超聲波輔助酶法提取玉米黃色素的工藝研究

黃 浩，翁 霞

(1.北京聯(lián)創(chuàng)種業(yè)有限公司 北方事業(yè)部，北京 100020；2.鞍山師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 鞍山 114007)

玉米黃色素在自然界中分布廣泛，主要由玉米黃素、葉黃素和隱黃素組成，是一種具有多重保健功能的天然食用色素[1].玉米黃色素具有抗氧化、改善老年黃斑病變、治療白內(nèi)障、預(yù)防癌癥、預(yù)防心腦血管疾病的作用.在食品工業(yè)中，玉米黃色素作為天然食品色素逐漸取代檸檬黃和日落黃等合成色素，1996年被列為允許添加食用的天然色素之一.《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760-2014)中，玉米黃色素的最大添加量為5.0 g/kg[2]，因此，玉米黃色素作為功能性成分具有廣闊的市場前景，其提取研究也逐漸成為熱點(diǎn).

目前，提取玉米黃色素的方法主要有有機(jī)溶劑浸提法[3]、索氏提取法、超聲波法[4-5]、超臨界流體萃取法[6]等多種.酶法是利用酶的水解效應(yīng)專一性地破壞玉米細(xì)胞的細(xì)胞壁[7]，超聲波法是利用機(jī)械作用和乳化效應(yīng)破壞玉米細(xì)胞的細(xì)胞壁[8]，而將酶法和超聲波法結(jié)合使用比較少見.該法利于玉米黃色素的溶出，為玉米黃色素的提取開辟了一條新的途徑.

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

玉米：市售，購于鞍山市某超市.

無水乙醇(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；纖維素酶、木瓜蛋白酶(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司).無水乙醇為分析純，其余試劑均為生物純.

UV-110型紫外可見分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)；PL2002電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；BSA-CW電子天平(萬分之一天平)(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；FZ102微型植物粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；80-2B臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；KQ5200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

1.2 主要方法

1.2.1 玉米黃色素的提取 稱取5.00 g玉米，粉碎40 目后，加入60%乙醇配制的1.4%的纖維素酶液30 mL，55 ℃水浴2 h后，放入超聲裝置中，55 ℃超聲15 min取出，4 000 r/min離心10 min，樣品提取液稀釋后，于可見分光光度計(jì)400～800 nm吸收波長下掃描，玉米黃色素的最大吸收波長為445 nm，以下測定均在該波長進(jìn)行.

1.2.2 玉米黃色素的酶法提取 稱取5.00 g玉米，粉碎40 目后，分3種情況進(jìn)行提取：(1)60%乙醇30 mL，55 ℃超聲15 min；(2)60%乙醇配制的1.4%的纖維素酶液30 mL，55 ℃水浴2 h；(3)60%乙醇配制的1.4%的木瓜蛋白酶液30 mL，55 ℃水浴2 h.分別將樣液取出，4 000 r/min離心10 min，樣品提取液稀釋后于最大吸收波長處測定吸光度值.

1.2.3 超聲波輔助酶法提取玉米黃色素條件 按1.2.1提取，分別考察酶解溫度55,60,65,70,75 ℃；乙醇濃度40%,50%,60%,70%,80%,90%；纖維素酶液濃度0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%,1.2%,1.4%,1.6%；酶解時(shí)間1,2,3,4,5 h；提取液體積20,25,30,35,40 mL；超聲溫度45,50,55,60,65 ℃，以及超聲時(shí)間5,10,15,20,25 min對玉米黃色素提取液吸光度值的影響.根據(jù)以上單因素結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定最佳提取條件.

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助酶法與超聲波輔助提取玉米黃色素比較

由表1可知，超聲波輔助酶法提取玉米黃色素提取效果較單純超聲波提取效果好，且超聲波輔助纖維素酶比超聲波輔助蛋白酶要好，提取量更大，以下測定結(jié)果為3次試驗(yàn)結(jié)果平均值，從而確定超聲波輔助纖維素酶法進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn).

表1 不同方法提取玉米黃色素的結(jié)果比較

2.2 超聲波輔助酶法提取玉米黃色素的單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 酶解溫度的確定 由表2可知，當(dāng)溫度小于65 ℃時(shí)，纖維素酶活性未達(dá)到最大，提取量隨溫度上升而逐漸增加；當(dāng)溫度高于65 ℃時(shí)，纖維素酶的活性逐漸下降，甚至喪失，玉米黃色素的提取量逐漸下降；當(dāng)酶解溫度為65 ℃時(shí)，纖維素酶活性最大，提取效果最好.

表2 酶解溫度對玉米黃色素提取量的影響

2.2.2 乙醇濃度的確定 由表3可知，玉米黃色素的提取量乙醇濃度的增加而逐漸增加，在乙醇濃度為80%時(shí)，達(dá)到最大，后又有所降低，說明乙醇濃度為80%時(shí)，有利于纖維素酶發(fā)揮作用，或有利于玉米黃色素的溶解，提取效果最好.

表3 乙醇濃度對玉米黃色素提取量的影響

2.2.3 纖維素酶濃度的確定 由表4可知，隨著酶濃度的增加，玉米黃色素的提取量逐漸增加，當(dāng)增大到1.2%時(shí)，提取量變化緩慢，從節(jié)約試劑的角度考慮，選擇1.2%纖維素酶濃度，既經(jīng)濟(jì)又能收到較好的提取效果.

表4 纖維素酶濃度對玉米黃色素提取量的影響

2.2.4 酶解時(shí)間的確定 由表5可知，玉米黃色素的提取量隨酶解時(shí)間的增加先增加后減少，酶解時(shí)間為2 h和3 h時(shí)，提取量相當(dāng)，但從成本和效率方面考慮，酶解2 h優(yōu)于酶解3 h，故確定最佳酶解時(shí)間為2 h.

表5 酶解時(shí)間對玉米黃色素提取量的影響

2.2.5 料液比的確定 由表6可知，玉米黃色素的提取量隨料液比的增加先增加后減少，在1∶6時(shí)，提取量達(dá)最大，故確定最佳料液比為1∶6.

表6 料液比對玉米黃色素提取量的影響

2.2.6 超聲溫度的確定 由表7可知，隨著超聲溫度的增加，玉米黃色素提取量逐漸增加，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，吸光度值達(dá)到最大，提取效果最好.

表7 超聲溫度對玉米黃色素提取量的影響

2.2.7 超聲時(shí)間的確定 由表8可知，隨著超聲時(shí)間的延長，玉米黃色素的提取量先增加后減小，在15 min時(shí)吸光度值最大，提取效果最好.

表8 超聲時(shí)間對玉米黃色素提取量的影響

2.3 超聲波輔助酶法提取玉米黃色素的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

以玉米黃色素提取液吸光度值為參考指標(biāo)，在上述單因素中料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間經(jīng)單因素多次重復(fù)檢驗(yàn)，無顯著性差異，因此在以下正交試驗(yàn)表中不涉及這3個(gè)因素.設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9(34)，試驗(yàn)因素水平及結(jié)果見表9.

表9 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理

由表9可知，各因素對超聲波輔助酶法提取玉米黃色素量影響的主次順序?yàn)锳(酶解溫度)>C(酶解時(shí)間)>B(乙醇濃度)>D(纖維素酶濃度)，得出最佳的組合條件為A3B3C3D3，將試驗(yàn)3經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得吸光度值為0.552，提取效果優(yōu)于A3B3C3D3，因此確定最佳提取組合為A1B3C3D3，即酶解溫度為60 ℃，酶解時(shí)間為2.5 h，乙醇濃度為85%，纖維素酶濃度為1.4%.

由表10知，酶解溫度對提取量的影響達(dá)到了顯著水平，而酶解時(shí)間、乙醇濃度和纖維素酶濃度對提取量影響不顯著.

表10 方差分析表

3 結(jié)論

超聲波和纖維素酶協(xié)同提取玉米黃色素時(shí)，纖維素酶的酶解作用較超聲波對提取效果影響更大.超聲波輔助酶法提取玉米黃色素的最佳條件為：酶解溫度為60 ℃，酶解時(shí)間為2.5 h，乙醇濃度為85%，纖維素酶濃度1.4%.此時(shí)，玉米黃色素提取液的吸光度值達(dá)0.552，提取效果最好.