孫紅梅 李振 彭喜春 楊秀偉

摘?要：目的：建立枸杞子中多糖的測定方法，比較不同產(chǎn)地枸杞子中多糖含量的差異。方法：采用蒽酮-硫酸法測定寧夏、青海、新疆等3個產(chǎn)地86批次枸杞子中多糖的含量，分析差異，并進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果：方法線性關(guān)系、回收率、精密度及重復(fù)性測定結(jié)果均符合要求，不同產(chǎn)地枸杞子中多糖含量范圍為1.71%～4.56%，多糖含量高低順序?yàn)榍嗪?gt;新疆>寧夏。結(jié)論：蒽酮-硫酸法可用于枸杞子多糖含量的測定，不同產(chǎn)地的枸杞子中多糖含量有一定差異，其中青海產(chǎn)地枸杞子中的多糖含量最高。

關(guān)鍵詞：枸杞子;多糖;蒽酮-硫酸法;不同產(chǎn)地

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarum ）的干燥成熟果實(shí)，味甘，性平，主要分布在中國寧夏、新疆、青海、甘肅、內(nèi)蒙古等地[1]。作為藥食同源類中藥材，枸杞子具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目的功效，用于虛勞精虧、腰膝酸痛、眩暈耳鳴、血虛萎黃等[2]。多糖是枸杞子的特征性成分，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血糖、降血脂、抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、保肝等多種生物活性[3-8]。目前測定枸杞子中的多糖含量主要采用2015年版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定的方法[2]，即苯酚-硫酸法。苯酚-硫酸法雖準(zhǔn)確性高、重復(fù)性良好，但需用到高濃度硫酸和有一定毒性的苯酚，致操作安全性相對較低，不利于長期檢測操作。而蒽酮-硫酸法是多糖含量測定的常用方法，此法不僅簡便、快速、靈敏，而且重現(xiàn)性好[9]。本研究采用蒽酮-硫酸法對不同產(chǎn)地枸杞子中的多糖含量進(jìn)行測定評價，以期為枸杞子的質(zhì)量控制及相關(guān)產(chǎn)品的研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?儀器

UV-1801紫外分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司;HH-4恒溫水浴鍋，江蘇金壇市宏華儀器廠;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海嘉鵬科技有限公司;BJ-150中藥粉碎機(jī)，上海拜杰實(shí)業(yè)有限公司。

1.2?試劑

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（40 kDa），阿拉丁公司;濃硫酸（98%）、無水乙醇（分析純）、蒽酮（分析純），均購于廣州化學(xué)試劑廠。

1.3?材料

枸杞子（產(chǎn)地寧夏、青海、新疆，每個產(chǎn)地約30個批次樣品）于2018—2019年，購于天方?。ㄖ袊┧帢I(yè)有限公司，經(jīng)鑒定均為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum的干燥成熟果實(shí)。

1.4?方法

1.4.1?枸杞多糖供試液的制備?取枸杞子若干，于105 ℃烘箱中烘4 h后，粉碎，過篩（100目）。精密稱取約1 g，置于錐形瓶中，加水120 mL，沸水提取2 h，趁熱抽濾，將濾渣和濾紙放回瓶中，重復(fù)上述提取1次，合并兩次濾液。減壓濃縮至約45 mL，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，并用少量熱水多次潤洗燒瓶，合并洗液，定容，搖勻，備用。精密量取上述溶液1 mL，置10 mL離心管中，加入9 mL無水乙醇，渦旋振蕩15 s，離心（4 500 r/min，15 min），傾去上清液，沉淀用10 mL無水乙醇洗滌1次，振搖、離心。置通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)沉淀物至無醇味，用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中，搖勻，即為供試液。

1.4.2?對照品溶液的配制?精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡聚糖對照品100 mg，置1 L量瓶中，用適量水溶解后，稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.4.3?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制?精密量取0.1 mg/mL葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，并用蒸餾水補(bǔ)充至1.0 mL，將試管放入冷水浴中，分別加入蒽酮試劑4.0 mL（稱取50 mg蒽酮，用100 mL濃硫酸溶解），搖勻。置沸水浴中加熱15 min，冷卻至室溫。以空白作對照，在620 nm波長處測定吸收度。以吸收度為橫坐標(biāo)、濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸得：y=5.178 6x+0.012 2，R2=0.997 4。圖1結(jié)果表明，蒽酮-硫酸法測定枸杞多糖具有良好的線性關(guān)系。

1.4.4?回收率試驗(yàn)?取同一批枸杞子，分別在“醇沉后定容前”加入相當(dāng)于樣品含量50%、100%、150%的葡聚糖對照品各3份，按照“1.4.3”項測定，計算回收率，測定結(jié)果分別為92.5%、106.8%、102.9%、112.9%、97.4%、107.3%、102.5%、104.3%、114.2%，平均值為104.5%，RSD為6.6%（n=9），表明方法準(zhǔn)確性良好。

1.4.5?重復(fù)性試驗(yàn)?取同一批枸杞子樣品，按“1.4.1”項方法平行制備并測定6份平行樣中的粗多糖含量，結(jié)果顯示，多糖含量平均值為2.66%，RSD=2.8%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

1.4.6?精密度試驗(yàn)?（1）人員精密度：由2名操作員連續(xù)2 d獨(dú)立對同一批枸杞子樣品，按“2.1”項下方法分別平行制備2份樣品，進(jìn)行多糖含量測定，結(jié)果顯示，不同人員測定結(jié)果的RSD=7.0%。（2）日間精密度：由同一名操作員每天測定1次，連續(xù)3 d對同一批枸杞子樣品，按“1.4.1”項下方法進(jìn)行多糖含量測定，結(jié)果顯示，不同時間測定結(jié)果的RSD=3.2%。

1.4.7?不同方法比較?采用2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的方法和本研究方法，選取3個批次樣本，每批次制備2個平行樣，分別對枸杞子中的多糖進(jìn)行含量測定，以比較兩個方法測定結(jié)果的差異。由附表可看出，本研究測得的枸杞子中的多糖含量要稍高于用2015年版《中華人民共和國藥典》測得的結(jié)果，但結(jié)合2015年版《中華人民共和國藥典》關(guān)于枸杞子中的多糖的含量要求和文獻(xiàn)報道的枸杞子中的多糖含量水平來看，本研究中兩個方法測得的結(jié)果都能較客觀地反映枸杞子中多糖的含量水平，即方法相對準(zhǔn)確、可靠。

1.4.8?樣品含量測定?取不同產(chǎn)地各批次的枸杞子樣品，精密稱定，按上述“1.4.1” 項下制備方法，制備樣品溶液，精密吸取樣品試液1 mL，按“1.4.3”項下方法進(jìn)行測定，計算不同產(chǎn)地枸杞子中多糖的含量。

2?結(jié)果與分析

由圖2知，寧夏中寧產(chǎn)地不同區(qū)域的枸杞子中多糖含量差異較為明顯，其中中寧縣周塔鄉(xiāng)產(chǎn)的枸杞子中多糖含量最高，約為4.4%，其次是鳴沙鎮(zhèn)和長山頭鄉(xiāng)，白馬鄉(xiāng)和余丁鄉(xiāng)產(chǎn)的多糖含量相對較低，約為2.5%。寧夏中寧枸杞中多糖含量整體水平為3.0%。青海產(chǎn)地不同區(qū)域枸杞子中多糖含量差異相對較小，均接近于青海產(chǎn)地整體含量水平，約為3.3%（圖3）。新疆產(chǎn)地（精河縣托里鎮(zhèn)）不同批次的枸杞子中多糖含量也有明顯差異，含量波動范圍為2.44%～3.85%，整體含量水平為3.15%（圖4）。造成這一現(xiàn)象的原因可能是枸杞不同采摘年份，其多糖含量也有差異。我們分析發(fā)現(xiàn)，多糖含量較低的批次主要集中在2019年份采摘的，而2018年份采摘的批次多糖含量整體相對較高。就3個產(chǎn)地整體而言，青海產(chǎn)地的枸杞子多糖含量最高，新疆的次之，寧夏的最低，這一結(jié)論與崔治家等[10]的研究結(jié)果一致，但與姚霞等[11]的研究結(jié)果相悖，不一致的原因可能是在研究樣本數(shù)量選取上，本研究與其差異比較大而得出不同的結(jié)論。

3?結(jié)論

目前植物多糖的測定方法有多種，包括苯酚-硫酸法[12]、蒽酮-硫酸法[13-14]、3，5-二硝基水楊酸（簡稱DNS）法[15]、HPLC[16-17]等精密儀器測定法。其中，蒽酮-硫酸法因具有操作簡單、靈敏，易掌握，安全性好，無需使用高級儀器等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛用于多糖含量的測定。本研究采用蒽酮-硫酸法，以葡聚糖為對照品，建立了枸杞子的多糖含量測定方法，結(jié)果顯示，該方法的線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性和回收率均較好，測定的枸杞多糖含量結(jié)果與其他研究者測定結(jié)果水平接近，表明該方法可用于枸杞子中多糖含量的質(zhì)量控制。

通過對寧夏、新疆、青海等3個地區(qū)所產(chǎn)86批次枸杞子的多糖含量進(jìn)行測定分析，結(jié)果顯示其多糖含量分布范圍為1.71%～4.56%，除1批不符合2015版 《中華人民共和國藥典》的規(guī)定外，其余均符合規(guī)定。整體上看，不同產(chǎn)地枸杞子中的多糖含量有一定的差異，其中以青海產(chǎn)區(qū)為最高，平均值為3.3%，新疆和寧夏產(chǎn)的枸杞子中的多糖含量相對低一些，平均值約為3%。這一現(xiàn)象說明，地理位置、環(huán)境氣候等因素對枸杞子中的多糖含量的影響較大[10]，可進(jìn)一步研究海拔、溫度、光照、降雨量等因素對枸杞子中的多糖含量的影響。

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