食品中菌落總數(shù)檢測(cè)方法的優(yōu)化

胡國(guó)華

隨著社會(huì)的發(fā)展和人們對(duì)食品要求的提高，食品安全問(wèn)題被提到越來(lái)越重要的位置，食品安全檢測(cè)的方法也在不斷地更新迭代。食品被細(xì)菌污染的程度可用來(lái)判定食品的衛(wèi)生質(zhì)量，針對(duì)食品中的微小顆粒以及顏色特殊的產(chǎn)品做菌落總數(shù)計(jì)數(shù)時(shí)，無(wú)論是我國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)還是ISO標(biāo)準(zhǔn)都存在相同的問(wèn)題，比如食品中的微小顆粒與菌落相似、樣品本身的顏色原因?qū)е戮潆y以觀察，從而影響試驗(yàn)過(guò)程中菌落總數(shù)的觀察和計(jì)數(shù)，使檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生誤差。

參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）第五章微生物檢驗(yàn)方法中菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法的描述內(nèi)容，為了便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在培養(yǎng)基中加入TTC（紅四氮唑，又叫2，3，5-三苯基氯化四氮唑）溶液，利用TTC在菌落生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的琥珀脫氫酶使無(wú)色的TTC還原成紅色的TPF原理，使菌落更容易觀察和計(jì)數(shù)。但對(duì)于TTC的濃度，各類文獻(xiàn)給出的結(jié)果不完全一致，本文選擇自然界中比較常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌-金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌-大腸埃希氏菌以及芽孢菌-枯草芽孢桿菌作為試驗(yàn)菌種，以麥片和乳粉為樣品基質(zhì)，對(duì)TTC的濃度進(jìn)行確認(rèn)，確定最佳使用濃度，對(duì)食品中菌落總數(shù)的檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

一、材料

平板計(jì)數(shù)瓊脂，北京陸橋；營(yíng)養(yǎng)肉湯，北京路橋；培養(yǎng)皿，瑾博；TTC，麥克林；大腸埃希氏菌，ATCC 8739；金黃色葡萄球菌，ATCC 6538；枯草芽孢桿菌，ATCC 9372；生物安全柜，1384；恒溫培養(yǎng)箱，DHP-9162；電子天平，MP3KC；移液器，GP00180。

二、方法

1.菌種的制備。各取1環(huán)工作菌種接種至9mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，在36℃條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)，此時(shí)的菌種濃度約為1.0×109CFU/mL。使用無(wú)菌生理鹽水對(duì)菌液進(jìn)行稀釋，根據(jù)常用的食品安全標(biāo)準(zhǔn)，食品中的大部分限量值為103-105CFU/g，因此將菌液濃度稀釋至105CFU/mL、106CFU/mL備用。

2.不同濃度TTC平板計(jì)數(shù)瓊脂制備。配制平板計(jì)數(shù)瓊脂，經(jīng)121℃滅菌15分鐘后置于60℃的水浴中，將TTC用無(wú)菌水配制成5%的濃度，過(guò)濾除菌后備用。以無(wú)菌操作添加到平板計(jì)數(shù)瓊脂中，使得平板計(jì)數(shù)瓊脂中TTC的濃度分別為0.08%、0.06%、0.04%、0.02%、0.01%、0.008%、0.004%、0.002%、0.001%、0.0008%、0.0004%、0.0002%、0.0001%，制備好后放在48℃的水浴中備用。

3.操作步驟。取制備好的金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌1mL至培養(yǎng)皿中，每個(gè)濃度TTC的培養(yǎng)基準(zhǔn)備2個(gè)培養(yǎng)皿，加入含不同濃度TTC的PCA培養(yǎng)基和2個(gè)不含TTC的培養(yǎng)基作為對(duì)照組。培養(yǎng)基凝固后反轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，在36℃條件下培養(yǎng)48小時(shí)。金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌在含不同濃度TTC培養(yǎng)基中的菌落計(jì)數(shù)及菌落顏色如表1所示。

由表1可知，當(dāng)TTC濃度≥0.0010%時(shí)，菌落呈現(xiàn)粉紅色，顏色的辨識(shí)度較明顯；當(dāng)TTC濃度≤0.0020%時(shí)，菌落總數(shù)的數(shù)值與不添加TTC培養(yǎng)基的金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)相比無(wú)明顯減少（差異小于0.25log10N），因此對(duì)金黃色葡萄球菌的最佳使用濃度范圍為0.0010%-0.0020%。當(dāng)TTC濃度≥0.0010%時(shí)，菌落呈現(xiàn)粉紅色，顏色的辨識(shí)度較明顯；當(dāng)TTC濃度≤0.0080%時(shí)，菌落總數(shù)的數(shù)值與不添加TTC培養(yǎng)基的大腸埃希氏菌的菌落數(shù)無(wú)明顯減少（差異小于0.25log10N），因此對(duì)大腸埃希氏菌的最佳使用濃度范圍為0.0010%-0.0080%。當(dāng)TTC濃度≥0.0010%時(shí)，菌落呈現(xiàn)粉紅色，顏色的辨識(shí)度較明顯；當(dāng)TTC濃度≤0.0080%時(shí)，菌落總數(shù)的數(shù)值與不添加TTC培養(yǎng)基的枯草芽孢桿菌的菌落數(shù)無(wú)明顯減少（差異小于0.25log10N），因此對(duì)枯草芽孢桿菌的最佳使用濃度范圍為0.0010%-0.0080%。結(jié)合三種菌種的試驗(yàn)結(jié)果，食品中TTC的濃度在0.0010%- 0.0020%之間較為適宜。

4.在具體產(chǎn)品中的驗(yàn)證方法。設(shè)計(jì)麥片和牛奶兩類產(chǎn)品樣品，為了結(jié)果便于統(tǒng)計(jì)，將牛奶和麥片進(jìn)行高壓滅菌冷卻后，稱取25g的麥片和25mL的牛奶于均質(zhì)袋中，每個(gè)樣品稱取3個(gè)平行。將制備好的菌液分別各取1份混合，使得混合后的菌液濃度約為105CFU/mL，每個(gè)樣品的加菌量為1mL，使得樣品的最終濃度為103CFU/g，加入225mL的稀釋液后得到10-1稀釋液，按照梯度稀釋到10-2、10-3稀釋液。每個(gè)稀釋度取各取1mL至4個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中，2個(gè)培養(yǎng)皿中加入15-20mL含0.0015%TTC的PCA培養(yǎng)基，另外2個(gè)培養(yǎng)皿中加入不含TTC的PCA培養(yǎng)基。用25mL的無(wú)菌稀釋液代替樣品作為對(duì)照組，加入不含TTC的PCA培養(yǎng)基。待上述培養(yǎng)基冷卻凝固后，反轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿并在36℃條件下培養(yǎng)48小時(shí)，然后取出計(jì)數(shù)，計(jì)算平均結(jié)果如表2。

從表2可以看出，當(dāng)采用含0.0015%TTC的PCA時(shí)，樣品中的菌落總數(shù)與對(duì)照組的菌落總數(shù)接近；未采用TTC的PCA組，因?yàn)榕Ｄ瘫旧淼念伾?、麥片的?xì)小顆粒物導(dǎo)致培養(yǎng)基上一些顏色和樣品本底顏色接近的菌落以及與細(xì)小顆粒物接近或者生長(zhǎng)時(shí)疊加在樣品顆粒物上時(shí)，會(huì)導(dǎo)致菌落無(wú)法被觀察到，從而使得檢測(cè)結(jié)果與真實(shí)值有一定的差異。雖然未加TTC組的數(shù)據(jù)也符合ISO 4833中重復(fù)性的要求（小于0.25log10N），但0.0015%TTC的PCA組更有利于菌落的觀察和計(jì)數(shù)，減少了因樣品本身的性狀、顏色對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

三、總結(jié)與討論

食品在實(shí)際加工過(guò)程中以及原料被污染的細(xì)菌種類較多，本次試驗(yàn)選取了比較有代表性的3種菌種進(jìn)行方法確認(rèn)，主要驗(yàn)證在商業(yè)干粉培養(yǎng)基配制過(guò)程中添加一定濃度的TTC便于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察和計(jì)數(shù)，同時(shí)驗(yàn)證了最佳的使用濃度，既方便觀察，又對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響，能夠提高本身顏色較特殊以及含有細(xì)小顆粒的樣品菌落總數(shù)檢測(cè)項(xiàng)目的準(zhǔn)確性。