王楠 蘇譽(yù) 劉文杰 封明 毛瑜 張新國

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅省中藏藥篩選評(píng)價(jià)及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050）

抗生素是應(yīng)對(duì)各類細(xì)菌感染性疾病的重要藥物，但隨著抗生素的日益廣泛應(yīng)用，尤其是不合理應(yīng)用甚至濫用，由此而引發(fā)的細(xì)菌耐藥性正在逐年增多。據(jù)世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，有70萬人死于抗生素耐藥。其中針對(duì)耐藥結(jié)核病的調(diào)查顯示，有55.8萬例是對(duì)利福平耐藥的新病例，其中46萬例是耐多藥的［1］?？股啬退幮砸呀?jīng)成為嚴(yán)重威脅公共健康、經(jīng)濟(jì)增長和全球經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定的重大問題。2016年于杭州召開的20國集團(tuán)領(lǐng)導(dǎo)人峰會(huì)上，應(yīng)對(duì)抗生素耐藥性問題被寫入峰會(huì)公報(bào)，呼吁國際社會(huì)共同面對(duì)日益嚴(yán)重的耐藥性問題［2］。2020年5月，WHO、聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織召開會(huì)議，決定將“抗菌藥物”名稱改為“抗微生物藥物”，并將每年11月的第三周定為“世界提高抗微生物藥物認(rèn)識(shí)周”，要求世界領(lǐng)導(dǎo)人聯(lián)手抗擊不斷加劇的抗微生物藥物耐藥性危機(jī)［3］。

抗生素耐藥儼然已經(jīng)是我國和全世界都難以回避的嚴(yán)重問題。預(yù)防和減少抗生素耐藥性，除了積極合理的正確使用抗生素，防止抗生素濫用，更深入地了解耐藥機(jī)制，加快研究開發(fā)新型抗耐藥微生物藥物是解決該問題的關(guān)鍵。微生物分布廣泛，其復(fù)雜多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物是抗生素發(fā)現(xiàn)的重要資源，在過去的很長一段時(shí)間內(nèi)，土壤微生物在抗生素開發(fā)過程中長期扮演著極其重要的角色。然而，隨著土壤微生物的廣泛運(yùn)用，從土壤環(huán)境中發(fā)現(xiàn)新的抗微生物活性化合物越來越困難［4］。

植物內(nèi)生菌，是指其生活史的一定階段或全部階段定殖于植物器官、組織內(nèi)部以及細(xì)胞間隙的一類微生物，主要包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌。作為一類亟待開發(fā)的重要微生物資源，不僅分布資源廣泛，種類繁多，絕大部分可產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，而且這些次級(jí)代謝產(chǎn)物往往豐富多樣并具有多種生物活性，是尋找和開發(fā)新型先導(dǎo)化合物的重要資源［5］。研究顯示，植物內(nèi)生菌不會(huì)對(duì)宿主植物引起明顯的病害癥狀，其與宿主之間存在著互惠互利的關(guān)系。一方面植物內(nèi)生菌可以促進(jìn)宿主植物生長，增強(qiáng)植物抗逆性；另一方面植物內(nèi)生菌長期定殖在植物體內(nèi)與其協(xié)同進(jìn)化，其特有的代謝途徑使其次級(jí)代謝產(chǎn)物中能產(chǎn)生大量化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、抑菌效果較好，或有特殊作用的生物活性物質(zhì)，有利于開發(fā)新型抗生素和天然活性產(chǎn)物，是新藥及新的抗耐藥微生物藥物發(fā)現(xiàn)的良好資源［6-7］。事實(shí)上，這些化合物中的一些已被證明在新藥研發(fā)中起著非常重要的作用［8］?；诖?，本文就近年來植物內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中具有抗耐藥微生物生物活性化合物的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，以期為該類藥物的研發(fā)提供參考。

1 細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

細(xì)菌耐藥性是造成抗生素治療細(xì)菌性感染失敗的主要原因之一，通過細(xì)菌耐藥性機(jī)理的研究將對(duì)創(chuàng)新抗耐藥微生物的藥物的研究提供重要的理論支撐，目前關(guān)于細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究成果主要集中在以下幾個(gè)方面。

1.1 降低藥物與其靶標(biāo)結(jié)合的親和力

降低藥物與其靶標(biāo)結(jié)合的親和力是耐藥細(xì)菌應(yīng)對(duì)抗生素治療的有效策略之一，耐藥細(xì)菌可以通過不同的方式來干擾抗生素與靶標(biāo)的結(jié)合，從而使其對(duì)該抗生素產(chǎn)生耐藥性。研究顯示，耐藥微生物可以使編碼抗生素靶標(biāo)的基因發(fā)生突變，導(dǎo)致其對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性。耐萬古霉素腸球菌（vancomycin resistant Enterococcus，VRE）是腸球菌屬中引起醫(yī)院感染性疾病最常見的病原菌。唐曼娟等［9］在對(duì)VRE菌株的研究發(fā)現(xiàn)，編碼Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶（藥物靶位）的基因gyrA、gyrB、parC和parE的突變會(huì)導(dǎo)致腸球菌對(duì)喹諾酮類藥物呈現(xiàn)高水平耐藥，且突變主要發(fā)生在gyrA基因的83位和parC基因的80位。進(jìn)一步的研究證實(shí)，環(huán)丙沙星對(duì)其中僅攜帶有parC單位點(diǎn)突變的菌株的治療效果降低，MIC值范圍為8-16 μg/mL，而對(duì)同時(shí)攜帶有g(shù)yrA和parC雙位點(diǎn)突變的菌株環(huán)丙沙星的治療效果變得更差，相應(yīng)MIC值范圍為32-128 μg/mL，為前者的4-16倍。

其次也有研究顯示，耐藥微生物可以通過對(duì)抗生素靶標(biāo)的修飾導(dǎo)致其對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性。鏈陽性菌素B是臨床用于治療革蘭氏陽性細(xì)菌感染的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。程長偉等［10］在對(duì)該類抗生素具有高水平耐藥性的鏈球菌S. gallolyticus subsp. pasteurianus的研究發(fā)現(xiàn)，由耐藥基因ermB和ermT編碼的甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)該鏈球菌23S rRNA進(jìn)行了甲基化修飾，這一結(jié)構(gòu)修飾降低了該藥物靶點(diǎn)與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的結(jié)合，從而使細(xì)菌獲得耐藥性。

此外，細(xì)菌還可以通過編碼不與抗微生物藥物結(jié)合的靶標(biāo)同源物基因來應(yīng)對(duì)抗微生物藥物的治療作用。李雪寒等［11］的研究表明，除染色體編碼的青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding protein，PBP）之 外，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）中的mecA基因能夠編碼產(chǎn)生新的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a。盡管PBP受β-內(nèi)酰胺類抗生素的抑制，但PBP2a對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素同時(shí)具有抑制作用，仍可進(jìn)行細(xì)胞壁合成，導(dǎo)致MRSA產(chǎn)生對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的高度耐藥性。

1.2 破壞或改變抗生素的活性結(jié)構(gòu)

為了抵御抗生素的治療作用，耐藥微生物能合成對(duì)抗生素產(chǎn)生降解作用或者對(duì)抗生素進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾的酶來致使藥物失活及鈍化，從而使該細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性［12］。β-內(nèi)酰胺類抗生素是目前臨床應(yīng)用最廣泛的一類抗生素，研究發(fā)現(xiàn)隨著其廣泛使用，耐藥性肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等致病菌均會(huì)產(chǎn)生能夠破壞該類抗生素β-內(nèi)酰胺環(huán)的β-內(nèi)酰胺酶而產(chǎn)生耐藥［13］。除此之外，還有與大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性有關(guān)的大環(huán)內(nèi)酯酶等，也能破壞抗生素的活性結(jié)構(gòu)，一些腸桿菌科細(xì)菌如大腸桿菌可以通過產(chǎn)生相應(yīng)的紅霉素酯酶來破環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的內(nèi)酯環(huán)，從而獲得耐藥性。另外，對(duì)耐藥微生物而言，同樣來自抗生素耐藥性酶家族的各類基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶也發(fā)揮著重要作用。這些酶通過共價(jià)修飾來改變抗生素的活性結(jié)構(gòu)，從而使其喪失與靶點(diǎn)的結(jié)合能力。主要的結(jié)構(gòu)改變包括：O-乙酰化和N-乙?；?、O-磷酸化、O-核苷酸化、O-核糖基化、O-糖基化及巰基轉(zhuǎn)移等［14］。

1.3 主動(dòng)外排系統(tǒng)的過表達(dá)

由細(xì)菌外排泵介導(dǎo)的對(duì)抗生素的外排作用是細(xì)菌多重耐藥的重要機(jī)制之一，細(xì)菌的外排泵是存在于細(xì)菌胞膜上的一類膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該系統(tǒng)可以非選擇性的將藥物泵出胞外，從而使細(xì)菌體內(nèi)藥物濃度降低而導(dǎo)致耐藥性［15］。越來越多地研究發(fā)現(xiàn)多藥外排泵的過表達(dá)與細(xì)菌的耐藥性有關(guān)。吳偉清等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)碳青霉烯類藥物亞胺培南耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌，其耐藥性與外排泵基因過度表達(dá)密切相關(guān)。加入外排泵抑制劑羰基氰氯苯腙（carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone，CCCP）后，耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南的MIC比不加入CCCP的MIC值下降4倍及以上，且聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增結(jié)果顯示，有76.6%的耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶外排泵adeB基因，有58.6%攜帶外排泵adeJ基因。趙娜等［17］報(bào)告指出，耐藥分枝桿菌中存在藥物主動(dòng)外排泵的表達(dá)，作為一種重要耐藥機(jī)制，耐藥微生物表達(dá)的外排泵蛋白可以轉(zhuǎn)出氟喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類藥物及其他化合物，從而產(chǎn)生廣泛的耐藥性。

1.4 生物膜的形成

生物膜是微生物在生長過程中由微生物的細(xì)胞及其分泌的聚合物所組成的多細(xì)胞復(fù)合體，由多種有機(jī)物組成，主要成分是多糖和蛋白質(zhì)［18］。有研究報(bào)道細(xì)菌的耐藥性與其生物膜密切相關(guān)［19］。趙芝靜等［20］對(duì)銅綠假單胞菌生物膜進(jìn)行研究的結(jié)果表明，該菌表面會(huì)形成主要由藻酸鹽聚集而成的有一定厚度的生物膜，藻酸鹽不僅可與大量抗生素分子相結(jié)合，也可結(jié)合抗生素水解酶，從而導(dǎo)致大量抗生素尚未進(jìn)入膜內(nèi)即被滅活。而且研究還顯示，生物膜通透性的變化可以減少抗生素進(jìn)入膜內(nèi)，使膜內(nèi)細(xì)菌有足夠時(shí)間開啟抗生素耐藥基因，顯示高度耐藥性。進(jìn)一步對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)和代謝復(fù)雜性的研究顯示，生物膜不僅能為細(xì)菌提供營養(yǎng)和信息交流，而且能為細(xì)菌長期持留于宿主體內(nèi)、逃避免疫系統(tǒng)及抗生素殺傷提供生長的環(huán)境［21］，而且在多個(gè)耐藥微生物如銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌和結(jié)核分枝桿菌等發(fā)現(xiàn)會(huì)形成生物膜，并且生物膜與其他耐藥機(jī)制共存，產(chǎn)生協(xié)同耐藥［22］。

1.5 細(xì)胞外膜通透性的改變

細(xì)胞外膜通透性的改變是細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的主要原因之一。耐藥微生物通過降低外膜通透性來阻止抗生素進(jìn)入胞內(nèi)，從而降低胞內(nèi)藥物濃度導(dǎo)致耐藥。研究顯示，耐藥性銅綠假單胞菌細(xì)胞外膜上孔蛋白發(fā)生的改變會(huì)導(dǎo)致的外膜通透性的降低，從而導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性［23］。梁宏潔等［24］的研究進(jìn)一步證實(shí)，多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥性與編碼微孔蛋白（OprD2）的結(jié)構(gòu)基因oprD的基因缺失突變有關(guān)，而OprD2能形成碳青霉烯類抗生素（美羅培南除外）進(jìn)入細(xì)菌胞內(nèi)的特異性通道，OprD2含量的減少甚至缺失使銅綠假單胞菌外膜通透性降低，從而導(dǎo)致耐藥性。

2 植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗耐藥微生物活性化合物及其進(jìn)展

目前關(guān)于植物內(nèi)生菌抗菌及抗耐藥微生物活性的研究正逐年增多。劉曉瑜等［25］從22種藥用植物組織中分離出197株內(nèi)生菌，經(jīng)篩選獲得18株對(duì)MRSA有拮抗作用的菌株，部分拮抗菌株的發(fā)酵液對(duì)MRSA有很好的抑制效果。李園園等［26］從貴州的5 種藥用植物（大黃、刺梨、杜仲、白芍和刺五加）中分離到46 株對(duì)耐藥大腸桿菌、耐藥金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌及白色鏈球菌等有不同程度的抗菌活性的植物內(nèi)生菌，發(fā)掘了藥物植物內(nèi)生菌中豐富多樣的抑制耐藥微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物資源。內(nèi)生菌作為一個(gè)可再生的資源，已經(jīng)成為了抗耐藥微生物活性化合物篩選重要的來源，本文就最近幾年有關(guān)植物內(nèi)生菌中抗耐藥微生物活性代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)行匯總（表1）并分述如下。

表1 續(xù)表 Continued

表1 來自植物內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中的抗耐藥微生物活性成分Table 1 Active compounds for anti-drug resistant microorganism from secondary metabolites of plant endophytes

2.1 肽類化合物

抗菌肽類化合物是一類由生物體產(chǎn)生的小分子陽離子型活性多肽，結(jié)構(gòu)多樣且具有廣譜抗菌活性［27］。作為一種可從自然來源提取并用于對(duì)抗抗生素耐藥細(xì)菌的潛在候選物，抗菌肽類化合物引起了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注［28］。該類化合物廣泛分布在動(dòng)物、植物和昆蟲體內(nèi)，其特殊的結(jié)構(gòu)特性，尤其是植物內(nèi)生菌源多肽類化合物作為抗耐藥微生物選擇，顯示出了極好的開發(fā)應(yīng)用前景［29］。

內(nèi)生菌作為抗菌活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)的重要資源，有近70%的抗生素都來自于放線菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物。內(nèi)生放線菌是內(nèi)生菌資源的重要組成部分，研究顯示內(nèi)生放線菌因其在植物宿主中獨(dú)特的代謝途徑，可能會(huì)產(chǎn)生不同于土壤放線菌的抗生素，也是抗耐藥微生物藥物發(fā)現(xiàn)的潛在良好資源［30］。Castillo等［31］從澳大利亞北領(lǐng)地采集的藥用植物Kennedia nigriscans中分離到的內(nèi)生放線菌Streptomyces sp. NRRL3052的次級(jí)代謝產(chǎn)物中得到具有廣泛抑菌活性的4種肽類化合物Munumbicins A、B、C和D。研究表明Munumbicins不僅對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌，如炭疽芽孢桿菌，肺炎鏈球菌等具有良好的抑制效果，而且對(duì)許多耐藥性細(xì)菌如結(jié)核分枝桿菌等也都具有強(qiáng)烈的抑菌活性。其中縮氨酸類化合物Munumbicins B對(duì)MRSA菌株的抑制作用最強(qiáng)（MIC值為2.5 μg/mL）。此外，分離自另一株內(nèi)生放線菌Streptomyces sp. NRRL30562的化合物Munumbicins E-4和E-5，也顯示了對(duì)MRSA明顯的抑制作用，MIC值分別為8 μg/mL和16 μg/mL［32］。肽類化合物kakadumycin A是分離自鼠尾草Grevillea pteridifolia內(nèi)生放線菌Streptomyces sp. NRRL 30566的次級(jí)代謝產(chǎn)物，與Munumbicins類化合物相比，該肽類化合物對(duì)耐藥微生物菌株MRSA具有更高的抑制活性（MIC值為0.5 μg/mL），且kakadumycin A對(duì)VRE菌株也具有強(qiáng)烈的抑制作用，MIC值為0.062 μg/mL［33］。此外，植物內(nèi)生真菌被證明也能產(chǎn)生種類繁多的肽類抗生素。Singh等［34］從哥斯達(dá)黎加的冠卡斯特國家公園紐扣樹（buttonwood tree）的分支中分離到一株內(nèi)生真菌Cytospora sp. CR200，進(jìn)一步從其次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離到5個(gè)八肽類化合物cytosporones A-E，其中化合物Cytosporone D和E對(duì)MRSA310、屎腸球菌α379、屎腸球菌α436等多株耐藥微生物都有抑制作用，其MIC值介于8-64 μg/mL，顯示了較好的體外抗菌活性。內(nèi)生真菌Penicillium sp.0935030是從紅樹林植物鹵蕨Acrostichum aureurm中分離得到的，崔海濱等［35］在其發(fā)酵物中分離得到兩個(gè)具有抑耐藥微生物活性的環(huán)肽化合物，環(huán)（脯氨酸-蘇氨酸）和環(huán) （脯氨酸-酪氨酸），抑菌活性測(cè)定結(jié)果顯示這兩個(gè)化合物對(duì)MRSA菌株有明顯的抑制活性，抑制范圍為9 mm，顯示了一定的潛在研究?jī)r(jià)值。

2.2 聚酮類化合物

聚酮類化合物數(shù)量龐大，包括四環(huán)類、大環(huán)內(nèi)酯類、蒽醌類和聚醚類等化合物，是一大類結(jié)構(gòu)和生物活性多樣的天然產(chǎn)物，具有抗感染、抗真菌、抗腫瘤等多種重要生物活性，目前，由植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的聚酮類化合物已經(jīng)成為抗耐藥微生物研究的重要來源［36］。

化合物dothideomycetide A是由Senadeera等［37］從泰國藥用植物Tiliacora triandra內(nèi)生真菌Dothideomycete sp.中分離到的一種新型的萜烯樣三環(huán)聚酮化合物。該化合物對(duì)于MRSA菌株顯示出一定的抗菌活性，MIC值為256 μg/mL。Shang等［38］從來自紅樹林植物Pongamia pinnata的內(nèi)生菌Nigrospora sp. MA75中分離得到兩個(gè)聚酮類化合物griseophenone C和tetrahydrobostrycin，抑菌結(jié)果顯示，化合物griseophenone C和tetrahydrobostrycin對(duì)MRSA均表現(xiàn)出顯著的抑制活性，MIC值分別為0.5 μg/mL和2 μg/mL。Djinni等［39］從阿爾及利亞東北部Bejaia海岸線收集的海藻Fucus sp.中分離到的一株內(nèi)生放線菌Streptomyces sp.WR1L1S8。在其代謝產(chǎn)物中獲得了一種聚酮化合物｛=2-hydroxy-5-［（6-hydroxy-4-oxo-4Hpyran-2-yl）methyl］-2-propylchroman-4-one｝，該聚酮化合物顯示出對(duì)MRSA的選擇性抑制活性，MIC值為6 μmol/L。氯化二苯甲酮抗生素Pestalone分離自巴哈馬群島褐藻Rosenvingea sp.內(nèi)生真菌Pestalotia sp. 和單細(xì)胞海洋細(xì)菌CNJ-328的共培養(yǎng)物，Pestalone對(duì)MRSA和VRE均顯示出有效的抑菌活性，MIC 值分別為37 ng/mL和78 ng/mL［40］。Wang等［41］從桂皮Cinnamomum kanehirae內(nèi)生真菌Fusarium oxyporum中分離到聚酮類化合物beauvericin和（-）-4，6'-脫水氨基哌啶酮，兩個(gè)化合物對(duì)MRSA活性的抗菌活性的MIC值分別為3.125和100 μg/mL，

其中beauvercin表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗MRSA活性。此外，分離自紅樹林植物Rhizophora apiculataz內(nèi)生真菌Phomopsis sp.PSU-MA214的四氫蒽醌衍生物phomopsanthraquinone也顯示出對(duì)金黃色葡萄球菌及MRSA一定的抑菌活性，MIC值為128 μg/mL和64 μg/mL［42］。Supong等［43］從水稻Oryza sativa L.中分離出內(nèi)生放線菌Streptomyces sp. BCC72023中，并得到了3種大環(huán)內(nèi)酯類化合物efomycin M、efomycin G和oxohygrolidin，所有化合物均顯示出對(duì)K-1多藥耐藥微生物株 Plasmodium falciparum良好的抑制活性（IC50值在1.40-5.23 μg/mL范圍內(nèi)），且化合物efomycin G2對(duì)普通蠟狀芽孢桿菌也具有較強(qiáng)的抗菌活性，MIC值為3.13 μg/mL。

2.3 萜類化合物

萜類化合物是天然產(chǎn)物中數(shù)量較多的一類化合物，分布廣泛，結(jié)構(gòu)多樣，具有多樣的生物學(xué)活性，主要具有抗菌、抗炎和抗腫瘤等活性，萜類化合物在藥物研究開發(fā)領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。Singh等［44］從哥斯達(dá)黎加瓜納卡斯特生長的Daphnopsis americana的植物中分離得到內(nèi)生真菌CR115，研究發(fā)現(xiàn)其次級(jí)代謝產(chǎn)物中存在一種新穎的二萜類化合物guanacastepene A。與萬古霉素（對(duì)MRSA菌株的抑制范圍為17 mm，對(duì)VRE菌株沒有抑制活性）相比，該化合物對(duì)耐藥菌株MRSA和VRE顯示出良好的抑制作用（抑制范圍為7-10 mm和8 mm）。Gao等［45］從海洋紅藻物種Laurencia的內(nèi)生菌Penicillium chrysogenum QEN-24S中分離到萜類化合物Conidiogenone B。抑菌活性測(cè)定結(jié)果顯示該化合物對(duì)MRSA具有顯著的抗菌活性，MIC為8 μg/mL。Wang等［46］從苔蘚Everniastrum sp.內(nèi)生真菌Ulocladium sp. 次級(jí)代謝產(chǎn)物的丙酮提取物中分離出5種蛇孢菌素二倍半萜類化合物，其中萜類化合物Ophiobolin P和Ophiobolin T對(duì)MRSA具有中等的抗菌活性，MIC值分別為31.3 μg/mL和15.6 μg/mL。Ding等［47］從紅樹林 Kandelia candel 的內(nèi)生鏈霉菌 Streptomyces sp. HKI0595 次級(jí)代謝產(chǎn)物中也分離到倍半萜類化合物xiamycin，在抑制MRSA菌株和VRE菌株的活性篩選中，與對(duì)照氯霉素相比（抑制范圍均為7 mm），xiamycin表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，抑制范圍分別為14 mm和12 mm。

2.4 多酚類化合物和有機(jī)酸類化合物

多酚類化合物是一類復(fù)雜的具有多個(gè)酚羥基的次生代謝產(chǎn)物，具有抗癌、抗衰老、抗炎、抗菌等生物活性。劉俊等［48］從貴州省道地藥材頭花蓼的莖中分離得到的細(xì)極鏈格孢菌屬內(nèi)生真菌Alternaria tenuissima sp. PC-005，在其次級(jí)代謝產(chǎn)物中活性組分中分離到酚類化合物5-甲氧基格鏈孢酚，96孔板法抗菌活性測(cè)定結(jié)果顯示，該化合物對(duì)肺炎克雷伯桿菌、普通變形桿菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、屎腸球菌等7種耐藥微生物均具有良好的抑菌活性，MIC值分別為125、250、125、250、250、125和500 μg/mL。

有機(jī)酸是指廣泛存在于生物中的一類含有羧基的酸性有機(jī)化合物，在植物中根、莖、葉等各部位都有分布，種類繁多，生物活性豐富多樣，具有作為抗生素的潛力。劉俊等［49］從該植物內(nèi)生真菌Gibberella intermedia次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離到具有抗耐藥微生物活性的羧酸類活性化合物鐮霉菌酸，抑菌活性測(cè)定結(jié)果顯示，該化合物對(duì)多重耐藥大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和奇異變形桿菌具有抑制作用，MIC值分別為31.3、125、62.5 mg/mL。此外，化合物鐮霉菌酸還表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)其耐藥性的作用，在其1/8 MIC的濃度下，能使左氧氟沙星和環(huán)丙沙星對(duì)臨床耐藥大腸埃希菌的MIC分別降低4倍和2倍；在其1/4 MIC的濃度下，能使左氧氟沙星和環(huán)丙沙星對(duì)耐藥微生物奇異變形桿菌的MIC分別降低了2倍和4倍，且對(duì)臨床耐藥金黃色葡萄球菌的MIC值均降低了2倍。Klaiklay等［50］對(duì)紅樹林內(nèi)生真菌Xylaria cubensis PSU-MA34代謝產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 25923和MRSA菌株的抗菌活性相同，MIC值均為200 μg/mL。在其次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到的琥珀酸衍生物xylacinicacids A and B、2-hexylidene-3-methyl succinic acid 4-methylester、cytochalasin D及2-chloro-5-methoxy-3-methylcyclohexa-2，5-diene-1，4-dione等，均對(duì)金黃 色葡萄球菌ATCC 25923和MRSA有抑制作用， 其中化合物2-chloro-5-methoxy-3-methylcyclohexa-2，5-diene-1，4-dione對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA菌株的MIC值為128 μg/mL，顯示出一定的研究?jī)r(jià)值。

2.5 其他類有機(jī)化合物

Phongpaichit等［51］從泰國Garcinia mangostana葉中分離到內(nèi)生真菌Matryephaeria mamane PSU- M76，在其次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離到7種化合物。包括化合物botryomaman（一種新的二氫苯并呋喃衍生物）以及6種已知化合物2，4-二甲氧基-6-戊基苯酚、（R）-（-）-mellein、primin、順式4-羥基海藻油、反式-4-羥基海藻油和4，5二羥基-2-己烯酸。抗菌實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示，所有化合物對(duì)MRSA菌株SK1均有抗菌活性。其中化合物 Primin表現(xiàn)出最好的抑制活性，MIC值為8 μg/mL。劉少偉等［52］從沙生植物檉柳中分離到鏈霉菌CLR304，其次級(jí)代謝產(chǎn)物304A為維吉尼霉素M1，該化合物對(duì)革蘭陽性菌顯示出較強(qiáng)抑制活性，如對(duì)耐甲氧西林表皮葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococus Epidermidis，MRSE）、MRSA、萬古霉素中度耐藥金黃色葡萄球菌（vancomycinintermediate S.aureus，VISA）、VRE，MIC值均在1-4 μg/mL范圍內(nèi)。Gos等［53］從藥用植物Vochysia divergens中分離到內(nèi)生放線菌Aeromicrobium ponti LGMB491，提取物顯示出對(duì)MRSA菌株良好的抑菌活性，MIC為0.04 μg/mL，進(jìn)一步在其次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離到6個(gè)具有抗菌活性的主要化合物，抑菌結(jié)果顯示，與甲氧西林相比（對(duì)甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus Aureus，MSSA）的抑制范圍為20 mm，對(duì)MRSA菌株無抑制活性），化合物1-acetylβ-carboline、indole-3-carbaldehyde、3-（hydroxyacetyl）-indole、brevianamide F、cyclo-（L-Pro-L-Phe） 對(duì)MSSA和MRSA均顯示中等抑制活性，其中對(duì)耐藥菌株MRSA的抑制范圍依次為15、9、8、9、9 mm。與此同時(shí)，Alshaibani等［54］評(píng)估了內(nèi)生鏈霉菌streptomyces SUK 25乙酸乙酯提取物對(duì)于多種耐藥（multidrug resistance，MDR）細(xì)菌的生物活性，其中4種活性二酮哌嗪化合物cyclo-（L-Val-L-Pro）、cyclo-（L-Leu-L-Pro）、cyclo-（L-Phe-L-Pro）、cyclo-（L-Val-L-Phe）和一種乙酰胺衍生物N-（7-hydroxy-6-methyl-octyl）-acetamide，對(duì)MRSA菌株ATCC 43300均有良好的抑制活性；其中cyclo-（L-Leu-L-Pro）對(duì)VRE菌株，如糞腸球菌K-99-34、糞腸球菌K-00-184和糞腸球菌K-00- 221具有抑制作用，MIC值為12.5 μg/mL。此外，學(xué)者Thi 等［55］從決明子中分離到內(nèi)生放線菌Streptomyces cavourensis subsp.YBQ59，從其發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物中分離到的8個(gè)次生代謝產(chǎn)物。其中化合物1-monolinolein、bafilomycin D、nonactic acid、daidzein和3'-hydroxydaidzein對(duì)MRSA菌株ATCC 33591和MRSE菌株ATCC 35984均顯示出抗菌活性，其中亞油酸甘油酯1-monolinolein表現(xiàn)出最強(qiáng)的作用，最低抑菌濃度分別為8.5和14.6 μg/mL。

3 展望

隨著抗生素廣泛應(yīng)用而帶來的病原體對(duì)已知抗生素的抗性增加，以及MRSA，VRE，耐青霉素肺炎鏈球菌（penicillin resistant Streptococcus Pneumoniae，PRSP）等多重耐藥微生物的急劇增多，細(xì)菌耐藥性已經(jīng)成為一個(gè)全世界需要努力協(xié)同解決的重大問題。2016年，國家衛(wèi)健委與14部位聯(lián)合發(fā)布《遏制細(xì)菌耐藥國家行動(dòng)計(jì)劃（2016-2020年）》，進(jìn)行新抗耐藥微生物藥物的研究已經(jīng)上升到國家意識(shí)，并正在被越來越多的學(xué)者所關(guān)注。植物內(nèi)生菌作為一種新的亟待開發(fā)的微生物資源，其豐富的微生物多樣性和次級(jí)代謝產(chǎn)物多樣性為尋找新型的抗耐藥微生物活性物質(zhì)提供了可能。正如上文所綜述的其中一些結(jié)構(gòu)新穎肽、聚酮、萜類等化合物，已經(jīng)顯示了良好的抗耐藥微生物活性和開發(fā)潛力。但是，以植物內(nèi)生菌為資源的抗耐藥微生物藥物的發(fā)現(xiàn)，仍然還有很多瓶頸亟待解決，尤其面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)在于如何建立有效的分離活性菌株的策略。因?yàn)榛诤Ａ控S富的的微生物資源，現(xiàn)有的常規(guī)培養(yǎng)基及分離方法已經(jīng)很難滿足我們對(duì)活性菌株的尋找，如何模擬內(nèi)生菌生長條件的原位培養(yǎng)策略以及對(duì)極端環(huán)境生存的內(nèi)生菌的關(guān)注有望成為發(fā)現(xiàn)具有抗耐藥微生物活性菌株的可靠手段。此外，植物的選擇也是至關(guān)重要的，那些具有藥用特性的藥用植物應(yīng)該優(yōu)先考慮；而且有必要了解植物內(nèi)生菌的生理生化特性及其在植物體內(nèi)的防御作用和次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生能力，這有利于活性化合物的尋找和開發(fā)。植物內(nèi)生菌作為抗耐藥微生物創(chuàng)新藥發(fā)現(xiàn)的重要微生物資源，盡管已經(jīng)顯示出了誘人的開發(fā)潛力，但是未來對(duì)其開發(fā)和利用還有很漫長的路要走。隨著人們對(duì)內(nèi)生放線菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物活性物質(zhì)研究的不斷深入，相信會(huì)有更多、活性更強(qiáng)的活性成分被發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物活性成分的研究無疑將具有廣闊的應(yīng)用前景。