施麗 公方強(qiáng) 莫毅 牛向麗

【摘要】 目的 比較人未成熟卵母細(xì)胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）前后玻璃化冷凍對(duì)卵母細(xì)胞的影響。

方法 318枚人生發(fā)泡期（germinal vesicle，GV）卵母細(xì)胞來(lái)自100名不孕癥患者，將患者隨機(jī)分為A、B兩組，每組50人。A組GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后解凍復(fù)蘇行IVM;B組GV期卵母細(xì)胞行IVM后玻璃化冷凍再解凍復(fù)蘇，比較兩組卵母細(xì)胞的解凍復(fù)蘇率、成熟率及24小時(shí)紡錘體出現(xiàn)率。

結(jié)果 兩組卵母細(xì)胞行IVM培養(yǎng)24小時(shí)及48小時(shí)成熟率比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇率、IVM培養(yǎng)24小時(shí)紡錘體形成率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

結(jié)論 未成熟卵母細(xì)胞IVM后再行玻璃化冷凍保存效果更佳。

【關(guān)鍵詞】 玻璃化冷凍;未成熟卵母細(xì)胞;體外成熟;成活率;成熟率

中圖分類號(hào)：R321-33 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.07.004

【Abstract】 Objective To compare the effect of vitrification of human immature oocytes before and after in vitro maturation （IVM）.

Methods A total of 318 human germinal vesicle （GV） human oocytes were collected from 100 infertile patients， and the patients were randomly divided into group A and group B， with 50 cases in each group. The oocytes in the GV stage of the group A were vitrified and thawed before IVM， and the oocytes in the GV stage of the group B were vitrified and thawed after IVM. And then， the thawing recovery rate， maturation rate and 24-hour spindle formation rate of oocytes in the two groups were compared.

Results The maturation rates of oocytes cultured in IVM at 24 h and 48 h were statistically different between the group A and the group B （P < 0.05）， while there was no statistically significant difference in the thawing recovery rate of oocytes and the spindle formation rate after ? 24 h IVM culture between the two groups （P > 0.05）.

Conclusion Vitrification of immature oocytes after IVM is more effective.

【Key words】 vitrification; immature oocytes; IVM; survival rate; maturing rate

隨著玻璃化冷凍技術(shù)在輔助生殖領(lǐng)域的應(yīng)用，成熟人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的成功率顯著增加[1～2]，玻璃化法已成為成熟卵母細(xì)胞冷凍保存的主要方法。國(guó)外學(xué)者研究證實(shí)未成熟卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)是有效的[3]，將未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟和玻璃化冷凍相結(jié)合已成為癌癥患者化療前保存生育力的一種選擇策略[4];同時(shí)，未成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存的成功將為卵子庫(kù)卵子的來(lái)源提供了新的途徑。理論上，保存未成熟卵母細(xì)胞有兩種可能的方法：未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟（in vitro maturation，IVM）后玻璃化冷凍保存和直接玻璃化冷凍未成熟卵母細(xì)胞[5]。學(xué)者們對(duì)于哪種方法冷凍保存未成熟卵母細(xì)胞后對(duì)卵母細(xì)胞的成熟及發(fā)育潛能影響較小尚存爭(zhēng)議。本研究旨在探討這兩種方法對(duì)人卵母細(xì)胞存活率、成熟率及發(fā)育潛能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年3月至2017年3月在廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（intracytoplasmic sperm injection， ICSI）的不孕癥患者丟棄的人生發(fā)泡期（germinal vesicle，GV）卵母細(xì)胞。納入標(biāo)準(zhǔn)：未成熟卵母細(xì)胞來(lái)自年齡小于35歲的患者，卵子形態(tài)正常，因男方因素行輔助生殖技術(shù)助孕，女方非全部卵子均不成熟。318枚GV期卵母細(xì)胞來(lái)自100名患者，將患者隨機(jī)分為兩組：A組50名患者，共142枚GV期卵母細(xì)胞，直接進(jìn)行玻璃化冷凍，解凍復(fù)蘇后行未成熟卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)至成熟即第二次減數(shù)分裂中期（metaphase Ⅱ， MⅡ）;B組50名患者，共176枚GV期卵母細(xì)胞，IVM培養(yǎng)至MⅡ期后再行玻璃化冷凍。該研究通過(guò)了廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查。

1.2 方法

1.2.1 未成熟卵母細(xì)胞的獲取

根據(jù)患者年齡或卵巢儲(chǔ)備功能選擇長(zhǎng)效方案控制性超促排卵。黃體中期使用注射用醋酸曲普瑞林（益普生，法國(guó)）垂體降調(diào)節(jié)，采用重組人促卵泡激素注射液（Merck Serono，瑞士）和注射用尿促性素控制性超排卵。根據(jù)B超監(jiān)測(cè)和血清雌二醇（estradiol， E2）水平適當(dāng)調(diào)整藥物劑量，當(dāng)2個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)18 mm時(shí)肌注人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin， HCG）6000～10 000 IU，36小時(shí)后取卵。卵冠丘復(fù)合物經(jīng)透明質(zhì)酸酶（SAGE，美國(guó)）處理脫掉大部分顆粒細(xì)胞后，在倒置顯微鏡下判斷卵母細(xì)胞的成熟情況，MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)入正常ICSI周期，318枚GV期卵母細(xì)胞用于本研究。

1.2.2 卵母細(xì)胞冷凍方法

玻璃化冷凍試劑盒（KITAZATO，日本）由平衡液（equilibration solution， ES）和玻璃化溶液（vitrification solution， VS）組成，使用前在室溫下平衡30分鐘。做每液滴20微升ES滴3滴（ES1、ES2、ES3）及20微升含20%血清蛋白替代品（SAGE，美國(guó)）的緩沖輸卵管液培養(yǎng)液1023（SAGE，美國(guó)）液滴1滴備用。漂洗去油后的卵母細(xì)胞首先移至備好的緩沖輸卵管液培養(yǎng)液1023液滴。1分鐘后將1023液滴與ES1連線，計(jì)時(shí)2分鐘;在1023與ES1連線的中點(diǎn)與ES2 再次連線，計(jì)時(shí)2分鐘，最后將卵母細(xì)胞移至ES3液滴放置。5分鐘后將卵母細(xì)胞從ES3中移至冷凍試劑盒的玻璃化溶液（VS）液滴中，準(zhǔn)備裝載，在VS液中的總時(shí)間需大于90秒但小于120秒，每根載桿裝載不多于3枚卵母細(xì)胞，裝載后將載桿投入液氮中。

1.2.3 卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇方法

玻璃化解凍液（KITAZATO，日本）由解凍液（thawing solution，TS）、稀釋液（dilute solution，DS）和洗液1（washing solution-1，WS-1）及WS-2四部分組成。TS液使用前放入培養(yǎng)箱（不通CO2）中預(yù)熱1小時(shí)，DS、WS-1、WS-2液室溫下平衡1小時(shí)。從液氮中取出載桿，將裝有卵母細(xì)胞的載桿前端快速浸入TS中，把卵母細(xì)胞從載桿上洗脫，此過(guò)程不超過(guò)1分鐘。然后，將卵母細(xì)胞迅速移至DS中3分鐘，讓卵母細(xì)胞自然下沉，再將其轉(zhuǎn)移至WS-1中5分鐘，后將卵母細(xì)胞移至WS-2中5分鐘后，將形態(tài)完全恢復(fù)的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中。A組GV期卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng);B組MⅡ期卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入授精輸卵管液培養(yǎng)基（SAGE，美國(guó)）中培養(yǎng)。

1.2.4 IVM、紡錘體觀察

未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)采用IVM MEDIA KIT試劑盒（SAGE，美國(guó)），按照說(shuō)明添加促卵泡生成素（follicle stimulating hormone， FSH）和黃體生成素（luteinizing hormone， LH）至終濃度75 mIU/mL。未成熟卵母細(xì)胞在IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24、48小時(shí)分別評(píng)估卵母細(xì)胞成熟情況，出現(xiàn)第一極體則判斷為MⅡ期，超過(guò)48小時(shí)沒(méi)有發(fā)育至MⅡ期的卵母細(xì)胞視為IVM失敗。A組卵母細(xì)胞玻璃化冷凍復(fù)蘇后在IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)，用偏振光顯微鏡觀察MⅡ期卵母細(xì)胞的紡錘體;B組卵母細(xì)胞在IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)后先用偏振光顯微鏡觀察MⅡ期卵母細(xì)胞的紡錘體，IVM培養(yǎng)液培養(yǎng)至48小時(shí)后玻璃化冷凍MⅡ期卵母細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將所有卵母細(xì)胞廢棄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié) ?果

兩組GV期卵母細(xì)胞來(lái)源患者的年齡、BMI、竇卵泡數(shù)（AFC）、不孕年限及基礎(chǔ)FSH比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

本研究共318枚GV期卵母細(xì)胞，其中A組142枚，B組176枚。A組142枚GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍解凍復(fù)蘇后有114枚存活。A、B兩組卵母細(xì)胞行體外成熟培養(yǎng)24小時(shí)及48小時(shí)成熟率（50.00%和63.07%，P=0.028;74.56%和86.36%，P=0.011）比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組玻璃化冷凍后卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇存活率（80.28%和84.87%，P=0.299）比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組體外成熟卵母細(xì)胞24小時(shí)紡錘體形成率（78.95%和80.18%，P=0.851）比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

3 討 ?論

未成熟卵母細(xì)胞包括生發(fā)泡期卵母細(xì)胞和第一次減數(shù)分裂中期（metaphase Ⅰ， MⅠ）卵母細(xì)胞兩大類，GV期卵母細(xì)胞的典型特征是含有1個(gè)巨大的生發(fā)泡，卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)中有兩層大的細(xì)胞膜，即細(xì)胞膜和生發(fā)泡膜。在進(jìn)行冷凍及復(fù)蘇過(guò)程中，兩層膜對(duì)滲透壓的變化有著較強(qiáng)的緩沖作用，且相對(duì)于成熟卵母細(xì)胞，GV期卵母細(xì)胞處于減數(shù)分裂的雙線期，尚未形成紡錘體，且紡錘體對(duì)溫度變化特別敏感，玻璃化冷凍容易導(dǎo)致成熟卵母細(xì)胞紡錘體損傷[6]，因此，理論上凍存GV期卵母細(xì)胞似乎是更好的選擇。

本研究結(jié)果顯示未成熟人卵母細(xì)胞在GV階段和IVM培養(yǎng)后MⅡ階段玻璃化冷凍復(fù)蘇存活率無(wú)顯著差異，這與FASANO[7]及HUANG[8]的研究結(jié)果一致。然而，與IVM后玻璃化冷凍組相比，卵母細(xì)胞在GV階段玻璃化后再IVM的卵母細(xì)胞成熟率顯著降低，與相關(guān)研究結(jié)果一致[9～10]。表明雖然兩種方法都能較好地保存卵母細(xì)胞的成活率，但結(jié)果提示未成熟期玻璃化冷凍降低了卵母細(xì)胞的成熟潛能[10]。未成熟卵母細(xì)胞在體外成熟前玻璃化的低成熟率可以通過(guò)觀察其超微結(jié)構(gòu)的變化（如微絨毛層的減少、空泡化、線粒體囊泡復(fù)核物的增加和線粒體畫面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集體的改變）和應(yīng)激及凋亡相關(guān)基因表達(dá)譜的增加來(lái)解釋[11]。而MOLINA等[12]的研究結(jié)果則顯示IVM前先玻璃化冷凍組卵母細(xì)胞成熟率高于先IVM后玻璃化組，該研究認(rèn)為玻璃化冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜的滲透作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子的瞬時(shí)升高，從而促進(jìn)未成熟人卵母細(xì)胞體外成熟。DADDANGADIA等[13]的研究顯示在小鼠青春期前卵母細(xì)胞中，生發(fā)期玻璃化冷凍優(yōu)于MⅡ期玻璃化冷凍，這一結(jié)果是否存在于青春期前人卵母細(xì)胞還需進(jìn)一步研究。而最新一項(xiàng)研究則顯示無(wú)論未成熟卵母細(xì)胞是在IVM之前還是IVM之后進(jìn)行冷凍保存，玻璃化冷凍存活率、成熟率都相當(dāng)[14]。

在冷凍過(guò)程中，卵母細(xì)胞暴露于冷凍保護(hù)劑，紡錘體結(jié)構(gòu)可能會(huì)保留，但在解凍過(guò)程中，紡錘體結(jié)構(gòu)完全喪失[15～16]。然而，進(jìn)一步的研究表明紡錘體在冷凍保存后有重新組裝的恢復(fù)能力[17～18]。偏振光顯微鏡的應(yīng)用可無(wú)創(chuàng)地觀察成熟卵母細(xì)胞的紡錘體。國(guó)內(nèi)學(xué)者呂愛香[19]的研究顯示在無(wú)卵丘細(xì)胞包裹的未成熟卵母細(xì)胞中，先IVM后冷凍對(duì)卵母細(xì)胞紡錘體的損傷較先冷凍再IVM要小。GARCIA-ORO[20]和MAHFOUDH [21]的研究表明觀察到紡錘體的卵母細(xì)胞正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、妊娠率均顯著高于未觀察到紡錘體的卵母細(xì)胞。SHEN等[22]研究認(rèn)為紡錘體可作為選擇新鮮人卵母細(xì)胞胚胎移植的重要指標(biāo)，因?yàn)樗鼈兡芊从撑咛グl(fā)育潛能。因此，紡錘體可視化是預(yù)測(cè)更好的受精潛力、胚胎發(fā)育和臨床結(jié)果的重要工具[23]。VERSIEREN等[24]研究同樣也說(shuō)明冷凍保存的GV期卵母細(xì)胞在變暖后顯示出減少和延遲成熟，但激活潛力不受影響。我們的研究結(jié)果顯示，在IVM前后玻璃化冷凍的未成熟卵母細(xì)胞體外成熟后24小時(shí)的紡錘體出現(xiàn)率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此，我們推斷兩組卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能無(wú)差異。但需要強(qiáng)調(diào)的是，我們的研究?jī)H從紡錘體的形態(tài)學(xué)上推斷卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，對(duì)于卵母細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)上是否存在異常我們無(wú)法推斷，需要進(jìn)一步大樣本的卵母細(xì)胞的染色體檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究表明就解凍復(fù)蘇存活率而言，兩種處理方法效果相同。然而未成熟期玻璃化冷凍降低了卵母細(xì)胞的成熟潛能，IVM培養(yǎng)后再行玻璃化冷凍的方法可能更適合未成熟卵母細(xì)胞的冷凍保存。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-04-17 修回日期：2021-06-22）

（編輯：潘明志）