瓜種質(zhì)分布在Ⅰ和Ⅱ類群中，感病型種質(zhì)均集中在第Ⅲ、Ⅳ類群中，野生西瓜種質(zhì)與其他西瓜種質(zhì)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。遺傳相似系數(shù)矩陣和UPGMA聚類矩陣之間的相關(guān)性明顯（r=0.914），可準(zhǔn)確地體現(xiàn)供試西瓜種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系?！窘Y(jié)論】篩選出的SRAP引物組合具有較好的品種鑒別能力，可用于西瓜種質(zhì)的遺傳多樣性分析。抗病毒型與感病毒型西瓜種質(zhì)的親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性豐富度不高，應(yīng)加大發(fā)掘優(yōu)良抗病種質(zhì)資源力度，以拓寬西瓜的遺傳基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 西瓜;SRAP;遺傳多樣性;抗病毒;分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)： S651.034? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）05-1174-09

Abstract：【Objective】To provide theoretical referencefor acceleratingthe breeding process of antivirus varieties of watermelon，the genetic diversity of 51 germplasm resources of antivirus watermelon were analyzed by SRAP molecular markers. 【Method】The polymorphic primers were selected to amplify 51 antivirus and susceptible germplasm resources of watermelon.The genetic similarity coefficients were calculated by unweighted pair group method with arithmetic avera-ge（UPGMA） by NTsys-pc 2.1e. Genetic diversity parameters of different types of watermelon were calculated by PopGene Version 3.2. 【Result】Eighteenpairs of primers with clear and stable bands and high amplified polymorphism were selected from 500 pairs of SRAP primers，and a total of 402 clearly identifiable bands were amplified，among which 271 were polymorphic bands. And 22.33 stable and clear bands were amplified on average with each pair of primers，including 15.06 polymorphic bands，with an average polymorphism rate of 67.41%. The observed number of alleles（Na） was 1.6766，the effective number of alleles（Ne） was 1.3033，the diversity index of Neis gene（H） was 0.1878，and the Shannons information index（I） was 0.2931. Except the Na of susceptible watermelon germplasmswas higher than that of antivirus watermelon germplasms，the other genetic diversity indexes of antivirus watermelon germplasms was higher than that of susceptible watermelon germplasms. The results showed that the genetic diversity of antivirus watermelon germplasms was higher than that of virus susceptible watermelon germplasms. The genetic consistency and genetic distance of the virus resistant and susceptible watermelon germplasms were 0.8924 and 0.1138 respectively. The genetic similarity coefficients of the experimental watermelon germplasms were between 0.62-0.95. With the genetic similarity coefficient of 0.78 as the boundary，51 watermelon germplasms were divided into four groups. Antiviral type of watermelon germplasms were in groupsⅠ and Ⅱ，and virus susceptible type of watermelon germplasms were concentrated in groups Ⅲ and Ⅳ，and wild watermelon materials and other watermelon varieties showed the most distantly related.The correlation between the genetic similarity coefficient matrix and the UPGMA clustering matrix was obvious（r=0.914），which accurately reflected the genetic relationship among the watermelon germplasms. 【Conclusion】The selected SRAP primer combinations have good ability of variety identification and can be used for the analysis of watermelon germplasm genetic diversity. The germplasm of antivirus and virus susceptible type are closely related， so the genetic diversity is not high. Excellent di-sease-resistant germplasms should be explored to broaden the genetic base of watermelon.

Key words： watermelon; SRAP; genetic diversity; antivirus; molecular markers

Foundation item： National Melon Industrial Technology System Construction Project（CARS-25）; Henan? Key Research and Promotion Special Project（192102110036，202102110041）; Innovation Project of Henan Academy of Agricultural Sciences（2020ZC21）

0 引言

【研究意義】西瓜是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，病毒病是其重要病害（吳洋等，2017）。隨著我國(guó)西瓜種植面積增大，病毒種類也逐漸增加，病毒病發(fā)生可造成30%～50%的經(jīng)濟(jì)損失，甚至絕收，其果實(shí)品質(zhì)也大幅降低（Kang et al.，2005;王凱娜，2018）。常規(guī)的化學(xué)防治無(wú)法有效地控制西瓜病毒病的發(fā)生，選育抗病品種是最經(jīng)濟(jì)有效的手段之一。但目前制約西瓜抗病毒病育種研究的最重要因素是其抗病毒種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)較狹窄。因此，收集、保存、篩選抗病毒西瓜種質(zhì)資源，并進(jìn)行其遺傳多樣性分析對(duì)抗病毒西瓜種質(zhì)資源的利用及抗病毒育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前已利用分子生物學(xué)手段對(duì)收集保存的抗病毒西瓜種質(zhì)資源進(jìn)行基因挖掘，從而找出未被發(fā)現(xiàn)的抗病毒基因的潛在種質(zhì)資源成了我國(guó)西瓜育種工作的重要部分（Xu et al.，2004;張永兵等，2013）。SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）分子標(biāo)記是一種基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，具有簡(jiǎn)便快捷、多態(tài)性高、穩(wěn)定等特點(diǎn)（Li and Quiros，2001），已廣泛應(yīng)用在番茄（王燕等，2007）、甘藍(lán)（張羽等，2017）、甜瓜（陳蕓等，2010;高寧寧等，2019b）等作物相關(guān)研究上。據(jù)報(bào)道，已利用SRAP分子標(biāo)記進(jìn)行西瓜品種指紋圖譜構(gòu)建（趙勝杰等，2009）、基因關(guān)聯(lián)分析（羊杏平等，2013）、種子純度鑒定（韓宏偉等，2017）等。利用SRAP分子標(biāo)記分析西瓜遺傳多樣性的研究主要集中在對(duì)雜交種遺傳多樣性分析（李嚴(yán)和張春慶，2005）、西瓜不同地域種質(zhì)資源遺傳多態(tài)性分析（趙勝杰等，2010）、地方品種遺傳差異分析（Solmaz et al.，2016）及其在品種DUS測(cè)試中的應(yīng)用（劉麗娟等，2011）等方面。【本研究切入點(diǎn)】目前西瓜抗病毒病研究多集中在抗性基因定位（劉潔，2019）及其轉(zhuǎn)基因研究（吳會(huì)杰等，2009）等方面。鮮見(jiàn)利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)西瓜抗感病毒病種質(zhì)資源進(jìn)行分類、鑒定及遺傳多樣性分析等方面的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)51份抗、感病毒病西瓜種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，為抗病毒型西瓜種質(zhì)資源的高效利用提供有力保障，加速西瓜抗病毒型新品種的選育進(jìn)程。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的51份西瓜種質(zhì)為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所西甜瓜研究室從全國(guó)各地收集并經(jīng)過(guò)多年種植觀察的品種（系），其中，1～9號(hào)為抗病毒型品種，10～51號(hào)為感病毒型品種（表1）。2×Taq MasterMix和DL2000 DNA Marker購(gòu)自BioTeke公司。主要儀器設(shè)備：Thermal Cycler2720 PCR擴(kuò)增儀、臺(tái)式高速離心機(jī)和多功能紫外分光光度計(jì)。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 DNA提取 將51份西瓜種質(zhì)于溫室穴盤(pán)中育苗，待西瓜幼苗長(zhǎng)出2～3片真葉時(shí)，取少量鮮嫩的葉片，用破碎儀進(jìn)行破碎。采用改良的CTAB方法提取西瓜基因組DNA（李金路等，2013），用紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度，將提取的DNA樣品稀釋成30 ng/μL工作液后放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 SRAP引物篩選 SRAP反應(yīng)體系15.0 μL：2×Taq MasterMix 7.5 μL，30 ng/μL DNA模板1.0 μL，0.4 μmol/L正、反向引物各0.4 μL，ddH2O補(bǔ)足至15.0 μL，擴(kuò)增程序參考黃春瓊等（2015）的方法。利用抗病毒型西瓜品種野生-2和感病毒型西瓜品種18-268對(duì)500對(duì)SRAP引物進(jìn)行篩選（表2），利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)（梁寶萍等，2012），篩選出擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定且多態(tài)性豐富的引物對(duì)。

1. 2. 3 統(tǒng)計(jì)分析 將電泳圖譜上出現(xiàn)條帶的記為“1”，相同位置沒(méi)有條帶的記為“0”，形成原始數(shù)字矩陣。利用NTsys-pc 2.1e中的非加權(quán)組平均法（UPGMA）計(jì)算獲得遺傳相似系數(shù)，使用Treeplot模塊進(jìn)行聚類分析;用PopGene Version 3.2計(jì)算不同類型西瓜的遺傳多樣性參數(shù)，包括遺傳一致度、遺傳距離、觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣性指數(shù)（H）、Shannons信息指數(shù)（I），并用Cophenetic相關(guān)性方法對(duì)聚類分析結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SRAP引物篩選及多態(tài)性分析結(jié)果

選用抗病毒型西瓜品種野生-2和感病毒型西瓜品種18-268，從500對(duì)引物組合中篩選出18對(duì)擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定且擴(kuò)增多態(tài)性較高的引物組合（表3）。利用篩選出的多態(tài)性引物組合對(duì)51份西瓜種質(zhì)進(jìn)行SRAP分子標(biāo)記擴(kuò)增，結(jié)果共擴(kuò)增出402條清晰可辨的條帶，其中多態(tài)性條帶271條;平均每對(duì)引物組合可擴(kuò)增出22.33條條帶，其中多態(tài)性條帶15.06條，平均多態(tài)性比率達(dá)67.41%。每對(duì)引物組合擴(kuò)增出的條帶數(shù)為13～40條;me10-em9和me10-em11引物組合擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)最多，為26條;me14-em25和me16-em25引物組合擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)最少，僅有7條。18對(duì)引物組合多態(tài)性比率為52.94%～82.35%，其中，引物組合me10-em7擴(kuò)增多態(tài)性比率最高，me17-em5擴(kuò)增多態(tài)性比率最低。表明篩選出的SRAP引物組合具有較好的品種鑒別能力，SRAP分子標(biāo)記方法可用于西瓜種質(zhì)材料的遺傳多樣性分析。圖1為引物組合me10-em11對(duì)51份西瓜種質(zhì)的擴(kuò)增結(jié)果。

2. 2 西瓜抗病毒病種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析結(jié)果

51份西瓜種質(zhì)資源按照抗病情況分為抗病毒型和感病毒型，通過(guò)軟件PopGene Version 32計(jì)算不同類型西瓜的遺傳多樣性參數(shù)（表4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗病毒型和感病毒型西瓜種質(zhì)的Na分別為1.5224和1.5796，總體均值為1.6766;Ne分別為1.2685和1.2579，總體均值為1.3033;H分別為0.1637和0.1593，總體均值為0.1878;I分別為0.2513和0.2484，總體均值為0.2931。由此可知，供試51份西瓜種質(zhì)具有較豐富的遺傳多樣性，除感病毒型西瓜種質(zhì)的Na高于抗病毒型西瓜種質(zhì)外，感病毒型西瓜種質(zhì)的其他遺傳多樣性指數(shù)均低于抗病毒型西瓜種質(zhì)，表明抗病毒型西瓜種質(zhì)的遺傳多樣性較感病毒型西瓜種質(zhì)豐富?？共《拘团c感病毒型西瓜種質(zhì)的遺傳一致度為0.8924，遺傳距離為0.1138（表5），表明2種類型西瓜種質(zhì)親緣關(guān)系較近。

2. 3 西瓜抗病毒病種質(zhì)資源的聚類分析

根據(jù)SRAP擴(kuò)增圖譜的矩陣，利用NTsys-pc 2.1e計(jì)算遺傳相似系數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，51份供試西瓜種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.95（表6）?？共《拘臀鞴掀贩N野生-2與感病毒型西瓜品種17Y6、17Y15、18-121、18-247、18-268、18-277、18-424、18-512、18-516和18-642間，以及抗病毒型野生-1與感病毒型18-512間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.62，表明這11對(duì)種質(zhì)間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，同為感病毒型西瓜品種的18-516與18-602間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.95，表明二者的親緣關(guān)系最近。

聚類分析結(jié)果（圖2）顯示，在遺傳相似系數(shù)0.78處可將51份供試西瓜種質(zhì)劃分為四大類群。其中，Ⅰ類群包含2份種質(zhì)，均為抗病毒型野生西瓜，Ⅱ類群包含7份種質(zhì)，均為抗病毒型品種（系）;Ⅲ和Ⅳ類群分別包含3和39份種質(zhì)，均為感病毒型西瓜品種（系），結(jié)果表明抗病毒型與感病毒型西瓜種質(zhì)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，抗病毒型野生西瓜種質(zhì)與其他抗病毒型種質(zhì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，感病毒型西瓜種質(zhì)間的親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性較低。

利用Cophenetic相關(guān)性方法檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)遺傳相似性系數(shù)矩陣和聚類結(jié)果轉(zhuǎn)化矩陣的相關(guān)性及吻合度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)矩陣相關(guān)系數(shù)r為0.914，說(shuō)明遺傳相似性數(shù)據(jù)矩陣與聚類結(jié)果轉(zhuǎn)化的矩陣間呈明顯相關(guān)性，聚類結(jié)果可較好地體現(xiàn)供試西瓜種質(zhì)的遺傳關(guān)系。

3 討論

SRAP分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)快捷簡(jiǎn)單，且穩(wěn)定性好、多態(tài)性高，已廣泛應(yīng)用于多種作物的遺傳多樣性研究。本研究從500對(duì)引物組合中篩選出18對(duì)擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定且多態(tài)性較高的引物，對(duì)51份西瓜種質(zhì)進(jìn)行SRAP分子標(biāo)記擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出402條清晰可辨的條帶，其中多態(tài)性條帶271條，平均每對(duì)引物組合可擴(kuò)增出條帶22.33條，其中多態(tài)性條帶15.06條，引物組合多態(tài)比率為52.94%～82.35%，平均多態(tài)比率達(dá)67.41%。Wang等（2015）利用25對(duì)SRAP引物對(duì)61份不同地域西瓜種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行研究，平均每對(duì)引物擴(kuò)增條帶12.5條，其中多態(tài)性條帶6.5條，多態(tài)性比率52.24%，低于本研究平均每對(duì)引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)及多態(tài)性比率，說(shuō)明本研究供試的西瓜種質(zhì)多態(tài)性較豐富。但本研究測(cè)得的多態(tài)性比率低于前人利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)甘薯（張凱等，2013）（78.4%）、西瓜（Solmaz et al.，2016;Pandey et al.，2019）（97.3%、95.4%）、甜瓜（楊永等，2017）（96%）等測(cè)得的多態(tài)性比率，可能與供試材料的數(shù)量和來(lái)源地的豐富度有關(guān)。

目前Na、Ne、H和I是衡量物種群居變異程度和多態(tài)性的重要遺傳多樣性參數(shù)（Nei，1978）。供試的51份西瓜種質(zhì)的Na、Ne、H和I分別為1.6766、1.3033、0.1878、0.2931，均高于高寧寧等（2019a）研究獲得的26份抗早衰甜瓜種質(zhì)基于SRAP分子標(biāo)記的遺傳多樣性參數(shù)（1.5418、1.3007、0.1795、0.2714），表明供試西瓜種質(zhì)的遺傳多樣性較豐富。但本研究遺傳多樣性參數(shù)均低于陳蕓等（2016）研究獲得的42份新疆甜瓜種質(zhì)基于SRAP分子標(biāo)記的遺傳多樣性參數(shù)（2.0000、1.4750、0.2876、0.4435）、郭祿芹等（2018）對(duì)167份西瓜種質(zhì)基于SSR分子標(biāo)記的的遺傳多樣性參數(shù)（4.86、2.20、0.27、0.94）。與陳蕓等（2016）的結(jié)果相比，本研究供試材料多態(tài)性比率較高，但遺傳多樣性參數(shù)較低，可能與選擇樣本種類和樣本來(lái)源地域豐富度有關(guān)。感病毒型西瓜種質(zhì)的Na（1.5796）高于抗病毒型西瓜種質(zhì)的Na（1.5224），但對(duì)于其他遺傳多樣性參數(shù)Ne、H和I，抗病毒型西瓜種質(zhì)（1.2685、0.1637和0.2513）均高于感病毒型西瓜種質(zhì)（1.2579、0.1593和0.2484），表明抗病毒型西瓜種質(zhì)的遺傳多樣性較感病毒型西瓜種質(zhì)豐富。抗病毒型和感病毒型西瓜種質(zhì)的遺傳一致度為0.8924，遺傳距離為0.1138，說(shuō)明2種類型西瓜種質(zhì)親緣關(guān)系較近，同時(shí)也表明SRAP標(biāo)記能區(qū)別親緣關(guān)系較近的種質(zhì)。綜上所述，供試西瓜種質(zhì)的變異類型和遺傳多樣性豐富度不高，表明供試西瓜種質(zhì)的遺傳背景較狹窄單一。

明確西瓜種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和遺傳變異信息，從而有目的地選配親本，才能加快優(yōu)良品種的培育進(jìn)程（羅世杏等，2018）。本研究供試西瓜種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.95，表明種質(zhì)間遺傳差異度小，其中，抗病毒型西瓜品種野生-2和感病毒型的10個(gè)西瓜種質(zhì)及野生-1和抗病毒型西瓜品種18-512間的遺傳相似系數(shù)最小，表明野生-1和野生-2與其他供試西瓜種質(zhì)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本研究聚類分析結(jié)果顯示，可將51份供試西瓜種質(zhì)資源劃分為四大類群，其中Ⅰ類群包含2份種質(zhì)，均為抗病毒型野生西瓜;Ⅱ類群包含7份種質(zhì)，均為抗病毒型西瓜品種;Ⅲ和Ⅳ類群類群分別包含3和39份種質(zhì)，均為感病型西瓜品種（系），表明抗病毒型野生西瓜與其他供試西瓜種質(zhì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與遺傳相似系數(shù)分析結(jié)果一致;且抗病毒型和感病毒型西瓜種質(zhì)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳差異較大，感病毒型西瓜種質(zhì)間的親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性較低。遺傳相似系數(shù)矩陣和UPGMA聚類結(jié)果轉(zhuǎn)化矩陣之間的相關(guān)系數(shù)（r=0.914）呈明顯相關(guān)，說(shuō)明18對(duì)SRAP引物能較好地體現(xiàn)供試西瓜的遺傳多樣性信息。

利用SRAP分子標(biāo)記和關(guān)聯(lián)性分析法可準(zhǔn)確地反映供試材料間的親緣關(guān)系和遺傳差異（龐新華等，2019），從而得到科學(xué)可靠的結(jié)果，便于育種工作者科學(xué)合理地選配親本。我國(guó)西瓜種質(zhì)資源遺傳背景較狹窄，應(yīng)加大發(fā)掘優(yōu)良抗病毒型種質(zhì)資源的力度，選擇遺傳差異度大的雜交親本，拓寬西瓜的遺傳基礎(chǔ)，提高抗病種質(zhì)創(chuàng)新效率。同時(shí)，今后還應(yīng)注重對(duì)野生資源和地方品種的利用，提高西瓜抗病種質(zhì)資源的遺傳多樣性。

4 結(jié)論

篩選出的SRAP引物組合具有較好的品種鑒別能力，可用于西瓜種質(zhì)的遺傳多樣性分析?？共《拘臀鞴戏N質(zhì)與感病毒型西瓜種質(zhì)的親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性豐富度不高，應(yīng)加大發(fā)掘優(yōu)良抗病毒型種質(zhì)資源力度，以拓寬西瓜的遺傳基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）