蒙藥斯日西散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

敖登其木格 王海榮 烏漢其木格 錫林其其格 特格喜白音 阿拉騰其木格

摘要 目的：建立蒙藥斯日西散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：用顯微和薄層色譜法對(duì)斯日西散中的大黃、土木香、寒水石、山柰、木鱉子、石榴、黑冰片進(jìn)行顯微鑒別，對(duì)大黃、山柰、土木香進(jìn)行薄層色譜鑒別;用高效液相色譜法測(cè)定大黃中大黃素的含量。結(jié)果：斯日西散顯微鑒別特征圖片清晰，薄層鑒別在大黃、山柰、土木香對(duì)照品斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)的位置具有相同顏色的清晰斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。大黃素在0.001 7～0.135 2 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好（r=0.999 8），平均回收率為102.15%，平均含量為0.105 5 mg/g。結(jié)論：該方法全面、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，為斯日西散質(zhì)量控制提供可靠標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞 斯日西散;顯微鑒別;薄層鑒別;高效液相色譜

Abstract Objective：To improve the quality standard of Mongolian medicine sirixi.Methods：Microscopic and TLC identification method was used to distinguish Radix et Rhizoma Rhei，Radix Inulae，Han Shuishi，Rhizoma Kaempferiae，Semen Momordicae，Shiliu，Hei Bingpian in Mongolian medicine sirixi for microscopy and thin layer chromatography.Emodin in Rad ix et Rhizoma Rhei was determined by High Performance Liquid Chromatography.Results：The microscopic identification feature pictures of Sirixis were clear，and the thin-layer identification had clear spots of the same color at the positions corresponding to the spots of Radix et Rhizoma Rhei，Radix Inulae，and Rhizoma Kaempferiae reference substances，negative and no interference.Emodin has a good linear relationship with the peak area in the range of 0.001 7 to 0.135 2 mg/mL （r=0.999 8），the average recovery rate was 102.15%，and the average content was 0.105 5 mg/g.Conclusion：The method can be used to distinguish Mongolian medicine sirixi for its quality control.

Keywords Mongolian medicine sirixi; Microscopic identification; TLC identification; High performance liquid chromatography

中圖分類號(hào)：R29;R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.005

蒙藥斯日西散是傳統(tǒng)蒙醫(yī)藥中的一個(gè)經(jīng)典藥物，有著上千年的歷史，該藥由訶子、木鱉子、五靈脂、堿面、石榴、黑冰片、寒水石、大黃、土木香、山柰等十味藥材組成，其功效主治為祛“寶日”病，“寶日”病，初、中期暖氣吞酸、胸背作痛，氣滯血瘀，血熱陷中，潛伏于臟等病癥。臨床主要用于胃腸積熱、食不消、返酸、腹脹、肝膽“希日”、便秘[1-2]。雖然斯日西散劑臨床應(yīng)用非常廣泛，但是至今沒有確切的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，故本研究中對(duì)斯日西散劑進(jìn)行顯微鑒別及薄層鑒別，并采用高效液相色譜法對(duì)大黃中大黃素的含量進(jìn)行控制，為建立斯日西散劑的質(zhì)量控制方法提供有效依據(jù)，以全面提升該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 電子天平（Sartorius，德國(guó)，型號(hào)：BT25S、BSA423S）;暗箱三用紫外線分析儀（上海嘉鵬科技，型號(hào)：ZF-7）;數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-500DE）;電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器，型號(hào)：DHG-9240A）;超純水儀（默克，德國(guó)，Milli-Q Advatage A10）倒置熒光顯微鏡（尼康株式會(huì)社，日本，型號(hào)：Ti-U）;高效液相色譜儀（Thermo，美國(guó)，型號(hào)：ultimate3000）。薄層板為0.25%硝酸銀溶液制備的自制硅膠G薄層板、預(yù)制硅膠H板（青島海洋化工廠分廠，型號(hào)：100 mm×200 mm）、預(yù)制硅膠GF254板（青島海洋化工廠，型號(hào)：100 mm×200 mm）;

1.2 試劑 甲醇（Fisher色譜溶劑，貨號(hào)：A452-4）、乙腈（Fisher色譜溶劑，貨號(hào)：A998-4）為色譜純，甲醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20160613）、鹽酸（北京化工廠，生產(chǎn)批號(hào)：20120818）、乙醚（天津市福晨化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20160601）、三氯甲烷（天津市福晨化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20160218）石油醚（天津市福晨化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20160601），甲酸（天津市福晨化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20160409）均為分析純?cè)噭?，水為離子交換高純水。

1.3 分析樣品 斯日西散（內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院制劑中心，生產(chǎn)批號(hào)：20170118、20150629、20170701）;斯日西散模擬樣品（實(shí)驗(yàn)室自制）;山柰對(duì)照藥材（生產(chǎn)批號(hào)：121504-201203）、對(duì)甲氧基桂皮酸乙酯對(duì)照品（生產(chǎn)批號(hào)：110835-201202）、大黃對(duì)照藥材（生產(chǎn)批號(hào)：120984-201202）、大黃酸對(duì)照品（生產(chǎn)批號(hào)：110757-200206）、大黃素對(duì)照品（生產(chǎn)批號(hào)：110756-201512）、土木香內(nèi)酯對(duì)照品（生產(chǎn)批號(hào)：110760-201209）、異土木香內(nèi)酯對(duì)照品（生產(chǎn)批號(hào)：110761-200204）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 依據(jù)2015版《中華人民共和國(guó)藥典》附錄中的顯微鑒別方法，采用粉末制片法。具體步驟如下，載玻片上滴加少量水合氯醛試液，再取少許斯日西散粉末攪拌均勻后酒精燈上微微加熱，見粉末顏色變淺、組織透明后滴加少量甘油，加蓋玻片，顯微鏡觀察。處方中具有專屬性、鏡檢率高的藥味顯微特征歸屬如下：1）石榴石細(xì)胞，呈類圓形或長(zhǎng)卵形;2）黑冰片，黑色、呈不規(guī)則碎塊狀;3）山柰淀粉粒，淀粉粒眾多，單粒類圓形或三角形，多數(shù)扁平，臍點(diǎn)、層紋不明顯;4）土木香，網(wǎng)狀導(dǎo)管直徑30～100 μm;5）大黃草酸鈣簇晶，草酸鈣簇晶大，直徑20～160 μm;6）寒水石晶體團(tuán)塊不規(guī)則形，大小不等，近透明;7）木鱉子子葉薄壁細(xì)胞，子葉薄壁細(xì)胞多角形，內(nèi)含脂肪油滴及糊粒粉。見圖1。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 斯日西散中大黃的薄層鑒別 稱取1 g斯日西散，加20 mL甲醇溶液浸泡1 h后濾過，取5 mL濾液蒸干，加10 mL水溶解殘?jiān)?，再? mL鹽酸溶液，加熱回流30 min后立即冷卻，20 mL乙醚提取兩次，合并乙醚提取液，蒸干，加1 mL三氯甲烷溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液。另取大黃對(duì)照藥材0.1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方比例折算，相同工藝制備的模擬樣品與陰性對(duì)照（缺大黃）各1 g，用相同方法制備模擬樣品溶液以及陰性對(duì)照溶液。以大黃對(duì)照藥材和大黃酸對(duì)照品為對(duì)照進(jìn)行薄層色譜法（通則0502）實(shí)驗(yàn)，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，紫外光燈（365 nm）和日光下分別檢視。結(jié)果顯示大黃薄層鑒別分離效果好，被檢成分斑點(diǎn)清晰，斯日西散色譜中在與大黃酸對(duì)照品相應(yīng)的位置（Rf值0.48）上顯橙黃色的熒光斑點(diǎn)，并且在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同的5個(gè)橙黃色熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照（缺大黃）色譜中在相應(yīng)的位置上未出現(xiàn)相同的熒光斑點(diǎn)，表明處方中其他組分對(duì)大黃鑒別無(wú)干擾，具有專屬性。見圖2。3批供試品和模擬樣品薄層色譜結(jié)果見圖3。

2.2.2 斯日西散中山柰的薄層鑒別 取本品內(nèi)容物3 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，濾過，過濾作為供試品溶液。另取對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方比例折算，分別取相同工藝制備的模擬樣品與陰性對(duì)照（缺山柰）各3 g，同法制備模擬樣品溶液以及陰性對(duì)照溶液。另取適量山柰對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液。以山柰對(duì)照藥材和對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯對(duì)照品為對(duì)照進(jìn)行薄層色譜實(shí)驗(yàn)，結(jié)果供試品與模擬樣品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照品藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同的熒光斑點(diǎn)（Rf值0.24），且同工藝同法制備的陰性對(duì)照（缺山柰）色譜中在相應(yīng)的位置上未出現(xiàn)熒光斑點(diǎn)，表明處方中其他組分無(wú)干擾，具有專屬性。見圖4。3批供試品和模擬樣品薄層色譜結(jié)果見圖5。

2.2.3 斯日西散中土木香的薄層鑒別 取本品粉末5 g，加乙醚30 mL，振搖10 min，棄去乙醚液，藥渣揮干乙醚，加乙酸乙酯20 mL，置水浴上加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，加2 mL無(wú)水乙醇溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液。另取土木香?nèi)酯對(duì)照品與異土木香內(nèi)酯對(duì)照品制備對(duì)照品溶液。按處方比例折算，相同工藝制備的模擬樣品與陰性對(duì)照（缺土木香）各5 g，同法制備模擬樣品溶液以及陰性對(duì)照溶液。以土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯為對(duì)照進(jìn)行薄層色譜實(shí)驗(yàn)，結(jié)果斯日西散與模擬樣品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的斑點(diǎn)（Rf值：土木香內(nèi)酯0.63，異土木香內(nèi)酯0.54），而陰性對(duì)照（缺土木香）色譜中在相應(yīng)的位置上未出現(xiàn)斑點(diǎn)，表明斯日西散處方中其他組分無(wú)干擾，具有專屬性。見圖6。3批供試品和模擬樣品薄層色譜結(jié)果見圖7。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 液相色譜條件 通過系統(tǒng)適應(yīng)性考察，確定液相實(shí)驗(yàn)色譜條件，色譜柱：C18柱（Thermo scientific，250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（42∶23∶35）;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm;進(jìn)樣量：10 μL;理論塔板數(shù)：結(jié)合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部“大黃”含量測(cè)定項(xiàng)下要求，本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.3.2 溶液制備 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取大黃素對(duì)照品0.003 38 g，加25 mL甲醇溶液制成每1 mL含0.135 2 mg的溶液，即得。供試品溶液的制備：取本品約4.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，分別超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）45 min，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 專屬性實(shí)驗(yàn) 按斯日西散處方工藝制備不含大黃的陰性對(duì)照品，根據(jù)供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液（缺大黃）。精密吸取供試品溶液、大黃素對(duì)照品溶液與陰性對(duì)照溶液各10 μL注入液相色譜儀，按2.3.1的液相色譜條件測(cè)定。從圖8可見，供試品色譜中在與對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的位置上有色譜峰出現(xiàn)，而陰性對(duì)照在與大黃素對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的位置上無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明該含量測(cè)定方法陰性無(wú)干擾，專屬性好。

2.3.4 線性關(guān)系的考察 取大黃素對(duì)照品0.003 38 g，置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻配制母液。精密吸取母液，稀釋2.5倍后再依次倍比稀釋，制備濃度梯度的稀釋液，吸入10 μL至液相色譜儀，按2.3.1液相色譜條件測(cè)定，以峰面積對(duì)大黃素量進(jìn)行回歸分析，結(jié)果大黃素在0.001 7～0.135 2 mg/mL范圍內(nèi)分別呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為：y=0.684 4x-0.735 8，r=0.999 8，標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值見表1。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密稱取約4.5 g同一批號(hào)斯日西散（生產(chǎn)批號(hào)：20170118）6份，分別按上述供試品溶液的制備方法制備，按2.3.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量各10 μL，計(jì)算大黃素峰面積的RSD為0.70%，符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》一部要求，精密度良好。見表2。

2.3.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取同一供試品（生產(chǎn)批號(hào)：20170118，含量0.050 6 mg/g）6份，各約2.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入大黃素對(duì)照品溶液2 mL（大黃素濃度為0.054 4 mg/mL），再分別精密加甲醇23 mL，按上述方法測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：回收率在85%～110%之間，準(zhǔn)確度符合要求。見表3。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（生產(chǎn)批號(hào)：20170118），按上述供試品溶液的制備方法和色譜條件，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)行測(cè)定。見表4。從表中數(shù)據(jù)可見，在24 h內(nèi)游離大黃素峰面積值基本穩(wěn)定不變。

2.3.8 樣品含量測(cè)定 取供試品3批（生產(chǎn)批號(hào)：20170118、20150629、20170701），按“2.3.2”方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件對(duì)大黃素的含量進(jìn)行測(cè)定（n=3），3批樣品中大黃素的含量結(jié)果見表5。

2.3.9 耐用性實(shí)驗(yàn) 將柱溫從25 ℃調(diào)到35 ℃，其他按正文的色譜條件，取2.3.5精密度測(cè)定實(shí)驗(yàn)中的樣品進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL。見表6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法耐用性良好。

3 討論

斯日西是由治療肝胃郁熱型、肝胃不和型癥候的阿拉坦-5與具有和胃健脾、導(dǎo)滯消積、行血止痛之功效的阿木日-6組成的制劑。有報(bào)道稱，斯日西散聯(lián)合腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)混懸液應(yīng)用于膿毒癥患者，可以極大程度上彌補(bǔ)單純腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液所導(dǎo)致的胃腸道并發(fā)癥，并對(duì)胃腸道具有很好的保護(hù)作用[2]。同時(shí)其他臨床研究也表明，阿拉坦-5對(duì)慢性胃炎、消化道潰瘍、功能性消化不良等胃腸道疾病具有較明顯的治療作用[3-5]。而蒙藥阿木日-6散，即2015版《中華人民共和國(guó)藥典》記載的六味安消散，目前其臨床應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，有研究者總結(jié)阿木日-6散的臨床應(yīng)用，常用于便秘、功能性消化不良、胃脘痛、胃食管反流等[6]。

然而關(guān)于斯日西散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究卻不多。因此本研究首先對(duì)斯日西散中所含藥材的顯微和薄層鑒別進(jìn)行了研究，因本制劑是以原藥粉制成的散劑，故對(duì)大黃、土木香、寒水石、山柰、木鱉子、石榴、黑冰片進(jìn)行了顯微鑒別研究，結(jié)果顯示顯微鑒別特征圖片清晰，可作為以上藥材的鑒別依據(jù);同時(shí)對(duì)組方中主要藥味大黃、山柰、土木香進(jìn)行了薄層鑒別研究，大黃為處方中主要藥味之一，在處方中所占比例也較大，具有瀉熱通腸、涼血解毒的作用，參照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》一部“大黃”項(xiàng)下的薄層鑒別方法，以大黃對(duì)照藥材和大黃酸為對(duì)照品進(jìn)行條件摸索，確定方法并考察了室溫22 ℃（相對(duì)濕度20%）和低溫6 ℃、低濕（相對(duì)濕度35%）對(duì)薄層鑒別的影響，結(jié)果顯示低溫、低濕條件對(duì)整體分離效果無(wú)太大影響，耐用性良好，可用于該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。山柰具有行氣溫中、消食、止痛等功效，為處方中主要藥味之一，本研究參照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》一部山柰項(xiàng)下的薄層鑒別方法，以山柰對(duì)照藥材和對(duì)甲氧基桂皮酸乙酯為對(duì)照進(jìn)行條件摸索，并對(duì)上述鑒別項(xiàng)進(jìn)行了方法驗(yàn)證，專屬性及耐用性考察試驗(yàn)。土木香具有健脾和胃等功效，為處方中主要藥味之一，參照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》一部“土木香”項(xiàng)下的薄層鑒別方法試驗(yàn)的結(jié)果效果不好，無(wú)法鑒別。故參照2007版《內(nèi)蒙古蒙藥制劑規(guī)范》記載的阿拉坦-阿木日膠囊鑒別土木香項(xiàng)下的薄層鑒別方法，以土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯為對(duì)照進(jìn)行條件摸索，同樣對(duì)上述鑒別項(xiàng)進(jìn)行了方法驗(yàn)證，專屬性及耐用性考察試驗(yàn)。

本研究對(duì)斯日西散中游離大黃素的含量測(cè)定進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)條件摸索，經(jīng)分析方法驗(yàn)證，該方法重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，方法中其他成分對(duì)大黃素測(cè)定無(wú)干擾，可用于該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法學(xué)驗(yàn)證過程當(dāng)中，對(duì)25 ℃和30 ℃柱溫進(jìn)行了比較，結(jié)果大黃素保留時(shí)間略有差異，但分離度及理論板數(shù)沒有變化，故本實(shí)驗(yàn)研究采用柱溫25 ℃。而對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇時(shí)，利用DAD檢測(cè)器自190～400 nm做光譜掃描，結(jié)果大黃素在221～288 nm處有吸收峰，結(jié)合《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部“大黃”項(xiàng)下選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。對(duì)于斯日西散的提取方法，參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部“六味安消散”含量測(cè)定項(xiàng)下游離大黃素的供試品溶液的制備方法，并對(duì)提取效率進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示超聲時(shí)間45 min時(shí)，游離大黃素含量最高，故確定超聲時(shí)間為45 min。同時(shí)也對(duì)峰純度進(jìn)行了考察，以二極管陣列檢測(cè)對(duì)被測(cè)成分大黃素的峰進(jìn)行純度驗(yàn)證，大黃素峰匹配值為994，大于980，證明為單一組分。

本研究對(duì)斯日西散中的大黃、土木香、寒水石、山柰、木鱉子、石榴、黑冰片進(jìn)行顯微鑒別，對(duì)大黃、山柰、土木香進(jìn)行薄層色譜鑒別;用高效液相色譜法測(cè)定大黃中大黃素的含量，為建立斯日西散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了重要依據(jù)，將對(duì)進(jìn)一步挖掘和開發(fā)該藥有重要意義。

綜上所述，本研究中大黃、山柰、土木香薄層鑒別用料少，操作簡(jiǎn)便，耐用性良好，專屬性強(qiáng)，可用于該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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（2019-06-26收稿 責(zé)任編輯：王明）