抗生素短期干預(yù)所致腸道菌群紊亂對(duì)大鼠食欲和糖脂代謝的影響

劉秀,呂秋蘭,趙鵬,楊曉敏,徐大星,邢士超

(青島大學(xué)，山東 青島 266021 1 醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)系； 2 附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心； 3 附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)

近年來(lái)，越來(lái)越多的人出現(xiàn)肥胖和飲食失調(diào)癥狀[1-2]，這無(wú)疑反映了人們對(duì)食欲紊亂的原因認(rèn)識(shí)不足以及對(duì)其缺乏有效的治療[3-4]，因此，探究影響宿主食欲調(diào)節(jié)的因素，是治療肥胖、厭食癥、暴食癥和惡病質(zhì)等食欲紊亂性疾病的重中之重[5-8]。眾所周知，人體腸道寄居著數(shù)萬(wàn)億的微生物[9]，而這些微生物可以通過(guò)與宿主的相互作用和共同的代謝活動(dòng)影響宿主的生理功能和病理生理，因此腸道微生物在人類的健康和疾病中扮演著重要角色[10-11]。有研究顯示，肥胖、厭食癥和暴食癥病人的腸道微生物群發(fā)生改變，提示腸道菌群與宿主的食欲調(diào)節(jié)及代謝之間有潛在聯(lián)系[12-14]。本研究通過(guò)聯(lián)合使用抗生素干預(yù)大鼠的腸道菌群，進(jìn)而觀察腸道菌群紊亂大鼠的食欲變化以及糖脂代謝情況，探討腸道菌群對(duì)宿主的食欲調(diào)節(jié)和代謝的影響，以推動(dòng)針對(duì)食欲紊亂性疾病的新型診斷和治療方法的出現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性6周齡Wistar大鼠20只，購(gòu)自青島琴大生物科技有限公司，飼養(yǎng)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(AHQU-MAL2017022)。氨芐西林、青霉素、甲硝唑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。E.Z.N.A Soil DNA試劑盒(OMEGA)，AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN)，ABI GeneAmp?9700 型PCR儀，德國(guó)羅氏卓越血糖儀，全自動(dòng)生化分析儀(TOSHIBA，Japan)，大鼠代謝籠，大鼠灌胃針。

1.2 動(dòng)物分組和處理

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將20只大鼠隨機(jī)分為正常組(C組)和抗生素組(A組)，每組10只。參照文獻(xiàn)方法并適當(dāng)改進(jìn)[15]，A組大鼠喂以正常飼料，并稱取一定劑量的抗生素(氨芐西林250 mg/kg、新霉素250 mg/kg、甲硝唑50 mg/kg)，用無(wú)菌水溶解(混合溶液濃度為50 g/L)后每天灌胃1次, 連續(xù)灌胃5周；C組大鼠喂以正常飼料，每天以等體積的無(wú)菌水灌胃1次，連續(xù)灌胃5周。每周六記錄1次大鼠體質(zhì)量，每周日記錄1次大鼠的24 h進(jìn)食量、進(jìn)水量以及尿量，每周一檢測(cè)1次大鼠的血糖和血脂。

1.3 大鼠進(jìn)食量、進(jìn)水量、尿量檢測(cè)

每個(gè)大鼠代謝籠飼養(yǎng)1只大鼠，將相同質(zhì)量的大鼠飼料、相同體積的無(wú)菌水以及干凈的尿杯分配給每只大鼠，24 h后，再次稱量每只大鼠的剩余飼料，用量筒或1 000 mL的移液槍分別量取每只大鼠的進(jìn)水量和尿量，以此分析大鼠的食欲情況。

1.4 大鼠糞便樣本的收集

在抗生素使用前(0周)和抗生素使用3周后(3周)分別收集大鼠的新鮮糞便。用碘附擦拭大鼠肛門后，將大鼠放于無(wú)菌報(bào)紙上，用手按摩大鼠屁股，以無(wú)菌鑷子夾取大鼠肛門處新鮮糞便置于無(wú)菌冷凍管中，并立即暫存于液氮罐中，之后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱以供腸道菌群測(cè)序。

1.5 454焦磷酸測(cè)序

1.5.1糞便DNA提取和PCR擴(kuò)增 每只大鼠取50～100 mg糞便，使用E.Z.N.A Soil DNA試劑盒抽提糞便的基因組DNA，之后應(yīng)用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的DNA；利用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和533R(5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′)在ABI GeneAmp?9700型PCR儀中擴(kuò)增16S rDNA的V1～V3高變區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。

1.5.2測(cè)序及生物信息學(xué)分析 回收的PCR產(chǎn)物用羅氏GS-FLX 454焦磷酸測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序，為保證序列的質(zhì)量，分析前先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，得到優(yōu)化序列。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：①引物的錯(cuò)配數(shù)大于2的序列；②長(zhǎng)度短于250 bp、模糊堿基數(shù)大于0、序列平均質(zhì)量低于 25的序列；③未測(cè)通目標(biāo)區(qū)域的序列。其次，將優(yōu)化的序列按照97%的相似性分歸為許多個(gè)操作分類單元(OTU)，進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。將每條優(yōu)化序列均與SILVA(SSU111版)的小亞基核糖體RNA(SSUrRNA)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，找出其最相近且可信度達(dá)80%以上的種屬信息。為獲得每個(gè)OTU的分類學(xué)信息，將97%相似水平下每個(gè)OTU中的所有序列進(jìn)行一致性分析，找出同一個(gè)OTU中不同序列的最近祖先的種屬信息作為該OTU的種屬信息。

1.6 血清生化指標(biāo)的檢測(cè)

采集靜脈血之前，大鼠禁食8～10 h。于每周一早晨，采用剪尾取血法取血，用血糖儀檢測(cè)大鼠的空腹血糖(BG)濃度；采用內(nèi)眥取血法采集大鼠的空腹靜脈血，以3 000 r/min離心10 min，吸取血清，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中三酰甘油(TG)和膽固醇(CHOL)的濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 抗生素對(duì)大鼠腸道菌群的影響

抗生素的使用顯著降低了大鼠的腸道菌種數(shù)目(t=9.15，P<0.01)。見(jiàn)表1。在門水平分析大鼠的腸道菌群組成，結(jié)果顯示，抗生素干預(yù)了大部分的腸道菌門，即Elusimicrobia、Cyanobacteria、Proteobacteria、Firmicutes、Verrucomicrobia和Bacteroidetes的相對(duì)豐度都發(fā)生顯著變化(t=2.53～12.97，P<0.05)。見(jiàn)表2。大鼠糞便菌種數(shù)目的急劇降低以及腸道菌群相對(duì)豐度的顯著改變表明，抗生素使大鼠的腸道菌群受到嚴(yán)重干預(yù)。

表1 抗生素對(duì)大鼠糞便菌種數(shù)目的影響

表2 抗生素干預(yù)對(duì)大鼠腸道菌群豐度的影響

2.2 腸道菌群紊亂大鼠的食欲變化

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，C組大鼠的進(jìn)食量、進(jìn)水量和尿量始終保持穩(wěn)定。而在抗生素處理1周后，A組大鼠的進(jìn)食量、進(jìn)水量和尿量開(kāi)始顯著升高，并一直維持至第5周?？股靥幚砗?～5周，A組大鼠的進(jìn)食量、進(jìn)水量和尿量始終高于C組(t=3.95～7.54，P<0.05)。提示抗生素短期干預(yù)所致的腸道菌群紊亂影響了大鼠的食欲，腸道菌群在大鼠的食欲調(diào)節(jié)中起著潛在作用。見(jiàn)圖1。

2.3 腸道菌群紊亂大鼠的體質(zhì)量變化

C組和A組大鼠的體質(zhì)量均呈現(xiàn)出增高趨勢(shì)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，兩組大鼠的體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.36～1.68，P>0.05)。見(jiàn)圖1。

2.4 腸道菌群紊亂大鼠的糖脂代謝變化

C組和A組大鼠的血糖、血脂始終同向波動(dòng)，并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，兩組大鼠的血糖、血脂差異均無(wú)顯著性(t=0.05～1.89，P>0.05)。見(jiàn)圖2。

3 討 論

健康的腸道微生物群對(duì)宿主正常的代謝過(guò)程和微生態(tài)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，而腸道微生物組成的改變，可能通過(guò)影響宿主的新陳代謝而導(dǎo)致肥胖、糖尿病等[16-17]。過(guò)度使用抗生素，可以對(duì)腸道微生物群產(chǎn)生重大影響，導(dǎo)致其組成和功能的改變[18-20]，而微生物組成和功能的改變，又可能誘發(fā)各種內(nèi)分泌、代謝性、免疫性疾病[21-23]。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)方法并加以適當(dāng)改進(jìn)[15]，聯(lián)合使用氨芐西林、新霉素和甲硝唑干預(yù)大鼠的腸道菌群，通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)食量、進(jìn)水量、尿量、體質(zhì)量以及血糖、血脂的監(jiān)測(cè)，來(lái)分析腸道菌群紊亂大鼠的進(jìn)食和代謝情況，進(jìn)而探討腸道菌群對(duì)宿主食欲和代謝的影響。

本研究結(jié)果顯示，腸道菌群紊亂大鼠的進(jìn)食量和進(jìn)水量發(fā)生了顯著變化，說(shuō)明腸道菌群可能在宿主的食欲調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，腸道菌群的改變可以導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的增加，這些細(xì)胞因子又會(huì)通過(guò)致炎癥作用參與代謝疾病(如肥胖和2型糖尿病)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的精神性疾病(如認(rèn)知障礙、焦慮和抑郁)的發(fā)生[17,24]，而包括焦慮和抑郁等在內(nèi)的精神性疾病明顯影響著宿主的食欲[25]。因此，腸道菌群或許通過(guò)炎性細(xì)胞因子或其代謝產(chǎn)物參與調(diào)節(jié)宿主的食欲，而進(jìn)一步篩選出與食欲調(diào)節(jié)有關(guān)的腸道菌種，將推動(dòng)食欲紊亂性疾病的新型診斷與治療。另外有研究表明，盡管沒(méi)有任何腸道菌群的無(wú)菌小鼠的進(jìn)食量大于正常小鼠，但其體質(zhì)量并不會(huì)比正常小鼠更大[26]。同樣，本研究結(jié)果顯示，食欲提高大鼠的體質(zhì)量與正常大鼠相比并無(wú)顯著變化，這意味著腸道菌群在宿主的能量平衡中起著重要作用。

近年來(lái)，大量的研究表明，腸道菌群與宿主糖尿病和脂代謝紊亂性疾病之間有著密切聯(lián)系[26-27]。然而，本研究并沒(méi)有觀察到腸道菌群紊亂大鼠的異常的血糖和血脂濃度，但這并不能說(shuō)明腸道菌群與糖脂代謝沒(méi)有關(guān)系，因?yàn)橛醒芯堪l(fā)現(xiàn)，紊亂的腸道菌群不能改變正常飲食大鼠的脂代謝，卻可以加劇高膽固醇飲食大鼠的血脂積累[15]。這些結(jié)果提示，紊亂的腸道菌群尚不能作為單獨(dú)的影響因素驅(qū)動(dòng)正常宿主的代謝變化。因此，有效的飲食控制和保持腸道微生物的穩(wěn)態(tài)將有望用來(lái)預(yù)防和治療糖脂代謝紊亂性疾病。

然而，本次研究?jī)H對(duì)大鼠的腸道菌群進(jìn)行了短期干預(yù)，進(jìn)而對(duì)大鼠的食欲、體質(zhì)量和糖脂代謝情況連續(xù)監(jiān)測(cè)了5周，其結(jié)果僅代表抗生素短期干預(yù)所致腸道菌群紊亂對(duì)大鼠食欲和糖脂代謝的影響。在接下來(lái)的研究中，我們計(jì)劃將抗生素組大鼠的糞便菌群移植給無(wú)菌大鼠，進(jìn)而觀測(cè)無(wú)菌大鼠的食欲、糖脂代謝變化或者對(duì)比分析兩組大鼠的腸道菌群代謝產(chǎn)物[28-30]，然后將變化的菌群代謝產(chǎn)物與食欲調(diào)節(jié)、糖脂代謝相關(guān)的信號(hào)通路聯(lián)系起來(lái)[31-32]，以此驗(yàn)證腸道菌群在食欲變化、糖脂代謝中的潛在作用。

綜上所述，本研究利用抗生素干預(yù)了大鼠的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)腸道菌群紊亂大鼠的進(jìn)食量、進(jìn)水量和尿量顯著增高，表明腸道菌群可能參與調(diào)節(jié)宿主食欲，但對(duì)正常大鼠的糖脂代謝沒(méi)有明顯影響。這些結(jié)果為開(kāi)發(fā)肥胖、厭食癥、暴食癥和惡病質(zhì)等食欲紊亂性疾病的新型診斷和治療方法帶來(lái)了希望。