張莉,于文娟,李玉軍

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)學(xué)院病理學(xué)系，山東 青島 266071； 2 青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院病理科； 3 青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科)

結(jié)直腸癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，近30年內(nèi)的發(fā)病率以平均每年3%～4%上升。我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病例數(shù)占全世界發(fā)病總例數(shù)的18.6%，死亡例數(shù)占全世界死亡總例數(shù)的20.1%，均占據(jù)第1位[1-2]。腫瘤的位置、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及大體類型是影響結(jié)直腸癌病人根治術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要因素，也是判斷結(jié)直腸癌病人預(yù)后情況的關(guān)鍵因素[2]。已有研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)機(jī)制相關(guān)[3-4]。富含AT序列的特異性結(jié)合蛋白2(SATB2)是一種核基質(zhì)相關(guān)蛋白，屬于SATB家族，SATB2通過(guò)與核基質(zhì)附著區(qū)(MAR)相結(jié)合，激活及調(diào)控多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的過(guò)程。SATB2在大腦皮質(zhì)、消化道的腺上皮細(xì)胞、骨髓及免疫系統(tǒng)中有較高的表達(dá)。最近有研究結(jié)果表明，SATB2不但在成骨細(xì)胞分化和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，而且在結(jié)直腸癌中有著高度的敏感性和特異性[5-7]。S100鈣結(jié)合蛋白P(S100P)屬于S100家族成員，是一種小型的鈣離子結(jié)合蛋白。S100P與多種腫瘤如胰腺癌、乳癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌等相關(guān)，其蛋白的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、耐藥性、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后不良有關(guān)。已有研究結(jié)果表明，S100P的表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移有著重要的作用[8]。本文研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)SATB2、S100P蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，分析二者與腫瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，以及與EMT相關(guān)蛋白β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、上皮性鈣黏附蛋白E(E-cadherin)之間的相關(guān)性，探討SATB2及S100P蛋白在結(jié)直腸癌中的異常表達(dá)及其促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及其來(lái)源

隨機(jī)選取青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院手術(shù)切除、經(jīng)病理檢查診斷為結(jié)直腸腺癌的癌組織及其癌旁正常黏膜組織各100例。所有病人手術(shù)前均未接受放療及化療。100例病人中，男61例，女39例；年齡27～82歲，平均(63.57±9.95)歲。腫瘤位于左半結(jié)腸77例，右半結(jié)腸23例；低分化24例，中分化66例，高分化10例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例，1～3個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，>3個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

小鼠抗人SATB2單克隆抗體、S100P單克隆抗體、β-catenin單克隆抗體及E-cadherin單克隆抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB染色液以及其免疫組化試劑盒均為羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

標(biāo)本經(jīng)40 g/L甲醛固定，常規(guī)取材、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片6張，分別行免疫組化染色和蘇木精-伊紅(HE)染色，檢測(cè)SATB2、S100P、β-catenin和E-cadherin的表達(dá)情況。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用已知陽(yáng)性的切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷

SATB2陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核；S100P陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞漿，少量定位于細(xì)胞膜以及細(xì)胞核；E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞膜。以細(xì)胞膜呈不同程度的棕黃色染色為陽(yáng)性染色。用二級(jí)計(jì)分法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行判定，首先根據(jù)陽(yáng)性染色細(xì)胞所占比例評(píng)分：0分，<5%；1分，6%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，>75%。再根據(jù)細(xì)胞陽(yáng)性染色程度計(jì)分：0分，未著色；1分，淡黃色；2分，黃色；3分，棕褐色。最后根據(jù)兩者分值的乘積判斷結(jié)果：陰性，<1分；弱陽(yáng)性，2～4分；陽(yáng)性，5～8分；強(qiáng)陽(yáng)性，>9分。

β-catenin正常陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞膜，呈棕黃色細(xì)小顆粒狀，且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>70%；而β-catenin的異常表達(dá)指細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá)缺失以及細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核異位陽(yáng)性表達(dá)。凡出現(xiàn)細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá)減弱或缺失為異常表達(dá)，≥10%的細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核異位陽(yáng)性表達(dá)也視為異常表達(dá)[9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織SATB2、S100P、β-catenin、 E-cadherin表達(dá)比較

結(jié)直腸癌組織SATB2、S100P、 E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率分別為90%、65%、85%，β-catenin異常表達(dá)率為46%；癌旁正常黏膜組織中SATB2、S100P、E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率分別為98%、4%、100%，β-catenin異常表達(dá)率為0。兩種組織SATB2、S100P、β-catenin、 E-cadherin表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.674～82.332，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 SATB2、S100P表達(dá)與結(jié)直腸癌病人臨床病理特征的關(guān)系

SATB2表達(dá)與結(jié)直腸癌病人腫瘤直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=14.733～19.424，P<0.05)；與性別、年齡、腫瘤部位、浸潤(rùn)深度、TNM分期無(wú)關(guān)(P>0.05)。S100P表達(dá)與結(jié)直腸癌病人腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=13.298、14.945，P<0.05)；與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、TNM分期無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1、2。

2.3 結(jié)直腸癌組織中SATB2、S100P、E-cadherin、β-catenin表達(dá)之間的相關(guān)性

結(jié)直腸癌組織SATB2與S100P的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.254，P<0.05)，與β-catenin的異常表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.258，P<0.05)，與E-cadherin表達(dá)不相關(guān)(r=-0.045，P>0.05)；S100P與β-catenin的異常表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.284，P<0.05)，與E-cadherin表達(dá)不相關(guān)(r=0.128，P>0.05)。見(jiàn)表3～5。

表2 S100P蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌病人臨床病理特征的關(guān)系(例)

表3 結(jié)直腸癌組織中SATB2和S100P表達(dá)的相關(guān)性(例)

表4 結(jié)直腸癌組織中SATB2與β-catenin、E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性(例)

表5 結(jié)直腸癌組織中S100P與β-catenin、E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性(例)

3 討 論

國(guó)內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織中存在SATB2的蛋白表達(dá)降低，并與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)緊密相關(guān)[10-11]。何興狀等[12]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)了120例結(jié)直腸癌及其癌旁組織中SATB2mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示72.5%的癌組織SATB2mRNA低表達(dá)，而76.6%的癌旁組織中SATB2mRNA高表達(dá)；CCK-8法與細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在SW480、LOVO細(xì)胞中SATB2蛋白表達(dá)下調(diào)增強(qiáng)了細(xì)胞增殖以及轉(zhuǎn)移的能力，認(rèn)為SATB2基因可能為結(jié)直腸癌新的治療靶點(diǎn)。最近幾年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在結(jié)直腸癌中S100P蛋白異常表達(dá)方面的研究也越來(lái)越多。FUENTES等[13]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌中S100P蛋白特異性表達(dá)，在SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株(本身不表達(dá)S100P蛋白)中導(dǎo)入外源性的S100P基因，SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株的增殖和轉(zhuǎn)移能力都有明顯的提高。李曉燕等[14]的研究也表明，結(jié)直腸癌組織中S100P蛋白的表達(dá)高于正常組織，且S100P表達(dá)與腫瘤組織的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，認(rèn)為S100P在人結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能有一定的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中SATB2蛋白表達(dá)明顯低于癌旁正常黏膜組織，并且與腫瘤直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤部位、浸潤(rùn)深度、TNM分期等無(wú)關(guān)；而S100P蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)高于癌旁正常黏膜組織，并與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、TNM分期等無(wú)關(guān)。提示SATB2和S100P基因可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程，檢測(cè)SATB2和S100P在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平可反映腫瘤的生物學(xué)行為。

多項(xiàng)研究表明，結(jié)直腸癌發(fā)生與Wnt、EGFR信號(hào)通路的激活、抑癌基因失去活性及TGF β信號(hào)的缺失等因素有關(guān)[15]。王鳳等[4]對(duì)150例結(jié)直腸癌組織SATB2及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織SATB2蛋白的低表達(dá)促進(jìn)β-catenin蛋白的異常表達(dá)，從而促進(jìn)了EMT的發(fā)生。有研究表明，β-catenin是Wnt通路的關(guān)鍵性分子之一，可激活Wnt通路[16]。當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)，S100P蛋白與其靶蛋白鈣周期結(jié)合蛋白(CacyBP/SIP)結(jié)合，阻止β-catenin的正常降解，使其含量劇增，促使Wnt信號(hào)通路激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生與發(fā)展[17]。SHEN等[17]研究顯示，S100P的過(guò)度表達(dá)與結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移表型有關(guān)，該表型與EMT有關(guān)，且呈晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)依賴性。

本研究相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中SATB2蛋白表達(dá)與S100P蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且與β-catenin蛋白異常表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；S100P蛋白表達(dá)與β-catenin蛋白異常表達(dá)呈正相關(guān)。提示結(jié)直腸癌組織中可能存在SATB2與S100P基因異常激活或失活，導(dǎo)致SATB2與S100P蛋白異常表達(dá)，引起β-catenin積聚和蛋白的異常表達(dá)，激活Wnt信號(hào)通路，介導(dǎo)結(jié)直腸癌EMT的發(fā)生，最終促進(jìn)了結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。

綜上所述，增加SATB2蛋白的表達(dá)以及阻斷S100P蛋白與其靶蛋白CacyBP/SIP結(jié)合，可能會(huì)阻止β-catenin蛋白的異常表達(dá)、促進(jìn)β-catenin蛋白的正常降解，從而抑制結(jié)直腸癌EMT的持續(xù)發(fā)生，為結(jié)直腸癌的分子靶向治療提供新的思路。