金兵男,江鑫銘,李霄霞,趙春華

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)系,山東 青島 266071)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是目前國(guó)內(nèi)外研究最多的一類(lèi)成體干細(xì)胞[1-4]，其來(lái)源廣泛，在脂肪、骨髓、臍帶、胎盤(pán)等多種成體組織中均廣泛存在[5]。其中，人脂肪來(lái)源MSCs(hAMSCs)已成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的理想種子細(xì)胞[6-10]。然而，在應(yīng)用MSCs移植治療骨質(zhì)疏松等疾病的過(guò)程中常有炎癥或細(xì)菌感染等情況發(fā)生，嚴(yán)重影響了MSCs移植的存活率和治療效果。因此，尋找MSCs預(yù)處理方式，提高M(jìn)SCs移植存活率，增強(qiáng)體內(nèi)治療效果，對(duì)MSCs的臨床應(yīng)用具有重要意義[11-13]。Toll樣受體(TLRs)作為一類(lèi)在固有免疫和適應(yīng)性免疫中具有重要作用的模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別大量病原相關(guān)分子，介導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，維持機(jī)體的平衡狀態(tài)，MSCs中也有部分表達(dá)TLRs[14]。已有研究顯示，表達(dá)TLR3的MSCs在TLR3被Poly(I:C)活化后表現(xiàn)出抗炎作用，TLRs活化能夠?qū)SCs的成骨分化產(chǎn)生影響[15]。使用Poly(I:C)活化MSCs的TLR3可以作為一種重要的MSCs預(yù)處理方法。本研究探討TLR3活化對(duì)hAMSCs增殖及成骨分化的影響，為hAMSCs在骨質(zhì)疏松等疾病治療中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

實(shí)驗(yàn)所用hAMSCs為吸脂術(shù)病人廢棄的脂肪組織原代分離擴(kuò)增獲得； DMEM高糖、DME/F12培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)于Excell公司；青霉素和鏈霉素購(gòu)于新賽美公司；膠原酶P購(gòu)于美國(guó)Roche公司；堿性磷酸酶試劑盒、CCK8試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix購(gòu)于上海翊圣公司；Poly(I:C)、油紅O、茜素紅購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒、磷酸酶抑制劑購(gòu)于上海雅酶公司；D-hank’s液、PBS、組織裂解液購(gòu)于北京索萊寶公司；小鼠抗人FITC-CD14、FITC-CD34、FITC-CD45、PE-CD73、FITC-CD90、PE-CD105、FITC-HLA-DR購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 hAMSCs的分離培養(yǎng)

取成人吸脂術(shù)采集的脂肪組織，D-hank’s液清洗去除血細(xì)胞和麻醉藥物。加入適量2 g/L膠原酶P，37 ℃恒溫?fù)u床消化30 min，100目篩網(wǎng)濾去未消化組織。加入足量D-hank’s液，1 500 r/min離心10 min，棄上清，重復(fù)2次。重懸細(xì)胞沉淀，接種于hAMSCs培養(yǎng)基中，于含CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃恒溫培養(yǎng)，每3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫學(xué)表型

胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，PBS清洗、重懸，加入相應(yīng)直標(biāo)抗體4 ℃孵育30 min，PBS清洗2次，重懸，流式細(xì)胞儀上檢測(cè)MSCs免疫學(xué)表型。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞增殖檢測(cè)

取第6代hAMSCs以每孔1×104的密度接種于96孔板中，隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組不作處理，TLR3組加入20 mg/L Poly(I：C)工作液處理6 h活化TLR3。分別在活化后的0、24和48 h時(shí)每孔加入 CCK8工作液10 μL，37 ℃孵育90 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，以其表示hAMSCs增殖能力。

1.5 hAMSCs體外成骨誘導(dǎo)分化及鑒定

取第6代hAMSCs以5×103/cm2的密度接種于24孔板中，待其生長(zhǎng)至80%融合時(shí)加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS、 2×10-4mol/L抗壞血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的DMEM高糖培養(yǎng)基)誘導(dǎo)成骨分化，3 d更換1次新鮮成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。①堿性磷酸酶染色：成骨誘導(dǎo)3 d后，PBS沖洗2次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，加入堿性磷酸酶染色工作液，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，光鏡下觀察對(duì)照組和TLR3組hAMSCs堿性磷酸酶活性變化情況。②茜素紅染色：成骨誘導(dǎo)12 d后，PBS沖洗2次，用40 g/L多聚甲醛室溫固定10 min，1 g/L茜素紅染色工作液室溫染色30 min；PBS沖洗3次后，在光鏡下觀察對(duì)照組和TLR3組hAMSCs鈣質(zhì)沉積情況。

1.6 hAMSCs體外成脂誘導(dǎo)分化及鑒定

取第6代hAMSCs，以5×103/cm2的密度接種于24孔板中，待其生長(zhǎng)至90%融合時(shí)加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基中含有體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS、1×10-6mol/L地塞米松、50 mg/L抗壞血酸和100 mg/L IBMX)誘導(dǎo)成脂分化，每3 d更換1次新鮮成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。成脂誘導(dǎo)12 d后，PBS沖洗2次，40 g/L多聚甲醛室溫固定10 min，油紅O染色工作液室溫染色30 min；PBS沖洗3次，光鏡下觀察hAMSCs脂滴形成情況。

1.7 Real-time PCR檢測(cè)成骨標(biāo)志基因runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)和骨鈣素(OCN)mRNA表達(dá)

取第6代hAMSCs以5×103/cm2的密度接種于6孔板中，隨機(jī)分為T(mén)LR3組和對(duì)照組，對(duì)照組不做處理，TLR3組用含有20 mg/L Poly(I:C)的正常培養(yǎng)基處理6 h，按照總RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)提取兩組樣本的細(xì)胞總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：25 ℃、5 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。按照熒光定量試劑盒配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、30 s，變性95 ℃、10 s，退火/延伸60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算hAMSCs成骨標(biāo)志基因RUNX2和OCNmRNA表達(dá)情況。所用基因引物序列見(jiàn)表1。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 PCR引物及其序列

1.8 Western Blot方法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

細(xì)胞按1.7方法分組及處理后，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，蛋白樣品應(yīng)用SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)蛋白至硝酸纖維素膜上；50 g/L BSA室溫封閉90 min，添加一抗(β-actin、GAPDH、RUNX2、OCN、P65、p-P65，1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，添加羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育60 min， 使用超敏ECL發(fā)光液顯影，Image J軟件分析條帶灰度值，以GAPDH或β-actin作為對(duì)照，計(jì)算目的蛋白R(shí)UNX2、OCN、P65和p-P65相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 hAMSCs形態(tài)、免疫學(xué)表型及成脂成骨分化能力鑒定

在光鏡下觀察，原代分離培養(yǎng)后的hAMSCs呈長(zhǎng)梭形，旋渦狀分布，貼壁生長(zhǎng)(圖1A)；堿性磷酸酶染色后細(xì)胞可見(jiàn)藍(lán)色沉淀，表明hAMSCs開(kāi)始向成骨細(xì)胞分化(圖1B)；茜素紅染色細(xì)胞可見(jiàn)染成紅色的鈣質(zhì)沉淀，表明hAMSCs成骨誘導(dǎo)12 d后分化為成骨細(xì)胞，分泌了大量鈣質(zhì)沉積(圖1C)；油紅O染色后細(xì)胞中可見(jiàn)紅色脂滴，表明hAMSCs成脂誘導(dǎo)12 d后分化為脂肪細(xì)胞(圖1D)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hAMSCs的免疫學(xué)表型結(jié)果顯示，CD14陽(yáng)性率為0.9%，CD34陽(yáng)性率0.4%，CD45陽(yáng)性率0.5%，HLA-DR陽(yáng)性率0.8%，均<5%；CD73陽(yáng)性率為98.7%，CD90陽(yáng)性率98.5%，CD105陽(yáng)性率95.4%，F(xiàn)LK-1陽(yáng)性率96.0%，均>95%。符合國(guó)際細(xì)胞學(xué)會(huì)對(duì)于MSCs的定義(圖1E)。證明從人脂肪組織中原代分離的細(xì)胞為hAMSCs。

2.2 各組hAMSCs增殖能力比較

CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組與TLR3組比較，hAMSCs活化后0、24和48 h時(shí)增殖能力差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組hAMSCs增殖能力比較

2.3 各組RUNX2和OCN mRNA及蛋白表達(dá)的比較

Real-time PCR檢測(cè)顯示，TLR3組RUNX2和OCN的mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著增加(t=14.39、36.36，P<0.01)。Western Blot檢測(cè)顯示，TLR3組RUNX2和OCN蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組(t=3.46、2.98，P<0.05)。見(jiàn)圖2A、B和表3。茜素紅染色結(jié)果顯示，TLR3組紅色鈣質(zhì)沉積明顯多于對(duì)照組(圖2C)。表明TLR3經(jīng)Poly(I:C)活化后能夠促進(jìn)hAMSCs成骨分化，加快鈣質(zhì)沉積。

表3 兩組RUNX2、OCN mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較

2.4 各組hAMSCs中NF-κB通路相關(guān)蛋白P65及p-P65表達(dá)比較

Western Blot結(jié)果顯示，NF-κB通路相關(guān)蛋白p-P65和P65表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.52、13.85，P<0.05)。見(jiàn)圖3、表4。

表4 兩組P65、p-P65蛋白表達(dá)比較

3 討 論

MSCs作為一類(lèi)具有自我更新、多譜系分化、低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)能力等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)的成體多能干細(xì)胞，目前在干細(xì)胞領(lǐng)域得到廣泛的研究[15]。由于MSCs具有以上多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，目前MSCs移植已成為骨質(zhì)疏松等疾病最佳治療方法。但是在MSCs移植中經(jīng)常有炎癥或感染情況發(fā)生，降低了MSCs移植的成功率與治療效果，而通過(guò)活化MSCs的TLR3介導(dǎo)hAMSCs免疫反應(yīng)能夠抑制炎癥感染，提高M(jìn)SCs移植的成功率和骨質(zhì)疏松等疾病的治療效果。但是活化的TLR3是否會(huì)影響hAMSCs成骨分化，目前沒(méi)有定論。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，hAMSCs活化TLR3后，成骨標(biāo)志基因RUNX2和OCN的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加，同時(shí)成骨誘導(dǎo)分化后鈣質(zhì)沉積程度更高，表明hAMSCs經(jīng)Poly(I:C)處理活化TLR3后可能促進(jìn)hAMSCs成骨分化。

MSCs在成骨分化過(guò)程中受到多種信號(hào)通路的調(diào)控，包括Wnt信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、BMP/TGF-β信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、hedghog信號(hào)通路、FGF信號(hào)通路、PTH信號(hào)通路和IGF-1信號(hào)通路等[16-19]，不同信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控β-catenin、同源核蛋白MSX2和含有PDZ識(shí)別模體的轉(zhuǎn)錄輔助激活因子TAZ等因子的表達(dá)，上調(diào)成骨分化標(biāo)志基因RUNX2和其下游基因OSX(osterix)的表達(dá)，提高堿性磷酸酶活性，調(diào)控成骨細(xì)胞特異性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白OCN表達(dá)和鈣離子沉積，促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化[20-21]。大量的研究結(jié)果證明，許多因素都能夠通過(guò)不同信號(hào)通路影響MSCs的成骨分化[22-28]，其中TLRs活化對(duì)MSCs的成骨分化也有影響。例如使用LPS持續(xù)刺激骨髓來(lái)源MSCs活化TLR4后能夠通過(guò)Wnt通路促進(jìn)其增殖和成骨分化[29]。TLR2活化后也能夠顯著增強(qiáng)骨髓來(lái)源MSCs的成骨分化[30]。TLR9活化后能夠促進(jìn)臍帶來(lái)源MSCs成骨分化而不影響其表型[31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Poly(I:C)活化hAMSCs的TLR3后，NF-κB通路相關(guān)蛋白P65和p-P65表達(dá)明顯增加，表明hAMSCs的TLR3活化后可能通過(guò)激活NF-κB通路來(lái)上調(diào)成骨標(biāo)志基因RUNX2和OCN的表達(dá)，促進(jìn)hAMSCs成骨分化。但是具體作用機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，Poly(I:C)活化hAMSCs的TLR3后，能夠通過(guò)激活NF-κB通路上調(diào)hAMSCs成骨標(biāo)志基因RUNX2和OCNmRNA和蛋白表達(dá)，加快鈣質(zhì)沉積，促進(jìn)hAMSCs成骨分化。因此，活化hAMSCs的TLR3不僅能夠抑制炎癥，提高M(jìn)SCs的移植存活率，還能夠促進(jìn)MSCs的成骨分化，加快鈣質(zhì)沉積，有利于增強(qiáng)骨質(zhì)疏松病人的骨修復(fù)能力，為一種可行的MSC預(yù)處理方式。但是活化TLR3后促進(jìn)MSCs成骨分化涉及的基因及信號(hào)通路需要進(jìn)一步研究[32-33]。本文研究結(jié)果可為hAMSCs在骨質(zhì)疏松等老年退行性疾病中的應(yīng)用提供了一定的研究基礎(chǔ)。