祁興普，劉純友，佀再勇，劉萍，傅曉雨，戰(zhàn)旭梅，陳通*

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院食品科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006）

廬山云霧茶是我國傳統(tǒng)名茶，其主要產(chǎn)于江西省九江市境內(nèi)的廬山，其色澤呈碧綠，茶湯清澈透明，滋味醇香甘潤，是綠茶中的上品[1-3]。相關(guān)資料表明[4-6]，茶葉的品質(zhì)等級差異是由其內(nèi)在的化學(xué)成分組成以及在沖泡過程中所呈現(xiàn)出的感官屬性所決定的。而茶葉香氣則是眾多揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)（volatile organic com－pounds，VOCs）綜合作用的結(jié)果，也是茶葉品質(zhì)分級的重要判別依據(jù)，其直接關(guān)系到企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益與消費(fèi)者的喜愛程度。因此，茶葉中VOCs的差異組成可作為特征指紋譜用于直觀反映茶葉品質(zhì)特征[7]。當(dāng)前，不同等級茶葉之間的鑒別仍然依靠評茶師的感官評價(jià)，但該方法難以通過數(shù)字化方式表述VOCs信息組成，且由于不同等級茶葉之間品質(zhì)成分差異不大，導(dǎo)致其正確識別率也并不理想[8]。因此，應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提取茶葉VOCs中的表征性成分，實(shí)現(xiàn)茶葉品質(zhì)等級的快速、準(zhǔn)確、無損判別對現(xiàn)代茶葉的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展顯得尤為重要。近年來，相關(guān)研究人員已采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）[9]、氣相色譜-嗅聞[10]以及電子鼻、電子舌[11]等多種分析技術(shù)對茶樣中的VOCs成分進(jìn)行分析檢測，并在產(chǎn)地識別、種類判別以及品質(zhì)分級等方面均取得了較好的成果[12-14]。然而，這些分析方法均存在一定的局限性，如GC-MS聯(lián)用技術(shù)的檢測結(jié)果雖然準(zhǔn)確可靠，但其設(shè)備運(yùn)行環(huán)境要求苛刻，且操作繁雜、檢測成本高、耗時(shí)久，難以在現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)中得到推廣應(yīng)用。離子遷移譜（ion mobility spectrometry，IMS）技術(shù)是基于氣相中不同的氣相離子在電場中遷移速度的不同來表征離子物質(zhì)自身屬性的一項(xiàng)分析技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于爆炸物的痕量檢測[15]、非法藥物識別[16]、食品質(zhì)量過程控制[17]、人體健康檢查[18]以及生物環(huán)境監(jiān)測[19]等多個(gè)領(lǐng)域。氣相離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是由氣相色譜和離子遷移譜兩種設(shè)備組合形成的聯(lián)用型分析儀器，其可發(fā)揮不同儀器各自的優(yōu)勢，從而產(chǎn)生長處相互疊加的效果，具有無損、簡便、快捷、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)檢測、質(zhì)量控制以及過程分析控制等多個(gè)領(lǐng)域，而基于VOCs指紋信息將GC-IMS技術(shù)應(yīng)用于茶葉品質(zhì)的研究卻少有報(bào)道。

本研究以不同等級的廬山云霧茶為研究對象，引入數(shù)字圖像技術(shù)[20-21]，通過分析GC-IMS二維譜圖篩選不同等級廬山云霧茶樣品之間VOCs的差異，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立廬山云霧茶的等級判別模型，為茶葉品質(zhì)分析提供一種新的分析方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

廬山云霧茶樣：廬山市七尖云霧茶有限公司（江西九江），63個(gè)茶樣，共3個(gè)等級，其中一級樣品為18個(gè)，二級樣品為20個(gè)，三級樣品為25個(gè)。茶葉等級評定主要依據(jù)采摘日期而定，高等級的茶樣采摘時(shí)間較早，且產(chǎn)量低。試驗(yàn)前，將所有樣品保存于5℃冰箱中待測。

1.2 儀器與設(shè)備

FlavourSpec@1H1-00128型GC-IMS設(shè)備：德國Gesellschaft公司；CTC-PAL自動進(jìn)樣裝置：瑞士CTC Analytics AG公司；SE-54-CB-1型非極性石英毛細(xì)管柱（15 m ×0.53 mm ×1 μm）：德國 CS-Chromatographie Service GmbH公司；EL204-IC型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 GC-IMS檢測條件

樣品檢測前，參照陳熠敏等[22]、宋萌萌等[23]的預(yù)處理方法，將不同等級廬山云霧茶粉碎過篩待測，GC-IMS檢測條件如下。

頂空進(jìn)樣條件：分別稱取2 g茶葉樣品置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中密封，通過自動頂空進(jìn)樣方式進(jìn)樣，進(jìn)樣體積200 μL，孵化溫度80℃，孵化時(shí)間30 min，進(jìn)樣針溫度為85℃，孵化器轉(zhuǎn)速500 r/min。

GC條件：色譜柱溫50℃，載氣為高純度N2（純度≥99.999%），載氣流速控制程序?yàn)椋浩鹗剂魉? mL/min，保持2 min后8 min內(nèi)線性增加至15 mL/min，接著10 min內(nèi)線性增至100 mL/min，最后10 min內(nèi)線性增至150 mL/min，總分析時(shí)間為30 min。

IMS條件：3H電離源（6.5keV），漂移管溫度為45℃，漂移氣體為N2，漂移氣體流速為150 mL/min，漂移管溫度45℃，正離子化模式，漂移管長度9.8 cm，管內(nèi)線性電壓為400 V/cm。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

使用 MATLAB R2009b（The Mathworks Inc.）軟件繪制譜圖；采用GC×IMS Library Search 2.0.3（內(nèi)置NIST2004與IMS數(shù)據(jù)庫）軟件進(jìn)行特征化合物的鑒定；使用PRTools 5.0（荷蘭代爾夫特理工大學(xué)）工具包實(shí)現(xiàn)特征提取和模式識別分析。

2 結(jié)果與分析

在GC-IMS二維譜圖中，X、Y、Z軸分別對應(yīng)遷移時(shí)間（ms）、保留時(shí)間（s）和離子強(qiáng)度大?。╒），其本質(zhì)為一個(gè)二維矩陣。因此，基于數(shù)字圖像原理，該矩陣數(shù)據(jù)可依據(jù)顏色映射表顯示為一幅灰度圖像，或者按照一定的顏色圖填充形成偽彩色圖像，顏色的差異用于表示Z軸數(shù)據(jù)的大小。

2.1 GC-IMS指紋譜分析

為觀察不同等級茶葉樣品的整體VOCs特征信息，按照等級歸屬分別計(jì)算每個(gè)等級內(nèi)茶葉樣品的平均GC-IMS譜圖（即每個(gè)等級內(nèi)矩陣的平均值）作為表征譜圖。另外，由于GC-IMS原始譜圖對應(yīng)的矩陣維度較大（4 615×4 500），且不能很好地分辨茶葉樣品所產(chǎn)生的VOCs區(qū)域差異，對后續(xù)判別模型的學(xué)習(xí)和計(jì)算帶來不便。因此，為降低數(shù)據(jù)運(yùn)算和提高可視化效果，截取遷移時(shí)間為7.698 ms～13.138 1 ms、保留時(shí)間為108.42 s～426.66 s內(nèi)的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行可視化顯示，結(jié)果如圖1所示。

圖1 一級、二級和三級的廬山云霧茶GC-IMS譜圖Fig.1 GC-IMS chromatography plot of first-grade，second-grade and third-grade of Lushan Cloud-fog tea

由圖1可知，3種等級廬山云霧茶樣產(chǎn)生VOCs的種類在GC-IMS譜圖上呈現(xiàn)一定的相似性，表明3種等級茶樣均含有部分相同的VOCs，具體表現(xiàn)為在相同的遷移時(shí)間和保留時(shí)間垂直相交的特征區(qū)域均有信號峰產(chǎn)生，但對應(yīng)VOCs的含量存在差異，表現(xiàn)為特征峰強(qiáng)度的不同（圖1中分別標(biāo)記的實(shí)線矩形框）；不同等級的茶葉樣品含有對應(yīng)自身等級所獨(dú)有的揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)，如圖1 A中實(shí)線箭頭方向指示的區(qū)域，該物質(zhì)對應(yīng)的區(qū)域在二級、三級茶葉樣品中均未出現(xiàn)，其為一級廬山云霧茶樣品所特有的香氣物質(zhì)。

GC-IMS二維譜圖僅能夠提供直觀性的對比分析，不能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的數(shù)字化表述。因此，如何從GCIMS譜圖中提取特征性VOCs信息用以表征不同等級樣品品質(zhì)之間的差異顯得很有必要。為進(jìn)一步觀察不同等級廬山云霧茶的VOCs差異變化，依據(jù)顏色混合原理（即加色混合），分別使用紅色、綠色、藍(lán)色3種單色對3個(gè)等級茶樣的平均矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行映射，然后將得到的譜圖進(jìn)行顏色混合處理，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同等級廬山云霧茶單色混合圖Fig.2 Monochromatic mix of maps of different grades of Lushan Cloud-fog tea

由RGB色彩模型可知，紅色與綠色混合可形成黃色，紅色與藍(lán)色混合可產(chǎn)生品紅色，綠色和藍(lán)色混合則形成青色，而3種顏色等量混合可形成白色。因此，結(jié)合圖2可知，圖中部分特征區(qū)域（如圖2中標(biāo)記編號為11的特征峰對應(yīng)物質(zhì)為苯甲醛）對應(yīng)的特征VOCs為一級廬山云霧茶所特有，部分特征區(qū)域?qū)?yīng)物質(zhì)為二級茶特有（見圖 2中標(biāo)記編號為 5、8、9、13、20等區(qū)域?qū)?yīng)的特征峰），而其它區(qū)域?qū)?yīng)的VOCs則為3種等級茶樣所共有的VOCs物質(zhì)（見圖2中標(biāo)記編號為10對應(yīng)的特征峰）。結(jié)合本研究的目的，使用Otsu自動閾值分割算法對混合處理后的顏色進(jìn)行特征提取，最終共提取了47個(gè)特征峰變量作為表征不同等級茶樣之間的VOCs差異，以便結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)一步分析，選取的特征區(qū)域見圖2中數(shù)字標(biāo)識區(qū)域。

2.2 VOCs成分分析

由于GC-IMS聯(lián)用設(shè)備所獲得數(shù)據(jù)為二維矩陣，故特征峰對應(yīng)物質(zhì)的檢索是同時(shí)依據(jù)保留時(shí)間和漂移時(shí)間進(jìn)行確定（即十字交叉鑒別）。由于當(dāng)前設(shè)備自帶的IMS譜庫化合物存儲量并不豐富，故不能實(shí)現(xiàn)所有特征峰的鑒別。在保留指數(shù)檢索誤差范圍為[-6，+6]、歸一化后遷移時(shí)間誤差范圍為[-0.01，+0.01]的條件下，部分特征峰對應(yīng)揮發(fā)性物質(zhì)檢索結(jié)果見表1。

表1 不同等級廬山云霧茶揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)定性結(jié)果Table 1 Qualitative results of GC-IMS volatile compounds in the Lushan Cloud-fog tea

由表1可知，廬山云霧茶的VOCs主要為醇類、醛類、烯類以及少量的酮類、呋喃類等物質(zhì)；其中正戊醇、苯甲醛（對應(yīng)圖2中標(biāo)記編號3和11的特征區(qū)域）等VOCs為一級茶樣所特有，同理二級茶樣中苯已醛、辛醛以及檸檬烯等物質(zhì)為其主要特征物質(zhì)，這與已有的報(bào)道相一致[24-25]；而三級茶樣所含有的特征VOCs種類較少，且物質(zhì)含量較低，表現(xiàn)為圖2中歸屬于三級茶樣的特征區(qū)域出現(xiàn)較少。由此可知，不同等級廬山云霧茶樣的VOCs成分在種類、含量等方面均存在差異，故可借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)一步研究基于VOCs差異而實(shí)現(xiàn)不同等級茶葉判別的可行性。

2.3 主成分分析

將選取的47個(gè)特征區(qū)域的峰面積作為特征變量，組成63×47的矩陣進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），并取前2個(gè)主成分因子的得分向量作散點(diǎn)圖，其結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同等級廬山云霧茶樣品主成分得分圖Fig.3 Principal component analysis of the Lushan Cloud-fog tea samples

由圖3可知，矩陣經(jīng)過PCA后前2個(gè)主成分得分的貢獻(xiàn)率分別為54.78%、32.15%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到86.93%，表明前2個(gè)主成分能夠較好地代表原始數(shù)據(jù)的絕大部分有效信息。3種不同等級茶葉樣本在主成分得分圖中均有各自的歸屬類，第一主成分比第二主成分在分類邊界中起到的作用更大，但不同等級茶葉樣品的簇類邊界之間還存在一定的重疊現(xiàn)象，尤其是二級與三級樣品之間區(qū)域邊界不明顯或部分區(qū)域重疊，可能是由這2種等級茶樣產(chǎn)生的VOCs過于相似所導(dǎo)致。因此，需要進(jìn)一步使用模式識別算法對其進(jìn)行區(qū)分。

2.4 模式識別

采用 K-最近鄰（K-nearest neighbor，KNN）法對經(jīng)過PCA特征壓縮后的前2個(gè)得分向量進(jìn)行模式識別?？紤]到不同等級茶葉樣品數(shù)量各不相同，故按照7∶3的比例分別從對應(yīng)等級中隨機(jī)選取樣本，劃分為訓(xùn)練集和預(yù)測集，最終判別結(jié)果如表2所示。

表2 不同等級廬山云霧茶KNN識別結(jié)果Table 2 KNN classification results of different grades of Lushan Cloud-fog tea

由表2可知，訓(xùn)練集中一級和二級廬山云霧茶樣品的識別率均為100%，而三級茶葉樣品中僅有1個(gè)樣品被誤判為二級樣品，其正確率為94.12%，預(yù)測集中一級和三級的樣品識別率為100%，二級茶葉存在1個(gè)樣品被誤判，其識別率為83.33%，產(chǎn)生誤判的原因可能是：一方面，二級茶葉樣品和三級茶葉樣品產(chǎn)生的VOCs種類非常相似，僅在物質(zhì)成分的含量有所差異，導(dǎo)致二級和三級樣品之間的區(qū)域邊界部分重疊；另一方面，由于KNN算法是基于空間距離實(shí)現(xiàn)樣品類別的區(qū)分，導(dǎo)致其對數(shù)據(jù)的局部結(jié)構(gòu)非常敏感。由此可知，基于GC-IMS構(gòu)建的風(fēng)味指紋譜圖結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可實(shí)現(xiàn)不同等級廬山云霧茶的準(zhǔn)確區(qū)分，其預(yù)測集區(qū)分度高達(dá)94.73%。

3 結(jié)論

本研究以不同等級廬山云霧茶為研究對象，依據(jù)數(shù)字圖像技術(shù)并結(jié)合Otsu自動閾值分割算法實(shí)現(xiàn)GCIMS二維譜圖中差異特征峰的自動選取，從而構(gòu)建了不同等級廬山云霧茶的差異指紋信息譜，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立不同等級的判別模型。試驗(yàn)結(jié)果表明，選取的特征峰集合能夠有效表征不同等級廬山云霧茶的VOCs信息差異，KNN判別模型的預(yù)測集識別率可達(dá)94.73%，表明GC-IMS技術(shù)可用于茶葉品質(zhì)信息的分析和檢測，數(shù)字圖像處理技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的引入可以更好地實(shí)現(xiàn)茶葉等級的數(shù)字化判別，該方法為基于VOCs成分差異分析茶葉品質(zhì)提供了參考依據(jù)。