超聲波-雙水相提取青果黃酮及其抗氧化性研究

熊庭雨，侯小勤，阮尚全，2*

(1.內(nèi)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川 內(nèi)江 641199；2.四川省高等學(xué)校果類(lèi)廢棄物資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 內(nèi)江 641199)

0 引言

【研究意義】青果果實(shí)富含黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)、三萜類(lèi)、揮發(fā)性芳香物、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種物質(zhì)，兼有食用和藥用價(jià)值[1-2]，其中黃酮化合物具有抗氧化性、抗皺抗衰、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、降血壓等功效，在食品加工、生物制藥等方面都有極其重要的作用[3-5]。四川合江青果已有1 000余年的種植歷史，主要為橄欖科橄欖屬白欖種，常年產(chǎn)量超過(guò)600萬(wàn)kg，占四川青果產(chǎn)量的95%以上，具有一定的藥用價(jià)值。開(kāi)展青果黃酮提取方式的研究，對(duì)擴(kuò)大青果活性物質(zhì)在食品加工、生物制藥等方面的開(kāi)發(fā)利用具有現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】黃酮化合物提取技術(shù)主要有傳統(tǒng)溶劑提取法、超聲波輔助法、真空氣流細(xì)胞破壁法、酶法、溶劑氣浮分離技術(shù)、微波輔助萃取法、水熱法提取等[6-13]。國(guó)內(nèi)對(duì)青果總黃酮的提取方式主要是采用傳統(tǒng)水提法、溶劑提取法、酶法、真空氣流細(xì)胞破壁法等，而傳統(tǒng)水提法提取率比較低，成本較高，且部分是有毒有害溶劑；酶法提取雖然提取率較高，但酶易失去活性，微波時(shí)間雖較短，但易破壞分子結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生對(duì)人體有害的物質(zhì)[14]?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，鮮見(jiàn)超聲波-雙水相法提取合江青果黃酮的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用超聲波-雙水相技術(shù)提取合江青果的黃酮[15]，發(fā)揮其超聲波的機(jī)械振動(dòng)、空化作用以及硫酸銨作用條件較溫和、分相時(shí)間短、易分相、有機(jī)溶劑殘留少、選擇性較好等優(yōu)點(diǎn)，利用響應(yīng)曲面優(yōu)化建立提取黃酮的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并?duì)提取物進(jìn)行定性鑒定和抗氧化性試驗(yàn)，以期為合江青果的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和新的試驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 青果 青果采自四川合江某青果生產(chǎn)基地，取果肉于50℃干燥箱中烘干，粉碎后過(guò)50目篩，裝袋密封備用。

1.1.2 試劑 蘆丁、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、三氯化鋁、亞硝酸鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、二苯代苦味?；诫碌仍噭?，均為分析純，成都科龍化工試劑廠；RO膜過(guò)濾水，等。

1.1.3 儀器 BSA224S電子天平(賽多利斯上海公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，超聲波清洗儀(江蘇昆山)，TDL-5-A型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 將20.0 mg蘆丁配制成濃度為400 μg/mL的溶液，分別吸取0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL和6.00 mL置于25 mL比色管中，參照文獻(xiàn)[16]的方法處理并測(cè)定吸光度，得到吸光度(A)與濃度(C)的一元線性回歸方程：

A=0.012 28C+0.042 68(R2=0.999 9)

1.2.2 分相鹽的篩選 精確稱(chēng)取2份青果粉各1.000 g，各加入60%乙醇溶液30 mL，然后分別加入7 g硫酸銨或5 g磷酸氫二鉀，混勻靜置10 min，在超聲波功率為280 W、溫度為60 ℃下提取60 min，在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min下趁熱離心分離10 min，用30%乙醇將離心液定容于50 mL容量瓶中，精確量取0.50 mL于比色管中，參照1.2.1步驟進(jìn)行顯色測(cè)定，計(jì)算青果黃酮提取率，比較2種分相鹽的提取效果。

1.2.3 黃酮的提取及測(cè)定 精確稱(chēng)取1.000 g 青果粉放入50 mL提取瓶，加一定體積和濃度的乙醇，再加入分相鹽混勻，靜置10 min，按照一定功率、溫度下超聲提取一定時(shí)間，然后4 000 r/min轉(zhuǎn)速下趁熱分離10 min，取上層提取液用30%乙醇定容于50 mL容量瓶中，精確量取0.50 mL于比色管中，參照1.2.1步驟測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率的流程進(jìn)行單因素提取試驗(yàn)，分別考察乙醇濃度、液料比(mL∶g)、硫酸銨用量、提取時(shí)間、超聲波功率和提取溫度等因素對(duì)黃酮提取率的影響。其中，以7 g/30mL硫酸銨、60%乙醇溶液、超聲波功率280 W、溫度60℃、時(shí)間60 min和液料比30∶1為固定水平，根據(jù)各測(cè)定指標(biāo)的變化試驗(yàn)條件相應(yīng)因素作變換后進(jìn)行提取。

1) 乙醇濃度。設(shè)置乙醇濃度為50%、60%、70%、80%和90%。

2) 液料比(mL∶g)。分別設(shè)定為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1。

3) 硫酸銨用量。分別設(shè)定為4 g/30mL、5 g/30mL、6 g/30mL、7 g/30mL、8 g/30mL和9 g/30mL。

4) 提取時(shí)間。分別設(shè)定為20 min、40 min、60 min、80 min和100 min。

5) 超聲波功率。分別設(shè)定為200 W、240 W、280 W、320 W和360 W。

6) 提取溫度。分別設(shè)定為30℃、40℃、50℃、60℃和70℃。

1.2.4 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝 以硫酸銨用量(A)/(g/30mL)、超聲波功率(B)/W、提取時(shí)間(C)/min為設(shè)計(jì)因素，其他條件為單因素試驗(yàn)最佳條件，黃酮提取率(Y)為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)(表1)。

表1 青果黃酮提取率的響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of the response surface design

1.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 選擇各因素最優(yōu)水平，在便于操作的試驗(yàn)條件下，按照1.2.3的步驟進(jìn)行5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與理論模型值比較，檢查試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹笇?dǎo)意義。

1.2.6 黃酮化合物的理化性質(zhì)測(cè)定

1) 定性鑒定試驗(yàn)。取黃酮提取液2 mL于試管中，參照文獻(xiàn)[17]的方法，分別滴加4%NaOH、10%Al(NO3)3、25%氨水溶液和飽和碳酸鈉溶液，觀察溶液顏色變化，初步鑒定黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)類(lèi)型。

2) 清除DPPH·試驗(yàn)。分別取0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.40 mg/L、0.60 mg/L、0.80 mg/L、1.00 mg/L、1.20 mg/L和1.40 mg/L黃酮提取溶液于比色管中，加入濃度為20 mmol/L的DPPH溶液，用95%的乙醇定容至4 mL，搖勻，避光靜置30 min。參照文獻(xiàn)[18]方法測(cè)提取液吸光度(Ai)，用相同方法以等體積95%乙醇溶液替代DPPH測(cè)定不加PDDH提取液的吸光度(Aj)，用等體積超純水替代黃酮溶液測(cè)定空白對(duì)照吸光度(Ac)，考查提取液清除DPPH·的能力[19]。同時(shí)，用等濃度的蘆丁、VC溶液進(jìn)行比較試驗(yàn)，考查其清除能力的強(qiáng)弱。

清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用Origin 7.5對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖，用Design-Expert 8.05進(jìn)行相應(yīng)曲面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分相鹽處理青果黃酮的提取率

經(jīng)測(cè)定，以硫酸銨和磷酸二氫鉀作分相鹽時(shí)黃酮的提取率分別為2.88%和1.63%，硫酸銨較磷酸二氫鉀作分相鹽時(shí)的黃酮提取率高76.69%。此時(shí)試驗(yàn)廢渣中硫酸銨與磷酸氫二鉀均有剩余，表明，2種鹽溶解已達(dá)到飽和狀態(tài)。觀察發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)中硫酸銨分相好，而磷酸氫二鉀分相界面不清晰；同時(shí)，硫酸銨價(jià)格相對(duì)磷酸氫二鉀便宜，環(huán)境污染小，因此，后續(xù)試驗(yàn)選取硫酸銨作為分相鹽。

2.2 不同提取因素處理青果黃酮的提取率

從圖1看出，不同提取因素對(duì)青果黃酮提取率的影響存在差異。

圖1 不同提取因素處理青果黃酮的提取率

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，黃酮提取率呈先升后降趨勢(shì)；各處理青果黃酮的提取率為2.51%～3.13%，其中，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)黃酮提取率為最大值，60%時(shí)其次，50%時(shí)最低，依次為70%>60%>80%>90%>50%。乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)黃酮提取率最大，其原因可能是：黃酮類(lèi)化合物與乙醇均具有一定極性，根據(jù)相似相溶原理，70%的醇水體系能更好地相溶；同時(shí)乙醇濃度增大也增大其他脂溶性成分的溶解能力，當(dāng)超過(guò)70%時(shí)，可能減小青果黃酮的溶解優(yōu)勢(shì)，致使其提取效果下降[20]。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)以70%為最佳，后續(xù)試驗(yàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2.2 硫酸銨用量 黃酮提取率隨硫酸銨用量增多呈先增后降趨勢(shì)；各處理青果黃酮的提取率為3.16%～3.44%，其中，當(dāng)硫酸銨用量達(dá)6 g/30mL時(shí)，黃酮提取率為最大值，7 g/30mL時(shí)其次，9 g/30mL時(shí)最低；依次為6 g/30mL>7 g/30mL>5 g/30mL>4 g/30mL>8 g/30mL>9 g/30mL。硫酸銨用量達(dá)6 g/30mL時(shí)黃酮提取率最大，其原因可能是：體系中硫酸銨與乙醇奪取水分子，因此當(dāng)硫酸銨用量增多時(shí)，水分子從乙醇相中逐漸脫離，改變體系的極性，使得黃酮分子在醇層富集，提取率逐漸升高，但水分子分離時(shí)，可能導(dǎo)致一部分黃酮類(lèi)化合物隨之流失，不利于黃酮的提取[21]。由于硫酸銨用量在6 g/30mL時(shí)分相界面清晰且溶解達(dá)到飽和，因此硫酸銨最佳用量為6 g/30mL。后續(xù)試驗(yàn)硫酸銨用量為5 g/30mL、6 g/30mL和7 g/30mL。

2.2.3 液料比 隨著液料比增加青果黃酮提取率呈先升后降趨勢(shì)；各處理青果黃酮提取率為2.83%～3.16%，其中，液料比為35∶1時(shí)黃酮提取率最大，30∶1時(shí)其次，20∶1時(shí)最低；依次為35∶1>30∶1>40∶1>25∶1>20∶1。液料比為35∶1時(shí)黃酮提取率最大，其原因可能是：當(dāng)提取液增多時(shí)，青果粉末與溶液接觸面積增大，使反應(yīng)更加容易，促進(jìn)黃酮的提取。當(dāng)液料比超過(guò)35 ∶1時(shí)，因硫酸銨溶解量不同而影響體系的分相結(jié)果，并且提取液增加可能使其他成分溶出，從而導(dǎo)致黃酮提取率下降。因此，液料比以35∶1最佳，后續(xù)試驗(yàn)液料比為35∶1。

2.2.4 超聲波功率 隨著超聲波功率增加黃酮提取率呈先降后升再降趨勢(shì)；各處理青果黃酮提取率為2.96%～3.34%，其中，超聲波功率為280 W時(shí)黃酮提取率最大，240 W時(shí)其次，200 W時(shí)最低；依次為280 W>240 W>320 W>360 W>200 W。在超聲波功率為280 W時(shí)提取率最大，其原因可能是：功率加大能量越高，利于解除其他成分對(duì)黃酮分子的羈絆，同時(shí)也使得黃酮分子越活潑，運(yùn)動(dòng)加快，提高提取率[22]；但功率過(guò)高一定程度上也破壞黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)，致使黃酮的提取效果下降。因此，超聲波功率最佳為280 W，后續(xù)試驗(yàn)超聲波功率為240 W、280 W和320 W。

2.2.5 提取時(shí)間 隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)黃酮提取率呈先升后降趨勢(shì)；各處理青果黃酮的提取率為2.87%～3.45%，其中，提取時(shí)間為80 min時(shí)黃酮提取率最大，60 min時(shí)其次，100 min時(shí)最低；依次為80 min>60 min>20 min>40 min>100 min。提取時(shí)間為80 min時(shí)黃酮提取率最大，其原因可能是隨提取時(shí)間越久，對(duì)青果細(xì)胞壁作用越徹底，黃酮溶出越完全，使得產(chǎn)率增大，但當(dāng)黃酮提取完成后，黃酮的降解起主導(dǎo)作用，同時(shí)溶劑逸散也會(huì)增加，從而使得黃酮提取率降低[23]。因此以提取時(shí)間80 min最佳。后續(xù)試驗(yàn)提取時(shí)間為60 min、80 min和100 min。

2.2.6 提取溫度 隨著提取溫度升高，青果黃酮提取率呈先升后降趨勢(shì)；各處理青果黃酮的提取率為3.05%～3.18%，其中，提取溫度為60℃時(shí)黃酮提取率最大，70℃時(shí)其次，30℃時(shí)最低，依次為60℃>70℃>50℃>40℃>30℃。提取溫度為60℃時(shí)黃酮提取率最大，其原因可能是溫度增高，增加了黃酮分子的運(yùn)動(dòng)能量，更利于其突破相鄰分子的羈絆而快速脫離束縛，使提取率增大；但溫度過(guò)高則損壞一些黃酮的結(jié)構(gòu)，影響其溶解性[24]，同時(shí)，也加大其他雜質(zhì)分子的溶解活性導(dǎo)致黃酮提取率下降。因此，提取溫度以60℃最佳。

2.3 提取工藝優(yōu)化

2.3.1 優(yōu)化試驗(yàn) 從表2看出，17個(gè)處理青果黃酮提取率為3.17%～3.50%，其中，處理1、處理2、處理8、處理9和處理15試驗(yàn)條件相同，均為硫酸銨用量6 g/30mL、超聲波功率280 W、提取時(shí)間80 min，其青果黃酮提取率最高，為3.46%～3.50%；處理14和處理17其次，分別為3.42%和3.41%。各處理青果黃酮提取率依次為處理1>處理2>處理8=處理9=處理15>處理14>處理17>處理10>處理3>處理12=處理16>處理6>處理7>處理11>處理13>處理5>處理4。

表2 青果黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 曲面模型與方差分析 經(jīng)對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合得到青果黃酮提取率(Y)與提取因素硫酸銨用量(A)、超聲波功率(B)和提取時(shí)間(C)的回歸方程：

Y=3.47+0.047A+0.007 5B-0.010C-0.005AB+0.01AC-0.11BC-0.094A2-0.094B2-0.073C2

表3 響應(yīng)模型的方差分析結(jié)果 Table 3 Result of vaniance analysis in the responese surface model

2.3.3 響應(yīng)面因素間的交互作用 從圖2看出超聲波功率與硫酸銨用量、提取時(shí)間與超聲波功率、提取時(shí)間與硫酸銨用量相互作用對(duì)青果黃酮提取率作用的影響。

圖2 超聲波功率、硫酸銨用量及提取時(shí)間相互作用的青果黃酮提取率及其響應(yīng)面與等高線

1) 超聲波功率與硫酸銨用量。功率為272～288 W時(shí)黃酮提取率出現(xiàn)最大值；硫酸銨用量為5.5～6.5 g/30mL時(shí)出現(xiàn)最大值。當(dāng)超聲波功率一定時(shí)，隨著硫酸銨用量增多，黃酮提取率呈先增后減趨勢(shì)，等高線接近圓形；當(dāng)硫酸銨用量一定時(shí)，黃酮提取率趨勢(shì)一致，且坡度變化較為平緩。由此可知，超聲波功率與硫酸銨用量互相作用效果不顯著，與響應(yīng)模型的方差分析一致。

2) 提取時(shí)間與超聲波功率。黃酮提取率在時(shí)間為76～84 min時(shí)出現(xiàn)最大值，超聲波功率為272～288 W時(shí)出現(xiàn)最大值。在較低超聲波功率時(shí)，提取時(shí)間延長(zhǎng)，黃酮提取率呈先增再趨于平緩，在較高超聲波功率時(shí)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，黃酮提取率逐漸減少，等高線接近橢圓形。由此可知，提取時(shí)間與超聲波功率互相作用效果顯著，與響應(yīng)模型的方差分析一致。

3) 提取時(shí)間與硫酸銨用量。黃酮提取率在時(shí)間為76～84 min時(shí)出現(xiàn)最大值，硫酸銨用量為5.5～6.5 g/30mL時(shí)出現(xiàn)最大值。在一定時(shí)間里，當(dāng)硫酸銨用量逐漸增多時(shí)，青果黃酮提取率呈先增后減趨勢(shì)；在一定硫酸銨用量時(shí)，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，黃酮提取率呈先增后減趨勢(shì)，等高線接近圓形。由此得出，硫酸銨用量與時(shí)間互相作用效果不顯著，與響應(yīng)模型的方差分析一致。

2.4 方案驗(yàn)證

以其他條件為單因素最佳條件，在硫酸銨用量6 g/30mL、超聲波功率280 W、時(shí)間77 min時(shí)進(jìn)行5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果表明，黃酮提取率平均為3.404%，與此條件下的理論響應(yīng)值3.472%相比，相對(duì)誤差為1.95%，說(shuō)明模型擬合較好，可用于指導(dǎo)實(shí)際操作。

2.5 黃酮化合物的理化性質(zhì)

2.5.1 定性鑒定 取黃酮提取液加入NaOH后溶液呈橙色，一段時(shí)間后變?yōu)榧t色，表明提取液含有二氫黃酮醇類(lèi)化合物；加入Al(NO3)3時(shí)溶液變?yōu)辄S色，表明含鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)；加入氨水時(shí)溶液變?yōu)樽攸S色，表明含各類(lèi)黃酮類(lèi)化合物；加入飽和碳酸鈉時(shí)溶液變?yōu)槌壬?，一段時(shí)間后變?yōu)榧t色，表明含二氫黃酮醇類(lèi)化合物，試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[17]一致。

2.5.2 黃酮提取物對(duì)DPPH·的清除效果 從圖4看出，在相同濃度條件下，青果黃酮清除DPPH·作用顯著優(yōu)于VC和蘆丁。當(dāng)處理濃度達(dá)1.0 μg/mL時(shí)，青果黃酮對(duì)DPPH·的清除率達(dá)88.04%，之后清除率基本保持不變，蘆丁與VC濃度增大時(shí)，清除自由基能力也不斷升高，但均明顯低于青果黃酮。由此可得，青果黃酮對(duì)DPPH·有很好的清除效果，抗氧化能力較強(qiáng)。

圖3 不同物質(zhì)對(duì)DPPH·的清除率

3 討論

研究利用超聲波-雙水相提取技術(shù)提取青果中的總黃酮，提取方法更為多樣性與溫和性，避免了只利用超聲波方法的單一性，也可防止酶法中溫度過(guò)高對(duì)部分有效成分產(chǎn)生分解與酶失活現(xiàn)象。田應(yīng)娟等[25]采用超聲強(qiáng)化提取橄欖黃酮類(lèi)物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，在提取溫度60℃，超聲波功率350 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間60 min，液料比40 mL/g的最佳提取條件下，總黃酮提取率為2.30%。阮尚全等[26]采用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化酶法提取青果黃酮發(fā)現(xiàn)，在最佳提取條件[酶用量為15 U/mL，提取時(shí)間85 min，提取溫度60℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶30 (g/mL)]下，青果黃酮提取率為3.14%。而在經(jīng)該研究?jī)?yōu)化的提取條件下，青果黃酮提取率為3.304%，較之超聲波提取法[25]和酶法[26]等，該方法的黃酮提取率最較高，更有利于黃酮的提取。采用超聲波-雙水相提取青果黃酮，可為合江青果的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)和新的試驗(yàn)方法。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，超聲波和雙水相技術(shù)結(jié)合提取合江青果黃酮，縮短了提取時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了提取與純化的同步進(jìn)行。利用Box-Behnken設(shè)計(jì)得到提取的理論模型，在超聲功率為280 W、硫酸銨用量為6 g/30mL、提取時(shí)間為77 min、液料比(mL∶g)為35︰1、溫度為60℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，青果黃酮提取率為3.404%，與理論模型值3.472%的相對(duì)誤差為1.95%；提取液中黃酮類(lèi)成分定性鑒定現(xiàn)象明顯，且提取物對(duì)DPPH·的清除存在量效關(guān)系，清除能力強(qiáng)于蘆丁、VC，黃酮物質(zhì)清除DPPH·效果較好。