林琰 王愛琴 呂華偉 張宏建

摘 要： 為深入了解麻瘋樹種子的化學(xué)成分，有必要對其具有生物活性的二萜類成分進行研究。該研究利用正相硅膠、ODS、制備液相等色譜分離方法，從麻瘋樹種子的乙醇提取物中共分離得到了6個二萜類化合物，并采用熒光偏振技術(shù)對化合物進行蛋白激酶C （PKC） 抑制活性的測定。結(jié)果表明：根據(jù)化合物的理化性質(zhì)、MS和NMR，并參考相關(guān)文獻，這6個二萜類化合物分別鑒定為3β-acetoxy-12-methoxy-13-methyl-podocarpa-8，11，13-trien-7-one （1）、4-epi-dehydroabietic acid （2）、3β-hydroxy-19-O-acetyl-pimara-8（9），15-dien-7-one （3）、Jatrophodione A （4）、14-O-acetyl-5，6-epoxy-（14E）-jatrogrossidentadion （5）、2-Hydroxy jatrophone （6）。其中，化合物2、3、6均為首次從該植物中分離得到，且化合物2對PKCβ具有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞： 麻瘋樹， 種子， 化學(xué)成分， 二萜， PKCβ抑制劑

中圖分類號： Q946.91 ?文獻標識碼： A ?文章編號： 1000-3142（2021）07-1090-07

Abstract： In order to learn more about the chemical composition of Jatropha curcas seeds， the diterpenes from J. curcas seeds and their protein kinase C （PKC） inhibition activities was necessary to study. The compounds were isolated by silica gel， ODS and preparation HPLC. Six diterpenes were isolated from ethanol extraction of J. curcas seeds. The structures were identified as 3β-acetoxy-12-methoxy-13-methyl-podocarpa-8，11，13-trien-7-one （1）， 4-epi-dehydroabietic acid （2）， 3β-hydroxy-19-O-acetyl-pimara-8（9），15-dien-7-one （3）， Jatrophodione A （4）， 14-O-acetyl-5，6-epoxy-（14E）-jatrogrossidentadion （5）， 2-Hydroxy jatrophone （6） by physicochemical properties， MS， NMR and some reported data. Compounds 2， 3 and 6 were isolated from J. curcas for the first time， and compound 2 showed inhibitory effect on PKCβ.

Key words： Jatropha curcas， seed， chemical constituents， diterpene， PKCβ inhibitor

麻瘋樹（Jatropha curcas）為大戟科（Euphorbiaceae）麻瘋樹屬（Jatropha）植物，全株可入藥，主要用于體外性用藥（如關(guān)節(jié)挫傷、皮膚瘙癢和濕疹等）（江蘇新醫(yī)學(xué)學(xué)院，2003）。麻瘋樹在我國廣東、廣西、云南等地均有分布，近年來還進行了大量的人工種植和生物能源開發(fā)應(yīng)用研究（余德才和吳軍，2016）。麻瘋樹枝葉、根莖等部位的化學(xué)成分及活性萜類成分已有大量研究報道（Igbinosa et al.，2011;Liu et al.，2015;Othman et al.，2015）。其中，麻瘋樹中含有的二萜類成分，主要包括巴豆烷、蓖麻烯和千金二萜烷等多種類型的二萜化合物都表現(xiàn)出較好的生物活性而吸引了眾多科學(xué)家的目光（Abdelgadir et al.，2013）。來源于麻瘋樹植物的麻瘋樹酚酮（Theoduloz et al.，2009）、Curcusone B（Muangman et al.，2005）、麻瘋樹三酮及相關(guān)衍生物（Torrance et al.，1976）等先后發(fā)現(xiàn)對胃癌細胞、膀胱癌細胞和白血病細胞等多種腫瘤細胞都有很好的抑制作用。因此，有望從麻瘋樹中發(fā)現(xiàn)更多具有高效低毒的抗腫瘤成分及相關(guān)先導(dǎo)化合物。

麻瘋樹種油可用作瀉藥和治療皮膚病，近代研究發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗癌活性，以及在生物能源和病蟲害防治等方面都具有潛在的應(yīng)用價值，受到人們的廣泛關(guān)注（Openshaw，2000）。目前，針對麻瘋樹種子的化學(xué)成分研究主要集中在其揮發(fā)性成分，包括脂肪酸、蛋白質(zhì)等（陳元雄等，2006;陳鵬等，2007;萬輝等，2010;田慶，2011）。但是對麻瘋樹種子中非揮發(fā)性成分，特別是具有生物活性的二萜類成分的研究卻少見報道（Roach et al.，2012）。因此，為深入了解麻瘋樹種子的化學(xué)成分，進一步挖掘該植物的藥用價值，有必要開展麻瘋樹種子中具有生物活性的二萜類化學(xué)成分研究。

本研究選用麻瘋樹種子為材料，對其中的二萜成分進行提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定，從其乙醇提取物中共分離鑒定了6個二萜類化合物，其中化合物2、3、6均為首次從該植物中分離得到。通過建立的PKCβ抑制劑高通量篩選模型對鑒定的化合物進行PKCβ抑制活性測試，發(fā)現(xiàn)化合物2對PKCβ具有一定的抑制作用，揭示該植物具有潛在的抗腫瘤活性。本研究結(jié)果進一步豐富了麻瘋樹種子的化學(xué)成分，為該資源后續(xù)的開發(fā)與利用提供了科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料 材料于2016年10月采自江蘇沭陽，經(jīng)浙江省中醫(yī)藥研究院浦錦寶研究員鑒定為麻瘋樹（Jatropha curcas）的種子，標本（標本號為ZHJ-20161001）保存于浙江省中藥新藥研發(fā)重點實驗室。麻瘋樹種子經(jīng)過粉碎，過20目篩，得種仁粉末。

1.1.2 試劑 蛋白激酶C試劑盒（南京卡米洛生物工程有限公司）、DMSO、MgCl2、CaCl2（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇（分析級和色譜級）、乙腈（分析級和色譜級）、95%乙醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司）等。

1.1.3 儀器 NMR譜由Bruker AV-500MHz核磁共振光譜儀測定，以TMS作為內(nèi)標;ESI-MS由Waters質(zhì)譜儀測定;高效液相色譜采用Agilent 1260系統(tǒng)（美國Agilent公司）;制備液相色譜采用Waters系統(tǒng)（美國Waters公司）;硅膠和薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠）;反相材料為YMS RP-18（日本YMS公司）;Epoch 微孔板分光光度計（美國伯騰儀器有限公司）;漩渦混合器（美國Vortex-Genie 2）;萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）;黑色96孔板（美國賽默飛公司）;5810R高速冷凍離心機（德國艾本德公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離 取5 kg粉碎后備用的種仁，用95%的乙醇20 L回流提取3次，減壓過濾，濃縮濾液，得麻瘋樹種油浸膏（326 g），為棕黃色油狀液體。加蒸餾水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、甲醇萃取，得到石油醚部位（220 g）、乙酸乙酯部位（38 g）、甲醇部位（60 g）。取乙酸乙酯部位用二氯甲烷溶解，進行正相硅膠柱層析分離，二氯甲烷-甲醇（100∶0，100∶1，10∶1，5∶1，2∶1）為流動相梯度洗脫，經(jīng)薄層檢查，合并相同流份，濃縮得到A-D四個組分。其中C組分（6.3 g）經(jīng)ODS中壓柱色譜（15%～60%乙腈/水）得C1-C4組分，C2組分經(jīng)制備液相（32%乙腈/水）分離得到化合物1（15 mg）;C3組分經(jīng)制備液相（32%乙腈/水）分離得到化合物2（8 mg）和3（13 mg）。D組分（10.0 g）經(jīng)ODS中壓柱色譜（15%～50%乙腈/水）得D1-D5組分，D3組分經(jīng)制備液相（30%乙腈/水）分離得到化合物4（12 mg）、5（10 mg）和6（13 mg）。

1.2.2 PKC活性篩選 根據(jù)試劑盒使用方法說明和文獻報道（李禮，2009），取PKCβ酶16 pg·μL-1 2 μL，ATP 20 μmol，PKC底物0.2 μmol與不同濃度的化合物1-6（4、8、16、32、64、128 μmol·L-1）混合，同時設(shè)定對照，使反應(yīng)體系終體積為50 μL，避光反應(yīng)90 min。取50 μL反應(yīng)終止液加入激酶反應(yīng)體系終止反應(yīng)，將孔中液體混合均勻，密封避光，室溫孵育1 h，在激發(fā)光483 nm和發(fā)射光536 nm波長下，檢測各孔的偏振值（mp）。

PKCβ抑制率（%）=（藥物處理組mp-無酶對照組mp）/（無抗體對照組mp-無酶對照組mp）× 100。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色粉末，ESI-MS m/z： 343.2 [M-H]-，分子式C21H28O4。1H-NMR （500 MHz， CDCl3） δ 7.81 （1H， s， H-14）， 6.68 （1H， s， H-11）， 4.57 （1H， dd， J = 11.5， 4.0 Hz， H-3）， 3.88 （3H， s， OMe）， 2.86 （1H， m， H-6）， 2.43 （1H， m， H-1）， 2.19 （1H， s， H-15）， 2.08 （3H， s， OAc）， 1.96 （1H， m， H-2）， 1.94 （1H， dd， J = 11.5， 4.0 Hz， H-5）， 1.84 （1H， m， H-2）， 1.81 （1H， m， H-1）， 1.26 （3H， s， H-20）， 1.04 （3H， s， H-18）， 0.94 （3H， s， H-19）。13C-NMR （125 MHz， CDCl3） δ 201.2 （C， C-7）， 166.2 （C， C-12）， 160.6 （C， C-13）， 133.5 （CH， C-14）， 128.0 （C， C-8）， 124.5 （C， C-9）， 104.4 （CH， C-11）， 83.4 （CH， C-3）， 58.8 （CH3， OMe）， 52.9 （CH， C-5）， 42.4 （C， C-10）， 39.9 （C， C-4）， 39.7 （CH2， C-1）， 38.7 （CH2， C-6）， 32.4 （CH3， C-18）， 24.4 （CH2， C-2）， 25.0 （CH3， C-20）， 23.1 （CH3， OAc）， 17.4 （CH3， C-19） ， 17.3 （CH3， C-15）。經(jīng)鑒定化合物1為3β-acetoxy-12-methoxy-13-methyl-podocarpa-8，11，13-trien-7-one（Devappa et al.， 2011）。

化合物2 無色油狀物，ESI-MS m/z： 301.1 [M+H]+，分子式C20H28O2。1H-NMR （500 MHz， CDCl3） δ 7.16 （1H， d， J = 8.2 Hz， H-11）， 7.00 （1H， dd， J = 8.2， 1.5 Hz， H-12）， 6.88 （1H， d， J = 1.5 Hz， H-14）， 2.91 （1H， m， H-7）， 2.80 （1H， m， H-15）， 2.31 （1H， d， J = 13.0 Hz， H-1）， 2.24 （1H， d， J = 13.0 Hz， H-5）， 1.86 （1H， m， H-6）， 1.76 （1H， m， H-3）， 1.75 （1H， m， H-2）， 1.54 （1H， dd， J = 12.0， 6.0 Hz， H-6）， 1.29 （3H， s， H-19）， 1.26 （3H， s， H-20）， 1.22 （3H， d， J = 7.0 Hz， H-16）， 1.22 （3H， d， J = 7.0 Hz， H-17）。13C-NMR （125 MHz， CDCl3） δ 186.4 （C， COOH）， 149.7 （C， C-9）， 147.4 （C， C-13）， 137.5 （C， C-8）， 130.3 （CH， C-14）， 127.1 （CH， C-11）， 126.0 （CH， C-12）， 50.9 （C， C-4）， 45.2 （CH， C-5）， 39.9 （CH2， C-1）， 38.0 （C， C-10）， 37.6 （CH， C-15）， 37.2 （CH2， C-3）， 33.2 （CH2， C-7）， 25.2 （CH3， C-20）， 26.4 （CH3， C-16）， 28.0 （CH3， C-17）， 25.4 （CH2， C-6）， 19.6 （CH2， C-2）， 17.6 （CH3， C-19）。經(jīng)鑒定化合物2為4-epi-dehydroabietic acid（Chamy et al.，1987）。

化合物3 無色膠狀物，ESI-MS m/z： 359.4 [M-H]-，分子式C22H32O4。1H-NMR （500 MHz， CDCl3） δ 5.66 （1H， m， H-15）， 4.93 （1H， dd， J = 11.0， 1.5 Hz， H-16）， 4.83 （1H， dd， J = 11.0， 1.5 Hz， H-16）， 4.41 （1H， d， J = 12.0 Hz， H-19）， 4.23 （1H， d， J = 12.0 Hz， H-19）， 3.35 （1H， m， H-3）， 2.63 （1H， m， H-6）， 2.53 （1H， m， H-6）， 2.38 （1H， m， H-14）， 2.18 （1H， m， H-11）， 2.08 （3H， s， OMe）， 2.00 （1H， m， H-11）， 2.00 （1H， m， H-14）， 1.92 （1H， m， H-1）， 1.85 （1H， m， H-2）， 1.73 （1H， dd， J = 14.0， 4.0 Hz， H-5）， 1.62 （3H， s， H-12）， 1.36 （3H， m， H-2）， 1.28 （3H， m， H-12）， 1.15 （3H， s， H-18）， 1.11 （3H， s， H-20）， 1.02 （3H， s， H-17）。13C-NMR （125 MHz， CDCl3） δ 203.3 （C， C-7）， 173.8 （C， OAc）， 165.9 （C， C-9）， 146.2 （CH， C-15）， 131.3 （C， C-8）， 113.9 （CH2， C-16）， 79.6 （CH， C-3）， 66.4 （CH2， C-19）， 53.1 （CH， C-5）， 44.0 （C， C-10）， 43.9 （C， C-4）， 39.5 （CH2， C-6）， 37.2 （CH2， C-1）， 37.1 （CH2， C-12）， 37.1 （CH2， C-14）， 36.2 （C， C-13）， 32.6 （CH3， C-17）， 30.0 （CH2， C-2）， 23.4 （CH2， C-11）， 22.7 （CH3， C-18）， 22.9 （CH3， OAc）。經(jīng)鑒定化合物3為3β-hydroxy-19-O-acetyl-pimara-8（9），15-dien-7-one（Sutthivaiyakit et al.，2001）。

化合物4 無色油狀物，ESI-MS m/z： 353.2 [M-H]-，分子式C20H26O4。1H-NMR （500 MHz， CDCl3） δ 7.20 （1H， br s， H-1）， 6.52 （1H， s， H-5）， 2.61 （1H， d， J = 6.5 Hz， H-12）， 1.94～2.05 （1H， m， H-8）， 1.62～1.70 （1H， m， H-8）， 1.92 （3H， s， H-16）， 1.58 （3H， s， H-20）， 1.35～1.45 （1H， m， H-7）， 0.98～1.08 （1H， m， H-7）， 1.13～1.17 （1H， m， H-11）， 1.11 （3H， s， H-17）， 1.11 （3H， s， H-19）， 0.95 （3H， s， H-18）， 0.74～0.78 （1H， m， H-9）。13C-NMR （125 MHz， CDCl3） δ 209.4 （C， C-14）， 195.3 （C，C-3）， 155.8 （CH， C-1）， 151.4 （CH， C-5）， 145.9 （C， C-2）， 131.5 （C， C-4）， 86.6 （C， C-13）， 82.7 （C， C-15）， 45.9 （CH， C-12）， 42.3 （CH2， C-7）， 40.2 （C， C-6）， 32.7 （CH3， C-20）， 29.2 （CH3， C-19）， 23.5 （CH， C-11）， 22.4 （CH3， C-17）， 21.5 （CH， C-9）， 20.3 （CH2， C-8）， 18.4 （C， C-10）， 17.9 （CH3， C-18）， 13.6 （CH3， C-16）。經(jīng)鑒定化合物4為Jatrophodione A（Xu et al.，2011）。

化合物5 無色膠狀物，ESI-MS m/z： 359.3 [M+H]+，分子式 C22H30O4。1H-NMR （500 MHz， CDCl3） δ 7.35 （1H， br s， H-1）， 2.90 （1H， d， J = 12.5 Hz， H-5）， 2.79 （1H， d， J = 12.5 Hz， H-4）， 2.50 （1H， m， H-13）， 2.29 （2H， m， H-7）， 2.24 （3H， s， OAc）， 1.90 （1H， s， H-16）， 1.75 （1H， m， H-12）， 1.73 （1H， m， H-8）， 1.41 （3H， s， H-17）， 1.19 （2H， m， H-7）， 1.08 （1H， m， H-12）， 1.02 （3H， d， J = 7.0 Hz， H-20）， 1.00 （3H， s， H-18）， 0.98 （1H， m， H-8）， 0.87 （3H， s， H-19）， 0.52 （1H， m， H-11）， 0.11 （1H， m， H-9）。13C-NMR （125 MHz， CDCl3） δ 204.9 （C， C-3）， 150.6 （CH， C-1）， 150.2 （C， C-14）， 145.2 （C， C-2）， 125.9 （C， C-15）， 65.7 （CH， C-5）， 61.1 （C， C-6）， 45.1 （CH， C-4）， 40.8 （CH2， C-7）， 39.5 （CH， C-13）， 29.0 （CH3， C-18）， 33.2 （CH2， C-12）， 32.1 （CH， C-9）， 28.6 （CH3， C-17）， 22.6 （CH3， OAc）， 21.6 （CH2， C-8）， 21.1 （CH， C-11）， 20.7 （C， C-10）， 19.6 （CH3， C-20）， 19.3 （CH3， C-19）， 12.1 （CH3， C-16）。經(jīng)鑒定化合物5為14-O-acetyl-5，6-epoxy-（14E）-jatrogrossidentadion（Ravindranath et al.，2004）。

化合物6 無色膠狀物，ESI-MS m/z： 329.2 [M+H]+，分子式C20H24O4。1H-NMR （500 MHz， CDCl3） δ 6.44 （1H， d， J = 16.0 Hz， H-9）， 5.98 （1H， d， J = 16.0 Hz， H-8）， 5.82 （1H， m， H-3）， 5.72 （1H， m， H-5）， 2.85 （2H， d， J = 15.0 Hz， H-11）， 2.41 （2H， d， J = 15.0 Hz， H-11）， 2.33 （1H， d， J = 15.0 Hz， H-1）， 1.99 （1H， d， J = 14.0 Hz， H-1）， 1.85 （3H， s， H-17）， 1.70 （3H， s， H-20）， 1.39 （3H， s， H-16）， 1.32 （3H， s， H-19）， 1.21 （3H， s， H-18）。13C-NMR （125 MHz， CDCl3） δC 207.0 （C， C-14）， 202.2 （C，C-7）， 185.2 （C， C-12）， 162.9 （CH， C-9）， 146.8 （CH， C-5）， 146.4 （C， C-6）， 143.4 （C， C-4）， 130.6 （CH， C-8）， 126.4 （CH， C-3）， 115.1 （C， C-13）， 100.4 （C， C-15）， 81.2 （C， C-2）， 50.1 （CH2， C-1）， 44.0 （CH2， C-11）， 39.6 （C， C-10）， 32.9 （CH3， C-18）， 31.5 （CH3， C-19）， 26.4 （CH3， C-16）， 21.8 （CH3， C-17）， 10.3 （CH3， C-20）。經(jīng)鑒定化合物6為2-Hydroxy jatrophone（Lenfeld & Motl，1986）。

3 活性測試

使用熒光偏振技術(shù)對麻瘋樹中分離鑒定的6個二萜化合物進行PKCβ抑制活性篩選，將PKCβ酶16 pg·μL-1、ATP 20 μmol、PKC底物200 μmol，與不同濃度的化合物（4、8、16、32、64、128 μmol·L-1）混合，反應(yīng)90 min后，與等體積反應(yīng)終止液混合孵育60 min，使用483 nm激發(fā)光和536 nm發(fā)射光檢測mp值。結(jié)果顯示，化合物2對PKCβ具有一定的抑制作用（圖2和圖3），進一步測定其IC50值約為128 μmol·L-1，其余化合物均不顯示抑制活性。

4 討論與結(jié)論

目前從麻瘋樹植物中已分離得到二萜、三萜、黃酮等多種活性成分，尤其是具有抗腫瘤活性的二萜引起人們的高度關(guān)注（Devappa et al.，2011）。對該植物中二萜類活性成分的深入研究，不僅對于開發(fā)天然來源的抗腫瘤藥物具有重大價值，而且對于開發(fā)高效低毒的藥物具有重要的指導(dǎo)意義。由于麻瘋樹種子中的二萜所具有的極性和分子量都極其相近，常規(guī)的分離純化手段很難達到理想的分離效果，對該類成分的研究提出了一定的挑戰(zhàn)。

在本研究中，我們主要運用HPLC-DAD對分離的目標化合物進行分析追蹤，并且運用制備液相對目標化合物進行定向分離純化，從而達到預(yù)期目標。根據(jù)以上方法，我們對麻瘋樹種子的二萜類化學(xué)成分進行了初步研究，從麻瘋樹種子乙醇提取物的乙酸乙酯部位中共分離得到6個二萜類化合物，分別屬于松香烷型、羅漢松烷型、假白欖酮和瑞香烷型二萜，但未發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)報道的巴豆烷型二萜和二萜與長鏈脂肪酸成酯類化合物（Roach et al.，2012;Li et al.，2016）。這可能是選擇的研究部位為乙酸乙酯部位，而佛波醇酯不在該極性段，具體的原因需要進一步分析研究。多種二萜結(jié)構(gòu)類型的發(fā)現(xiàn)說明麻瘋樹中可能具有多種二萜成分的生物合成途徑。簡單推測二萜生物合成途徑可以發(fā)現(xiàn)，這些二萜類化合物可以由焦磷酸香葉基香葉酯（GGPP）衍生而來。其中，假白欖酮和瑞香烷型二萜是由GGPP衍生成前體casbane烷型二萜再進一步環(huán)合而成。但是前體化合物在本植物中的含量較低，在本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)casbane烷型二萜。因此，在今后的研究中，可以根據(jù)推測的生物合成途徑，進一步關(guān)注和發(fā)現(xiàn)更多來源于麻瘋樹并通過casbane烷型二萜衍生而成的二萜成分。

此外，PKC是存在于細胞漿內(nèi)由鈣激活的磷脂依賴性絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，可以催化蛋白質(zhì)分子的絲氨酸、蘇氨酸發(fā)生磷酸化，從而影響細胞生長、增殖和分化。PKC的活化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的聯(lián)系，普遍認為通過抑制PKC活性可以抑制腫瘤細胞，從而發(fā)揮抗腫瘤作用（Koivunen et al.，2006;Wu et al.，2016）。因此，為了進一步研究化合物的生物活性，本研究通過建立的PKCβ抑制劑高通量篩選模型對鑒定的化合物進行PKCβ抑制活性篩選。結(jié)果顯示化合物2對PKCβ具有一定的抑制作用，進一步驗證和說明了松香烷型二萜樹脂酸（如松香酸、脫氫松香酸等）具有抗腫瘤活性的可能作用機制（楊念云等，2016），并為麻瘋樹中二萜與抗腫瘤活性研究提供線索。但是具體的作用機制還有待通過細胞或者動物實驗進行驗證。

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（責(zé)任編輯 何永艷）