左映平，孫國勇，張玲

（1.茂名職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程系，廣東 茂名 525000；2.廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東 茂名 525000）

硒是人體必需的微量元素，其不僅是谷胱甘肽過氧化物酶、碘甲腺原氨酸脫碘酶、硒磷酸酯合成酶等代謝酶活性中心組成部分，還具有清除自由基、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、保護(hù)心血管等作用[1-3]。人體中硒的攝入主要來源于日常飲食，但日常飲食中攝入硒含量不能滿足55 μg/d的推薦攝入量[4-5]。因此，可通過增加食品中硒含量來補(bǔ)充硒的攝入量。硒的補(bǔ)充形式主要有無機(jī)硒和有機(jī)硒兩種，有機(jī)硒相比無機(jī)硒具有生物利用度高和低毒等特性[1，3]。因此，尋找準(zhǔn)確、科學(xué)、廉價(jià)且高效的補(bǔ)硒方法是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。

研究表明，一些乳酸菌能快速積累無機(jī)硒并將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為納米硒及有機(jī)硒[2，5]，這表明乳酸菌可作為將硒輸送至發(fā)酵食品中的良好載體。此外，富硒乳酸菌具有抗氧化、抗突變和抗癌等多種生物活性[2，6]。因此，人們對(duì)開發(fā)富硒乳酸菌發(fā)酵食品越來越感興趣。

沙棘、胡蘿卜和黑棗廣泛種植于我國北方地區(qū)，三者的果實(shí)中富含多種碳水化合物、氨基酸、維生素、脂肪酸和多種微量元素，并含有大量的黃酮和多酚等生物活性物質(zhì)[7-9]。這三者通常都被生食或榨汁，但由于其澀味明顯而不被人們所接受，亟需加大三者的綜合加工，提高產(chǎn)品的附加值。利用富硒乳酸菌發(fā)酵果蔬汁不僅可以改善果蔬制品的口感和風(fēng)味，還有助于提高果蔬制品的功能特性[3]。

目前，對(duì)于乳酸菌發(fā)酵果蔬的研究報(bào)道較多，但對(duì)以沙棘、胡蘿卜和黑棗為原料發(fā)酵復(fù)合果蔬汁的研究鮮有報(bào)道，仍不清楚富硒乳酸菌對(duì)該復(fù)合果蔬汁的影響。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是食品發(fā)酵中常用的發(fā)酵劑，具有富集硒的潛力[10]。因此，本研究以沙棘汁、胡蘿卜汁和黑棗汁為主要原料，通過接種富硒植物乳桿菌、植物乳桿菌和自然發(fā)酵制備3種發(fā)酵復(fù)合果蔬汁。對(duì)發(fā)酵復(fù)合果蔬汁的理化特性、多酚類物質(zhì)及抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為生產(chǎn)高品質(zhì)富硒發(fā)酵果蔬汁提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘汁：呂梁野山坡食品有限責(zé)任公司；胡蘿卜汁、黑棗汁：福建綠泉食品有限公司；植物乳桿菌（L.plantarum）：茂名職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與藥品工程微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

乳酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；無水亞硫酸鈉、亞油酸、鐵氰化鉀、亞硒酸鈉、硝酸鋁、福林酚、氫氧化鈉、無水氯化鐵（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。乙酸、富馬酸、草酸、檸檬酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：國家食品藥品檢測中心；3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）、2，4，6-三 （2-吡啶基） 三嗪[2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]（分析純）：上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-21M型高速冷凍離心機(jī)：長沙平凡儀器廠；ZHJH-C1109C型無菌操作臺(tái)：上海智城分析儀器制造有限公司；AB-50型電子分析天平、FE28型pH計(jì)：瑞士Mettler-Toledo公司；UV1800型紫外可見光分光光度計(jì)：日本島津公司；1260型高效液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液制備

將植物乳桿菌接入含2 μg/mL亞硒酸鈉的乳酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，5000 r/min離心15 min，棄去上清液，將沉淀重溶于無菌生理鹽水中，得到活菌數(shù)為2.2×107CFU/mL左右的菌懸液。

1.3.2 復(fù)合果蔬汁發(fā)酵工藝

將沙棘汁、胡蘿卜汁和黑棗汁按一定比例混合后裝入已滅菌玻璃瓶中，分別接種植物乳桿菌（記為LP組）和富硒植物乳桿菌（記為LP-Se組），接種量為2%菌懸液，混勻后37℃靜置發(fā)酵36 h。另外，設(shè)置自然發(fā)酵的復(fù)合果蔬汁（記為NF組）作為發(fā)酵對(duì)照。每隔6 h收集樣品，置于-20℃保存待測。

1.3.3 乳酸菌菌落總數(shù)的測定

參照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》測定乳酸菌菌落總數(shù)[11]。

1.3.4 理化特性的測定

使用pH計(jì)直接測定pH值；參照GB5009.239—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測定》測定總滴定酸的含量（以乳酸計(jì)）[12]；參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測定》測定還原糖的含量（以葡萄糖計(jì)）[13]；用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白的含量[14]。

采用高效液相色譜法測定復(fù)合果蔬汁中有機(jī)酸的含量[15]。取適量復(fù)合果蔬汁發(fā)酵液，4 500 r/min離心10 min，將離心后的上清液稀釋5倍微濾（0.45 μm）過膜后待用。采用Agilent C18色譜柱，進(jìn)樣量為10 μL，流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸溶液（A 相體積比 80∶15∶5；B相體積比為 5∶90∶5），柱溫 30 ℃，柱流速 0.5 mL/min，檢測波長210 nm[15]。流動(dòng)相梯度洗脫條件（時(shí)間，體積比）：0～5 min，A∶B=0∶100；15 min，A∶B=10∶90；45 min～55 min，A∶B=100∶0；65 min～75 min，A∶B=0∶100[15]。

1.3.5 硒含量的測定

硒含量測定參考YANG等[16]的方法，吸取適量復(fù)合果蔬汁發(fā)酵液，加入混合酸（硝酸∶高氯酸=9∶1，體積比）進(jìn)行消化，直至變?yōu)闊o色，將消化后的溶液與10 mL 0.5%DAB混合，最后使用10 mL甲苯萃取混合物，萃取3次，于420 nm下測定萃取物吸光度。

1.3.6 總黃酮和總多酚含量的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮的含量[17]，總黃酮含量用蘆丁當(dāng)量表示；采用Folin-Ciocalteu比色法測定總多酚的含量[18]，總多酚含量用沒食子酸當(dāng)量表示。

1.3.7 體外抗氧化能力的測定

脂質(zhì)過氧化抑制率測定參考CHEN等[19]的方法，0.5 mL復(fù)合果蔬汁發(fā)酵液與0.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.02 mol/L，pH 7.4）、1 mL亞油酸乳化液和1 mL硫酸亞鐵溶液（0.05 mol/L）混合，置于37℃水浴保溫1.5 h，依次加入0.2 mL 4%三氯乙酸，0.2 mL 0.4%丁基化羥基甲苯和2 mL 0.8%硫代巴比妥酸，置于沸水浴加熱25 min，冷卻后4500 r/min離心10 min收集上清液，于532 nm下測定吸光度，純水代替樣品作空白對(duì)照。脂質(zhì)過氧化抑制率計(jì)算公式如下。

脂質(zhì)過氧化抑制率/%=[1-A1/A0]×100

式中：A0和A1分別為空白和樣品的吸光度值。

亞鐵離子螯合率測定參考CHEN等[19]的方法，0.5mL復(fù)合果蔬汁發(fā)酵液與0.1 mL 1%抗壞血酸、0.1 mL 0.4%硫酸亞鐵、1 mL氫氧化鈉（0.2 mol/L）混合，置于37℃水浴反應(yīng)25 min，4500 r/min離心10 min收集上清液，取0.2 mL上清液與2 mL 1%O-菲啰啉混合，靜置10 min后于510 nm下測定吸光度，純水代替樣品作空白對(duì)照。亞鐵離子螯合率計(jì)算公式如下。

亞鐵離子螯合率/%=[1-A1/A0]×100

式中：A0和A1分別為空白和樣品的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用GraphPad Prism 8軟件繪圖，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），用于分析組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌落總數(shù)的動(dòng)態(tài)變化

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中乳酸菌菌落總數(shù)的動(dòng)態(tài)變化見表1。

表1 復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中乳酸菌菌落總數(shù)的動(dòng)態(tài)變化Table 1 Dynamic changes in the total numbers of colonies during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

由表1可知，NF組乳酸菌菌落總數(shù)呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，說明乳酸菌可在以沙棘、胡蘿卜和黑棗為原料的復(fù)合果蔬汁中迅速生長繁殖。與NF組相比，LP組和LP-Se組乳酸菌菌落總數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間延長均呈先增大后基本保持穩(wěn)定的變化趨勢(shì)，與吳萬林等[20]研究結(jié)果相一致。LP-Se組在發(fā)酵12 h時(shí)乳酸菌菌落總數(shù)迅速增加至7.45 lg（CFU/mL），遠(yuǎn)高于LP組的7.05 lg（CFU/mL）。此外，LP-Se組乳酸菌菌落總數(shù)在發(fā)酵24 h就能達(dá)到穩(wěn)定，可達(dá)8.31 lg（CFU/mL），而LP組則需要30 h才能達(dá)到穩(wěn)定，其乳酸菌菌落總數(shù)只有8.21 lg（CFU/mL）。上述結(jié)果表明，富硒乳酸菌在果蔬汁中的生長繁殖速率要高于不富硒的乳酸菌，進(jìn)一步說明少量的硒可以促進(jìn)乳酸菌的生長，與CHEN等[19]的結(jié)論一致。

2.2 理化特性和有機(jī)酸含量的動(dòng)態(tài)變化

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中理化特性的動(dòng)態(tài)變化見圖1。

圖1 復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中理化特性的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes in the physiochemical properties during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

根據(jù)圖1（A）可知，3種不同發(fā)酵工藝均會(huì)使復(fù)合果蔬汁的pH值在發(fā)酵過程中呈逐漸下降的變化趨勢(shì)，與XU等[3]研究結(jié)果相一致。其中，LP-Se組的下降速率最快，從pH4.07下降至pH3.49；且LP-Se組在發(fā)酵36 h的pH值最低，與表1菌落總數(shù)的結(jié)果相一致，說明硒會(huì)促進(jìn)乳酸菌的生長，增加發(fā)酵體系中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，加速復(fù)合果蔬汁的酸化。如圖1（B）所示，復(fù)合果蔬汁中總酸含量的變化與pH值的變化相反，這是由于原料中有機(jī)酸的溶出及乳酸菌在生長代謝中產(chǎn)生了乳酸等有機(jī)酸[7]。NF組的總酸含量由最初的2.72 g/L增加至12.21 g/L，而LP組和LP-Se組的總酸含量始終高于NF組，其發(fā)酵36 h時(shí)總酸含量分別是NF組的1.61倍和1.67倍，說明接種乳酸菌可加速發(fā)酵體系總酸的積累，縮短發(fā)酵時(shí)間。由圖1（C）可知，除NF組還原糖含量呈先上升后逐漸下降的變化趨勢(shì)外，LP-Se組和LP組還原糖含量大致呈先上升后迅速下降再維持穩(wěn)定的變化趨勢(shì)。還原糖含量上升是由于乳酸菌生長代謝過程中產(chǎn)生的酶可將復(fù)合果蔬汁中其它類型糖類化合物分解成還原糖，從而增加發(fā)酵初期還原糖含量。隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，乳酸菌會(huì)利用發(fā)酵體系中還原糖作為碳源快速生長繁殖，進(jìn)而導(dǎo)致還原糖含量迅速下降。而發(fā)酵后期還原糖含量不再降低，說明乳酸菌的生物量達(dá)到瓶頸，與表1菌落總數(shù)的結(jié)論相吻合。在發(fā)酵36 h時(shí)，LP-Se組和LP組還原糖含量相當(dāng)。如圖1（D）所示，復(fù)合果蔬汁中可溶性蛋白含量隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行而逐漸減少，與王越等[15]研究結(jié)果一致，可能是由于可溶性蛋白能與脂肪、纖維素等結(jié)合形成致密且不溶于水的大分子物質(zhì)，且發(fā)酵環(huán)境的不斷酸化也會(huì)導(dǎo)致可溶性蛋白在大量H+水解作用下分解為多肽和氨基酸[15]。在發(fā)酵36 h時(shí)，LP-Se組可溶性蛋白含量為0.25 g/L，低于LP組（0.3 g/L）和NF組（0.55 g/L）。

復(fù)合果蔬汁中有機(jī)酸含量也會(huì)影響產(chǎn)品的口感及風(fēng)味[21]。復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中有機(jī)酸的變化見表2。

表2 復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中有機(jī)酸的動(dòng)態(tài)變化Table 2 Dynamic changes in the content of organic acids during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

根據(jù)表2可知，發(fā)酵前胡蘿卜、沙棘和藍(lán)莓復(fù)合果蔬汁中蘋果酸含量最高，其含量可達(dá)3.06 g/L，占整個(gè)有機(jī)酸比例的70%。但隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，復(fù)合果蔬汁中蘋果酸含量逐漸減少。在發(fā)酵36 h時(shí)，LP組和LP-Se組中蘋果酸含量分別為0.47 g/L和0.41 g/L。此外，在發(fā)酵36 h時(shí)，3種不同工藝發(fā)酵復(fù)合果蔬汁中莽草酸、富馬酸和丙酮酸含量相當(dāng)，而草酸、乙酸、檸檬酸、乳酸和琥珀酸含量有較大差異。在發(fā)酵36 h時(shí)，LP組中檸檬酸含量為7.52 g/L，相比LP-Se組，提高了9.94%。隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，復(fù)合果蔬汁中乳酸含量的變化最為顯著，而在復(fù)合原料（未發(fā)酵）中未能檢測到乳酸，表明乳酸菌發(fā)酵有助于乳酸的積累。在發(fā)酵36 h時(shí)，NF組中乳酸含量僅為9.25 g/L，而LP-Se組和LP組的乳酸含量分別為16.82 g/L和16.07 g/L，表明接種乳酸菌可加速復(fù)合果蔬汁乳酸的積累，且硒可以改善乳酸菌的代謝，從而產(chǎn)生更多的乳酸。綜上，乳酸含量是影響復(fù)合發(fā)酵果蔬汁口感的主要因素之一。

2.3 硒含量的動(dòng)態(tài)變化

LP-Se組復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中硒含量的動(dòng)態(tài)變化見圖2。

圖2 接種富硒植物乳桿菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中硒含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes in the concentration of selenium during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice by inoculating of selenium-enriched L.plantarum

如圖2所示，LP-Se組在發(fā)酵過程中硒含量呈持續(xù)增加的變化趨勢(shì)，這是由于發(fā)酵初期硒大部分都存在于接種的富硒植物乳桿菌細(xì)胞內(nèi)，而隨著這些富硒植物乳桿菌的生長代謝，其中絕大部分的硒會(huì)隨著微生物的自溶而溶于復(fù)合果蔬汁中，從而增加復(fù)合果蔬汁中硒的含量，且這些硒是以納米硒和有機(jī)硒的形式存在，生物利用率高且毒性低。發(fā)酵0～24 h，復(fù)合果蔬汁中硒含量迅速增加，從0增加至19.77 μg/mL；隨后緩慢增加，發(fā)酵36 h達(dá)到20.97 μg/mL，說明富硒乳酸菌發(fā)酵是提高發(fā)酵食品中硒含量的一種有效方法。

2.4 總黃酮和總多酚的動(dòng)態(tài)變化

多酚類化合物是果蔬汁中主要的天然抗氧化劑。復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中總黃酮和總多酚的動(dòng)態(tài)變化見圖3。

圖3 復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中總黃酮和總多酚的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes in total flavonoids contents and total polyphenol contents during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

由圖3（A）可知，3種不同發(fā)酵工藝均會(huì)增加復(fù)合果蔬汁中總黃酮含量，NF組和LP組中總黃酮含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而持續(xù)增加，LP-Se組中總黃酮含量則呈先增加后趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)。乳酸菌在生長過程中會(huì)產(chǎn)生各種酶，這些酶會(huì)促進(jìn)纖維素、果膠等大分子物質(zhì)的分解，使大量黃酮類化合物溶于發(fā)酵體系中，從而增加果蔬汁中總黃酮的含量[22]。LP組中總黃酮含量在發(fā)酵36 h達(dá)到0.31 g/L；LP-Se組在發(fā)酵24 h基本達(dá)到穩(wěn)定，其含量為0.34 g/L。結(jié)合表1的結(jié)果可知，硒會(huì)增加植物乳桿菌的生物量，增加產(chǎn)酶能力，促進(jìn)纖維素及果膠的降解，從而積累更多的總黃酮。如圖3（B）所示，NF組中總多酚含量在發(fā)酵36 h達(dá)到8.02 g/L；而LP組和LP-Se組中總多酚含量均在發(fā)酵30 h達(dá)到最高，分別為9.92 g/L和10.92 g/L。隨著發(fā)酵過程中單體酚類化合物的不斷合成，會(huì)促進(jìn)多酚含量的增加，而酚類物質(zhì)的氧化與生成也是同時(shí)進(jìn)行的，到了發(fā)酵后期，生成速率降低，而氧化過程仍在繼續(xù)，導(dǎo)致酚類物質(zhì)的減少[15，23]。在發(fā)酵36 h時(shí)，相比LP組，LP-Se組中總多酚含量提高了10.08%，表明硒不僅會(huì)增加酚類物質(zhì)的合成，同時(shí)也會(huì)降低酚類物質(zhì)的氧化，從而增加復(fù)合果蔬汁多酚類生物活性物質(zhì)的含量。

2.5 體外抗氧化能力的動(dòng)態(tài)變化

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中脂質(zhì)過氧化抑制率和亞鐵離子螯合率的動(dòng)態(tài)變化見圖4。

圖4 復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中體外抗氧化能力的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes in antioxidant activity during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

由圖4可知，除NF組的脂質(zhì)過氧化抑制率和亞鐵螯合率呈持續(xù)上升的變化趨勢(shì)，LP組和LP-Se組則均呈先上升后緩慢下降的變化趨勢(shì)。LP組和LP-Se組的脂質(zhì)過氧化抑制率均在發(fā)酵24 h達(dá)到最高，其中LP-Se組的脂質(zhì)過氧化抑制率為21.57%，是LP-Se組的1.3倍。隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，在發(fā)酵36 h時(shí)，NF組和LP組的脂質(zhì)過氧化抑制率無差別，低于LP-Se組（20.52%）。此外，LP-Se組和LP組的亞鐵離子螯合率則分別在發(fā)酵24 h和30 h基本達(dá)到穩(wěn)定，分別為43.13%和38.03%。在發(fā)酵36 h時(shí)，LP-Se組的亞鐵離子螯合率為43.17%，分別比LP組和NF組提高了15.72%和26.08%。這可能與乳酸菌的代謝產(chǎn)物及復(fù)合果蔬汁中活性物質(zhì)的變化有關(guān)[24]。綜上可知，硒的存在有助于提高復(fù)合果蔬汁的體外抗氧化能力。這個(gè)結(jié)果可能與植物乳桿菌可將無機(jī)硒生物轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒和納米硒有關(guān)，且有機(jī)硒和納米硒具有抗氧化的潛力[25]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)比較3種不同發(fā)酵工藝（自然發(fā)酵、接種植物乳桿菌發(fā)酵和接種富硒植物乳桿菌發(fā)酵）對(duì)復(fù)合果蔬汁理化特性、有機(jī)酸、多酚類化合物、硒含量及體外抗氧化能力的影響。與自然發(fā)酵相比，接種發(fā)酵，尤其是接種富硒植物乳桿菌的發(fā)酵，對(duì)抗氧化能力的貢獻(xiàn)更大。接種富硒植物乳桿菌可使發(fā)酵后的復(fù)合果蔬汁獲得最高的乳酸菌菌落總數(shù)和總酸、乳酸、總黃酮、總多酚含量。此外，接種富硒植物乳桿菌的復(fù)合果蔬汁中硒含量可達(dá)20.97 μg/mL。本研究用富硒乳酸菌發(fā)酵傳統(tǒng)食品和果蔬汁，無疑是增加蔬菜、水果和硒的日常攝入量的一種簡單、有效且安全的方法。