嚴(yán)慧 胡文悅 宋曉晴 紀(jì)守坤 劉萱 黃卓涵 劉月琴 張英杰

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071000）

反芻動(dòng)物的瘤胃被認(rèn)為是纖維素物質(zhì)降解效率最高的天然場(chǎng)所之一，瘤胃微生物資源的開(kāi)發(fā)已受到國(guó)內(nèi)外研究者半個(gè)多世紀(jì)的關(guān)注［1］。隨著二代高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，越來(lái)越多未培養(yǎng)微生物被揭開(kāi)面紗，瘤胃微生物群落型態(tài)與動(dòng)物的健康［2］和生產(chǎn)性能［3］息息相關(guān)。隨著微生物組學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的“不可培養(yǎng)微生物”被揭開(kāi)面紗，但“不可培養(yǎng)”也成為其應(yīng)用的阻礙。因此，對(duì)提高飼料消化效率、降低腹瀉、降解毒素等菌種資源的開(kāi)發(fā)利用，再度成為近些年的研究熱點(diǎn)。自瘤胃厭氧培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展以來(lái)，國(guó)內(nèi)外用于瘤胃細(xì)菌培養(yǎng)的方法多種多樣，因此，本文將針對(duì)國(guó)內(nèi)外自瘤胃菌群厭氧培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展以來(lái)的相關(guān)報(bào)道，圍繞瘤胃細(xì)菌的分離培養(yǎng)步驟及特定功能菌的分離培養(yǎng)方法做一綜述。

1 瘤胃細(xì)菌分離的基本流程

1.1 瘤胃液采集

動(dòng)物屠宰后，將瘤胃剖開(kāi)采集瘤胃液；對(duì)于安裝有瘤胃瘺管的動(dòng)物，可從瘺管口處采集瘤胃內(nèi)容物［4］。另外，瘤胃液也可以采用從口腔［5］插入瘤胃管的方式采集，采樣管的插入深度影響所采集瘤胃液的微生物發(fā)酵能力，對(duì)于奶牛來(lái)說(shuō)，插入200 cm能夠采集到瘤胃中央的樣品，最具代表性，pH、VFA、氨態(tài)氮、離子濃度與通過(guò)瘤胃瘺管采集的樣品無(wú)顯著差異，180 cm插入深度采集的樣品VFA、鈣、磷、鉀濃度顯著偏低［6］。成年牛羊分別有不同尺寸的不銹鋼瘤胃管，犢?？墒褂贸赡暄虻牟讳P鋼瘤胃管，另外也可使用不同尺寸的硬質(zhì)PVC管（Polyvinylchlorid，主要成分為聚氯乙烯）采集瘤胃液［7］，PVC管法同樣適用于新生羔羊。操作時(shí)，應(yīng)注意避免插入氣管中。

1.2 瘤胃液運(yùn)輸

為保持瘤胃液的厭氧環(huán)境，采集后通常立即注入提前充滿CO2的密封滅菌容器中［8-9］。為保持與瘤胃內(nèi)部相似的條件，部分研究者采用37-39℃恒溫運(yùn)輸［10-12］，有研究者為保持菌株的活力，采用4℃［13］或冰?。?4］低溫運(yùn)輸。有研究者添加保護(hù)劑（甘油∶厭氧稀釋液=7∶3）于瘤胃液中［15］，可在運(yùn)輸途中維持厭氧環(huán)境。

1.3 瘤胃液勻漿（可選）

為使得飼料表面附著的微生物脫離，可在過(guò)濾前采用勻漿10 s的處理［16］，飼料顆粒附著菌的脫離有助于研究者分離到更豐富的微生物菌群。

1.4 瘤胃液過(guò)濾

運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，立即過(guò)濾飼料殘?jiān)?，可采?層［17］、4層［18-20］、6層無(wú)菌紗布［21］，4層紗布的處理方法最為常見(jiàn)。需要注意的是，為分離嚴(yán)格厭氧的微生物，應(yīng)迅速往濾液中通入CO2直至飽和［18］，所得濾液用于微生物分離培養(yǎng)。

1.5 瘤胃液離心（可選）

為去除飼料殘?jiān)屠w毛蟲(chóng)，可將瘤胃液500-600 r/min低速離心10 min［22-25］。但是，由于飼料顆粒表面附著的細(xì)菌占比較高，瘤胃液不經(jīng)過(guò)濾和離心處理，可以分離出更為豐富的細(xì)菌群落［24］。

1.6 瘤胃液保存

若運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后不能立即進(jìn)行分離，可將瘤胃液添加保護(hù)劑后凍存在-20℃［9］，后續(xù)再進(jìn)行菌株分離。

1.7 菌株富集

為增加目標(biāo)菌群的豐度，部分研究者在稀釋涂布之前先進(jìn)行菌群的富集培養(yǎng)［26］，即增菌培養(yǎng)。由于不同微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求有偏好性，使用特定底物對(duì)某類微生物進(jìn)行前期富集，或者添加某種抑制其他細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，可以大幅提高目標(biāo)微生物比例，降低其它微生物類群比例。例如，為分離纖維素酶分解菌，首先進(jìn)行纖維素降解菌的富集，不同研究者使用的富集培養(yǎng)基各異，有以葡萄糖［7］、纖維二糖［27］、羧甲基纖維素鈉［16］、濾紙［28］、微晶纖維素［19］作為主要碳源進(jìn)行菌群富集［29］的研究，可富集一次，也可進(jìn)行二次富集。另外，可通過(guò)添加醋酸鈉抑制其他菌的生長(zhǎng)而對(duì)乳酸菌無(wú)害［30］，從而實(shí)現(xiàn)乳酸菌的富集?？傊?，經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)，可以大幅提升目標(biāo)菌株的相對(duì)比例，提高分離效率。

1.8 稀釋涂布

富集之后通過(guò)稀釋涂布分離菌株，一般選用 10-4-10-6稀釋梯度進(jìn)行涂布［31］。也可不經(jīng)過(guò)富集步驟，直接使用無(wú)菌生理鹽水對(duì)濾液進(jìn)行稀釋后涂布［32-33］。另外，涂布之前也可向瘤胃液中加入無(wú)菌生理鹽水和無(wú)菌玻璃珠，打散樣品后再進(jìn)行稀釋涂布［34］，起到與第3步10 s勻漿類似的洗脫部分飼料附著微生物的效果。

1.9 菌株初篩

經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)后，使用選擇性底物［7，27］制備的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行分離初篩，培養(yǎng)溫度常選用37℃［18，35］、38℃［11］、39℃［17］或40℃［36］，接近瘤胃的真實(shí)溫度。

1.10 菌株純化

在生長(zhǎng)出菌落后，挑出單菌落，使用初篩培養(yǎng)基進(jìn)行劃線純化，反復(fù)進(jìn)行幾次，直至獲得純培養(yǎng)。

1.11 菌株復(fù)篩

獲得菌株純培養(yǎng)后，可使用發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)功能菌株進(jìn)行復(fù)篩，例如通過(guò)DNS比色法測(cè)定纖維素酶活［29］進(jìn)一步篩選纖維素高效降解菌株。另外，在瘤胃液梯度稀釋后，也可選擇營(yíng)養(yǎng)豐富的非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行無(wú)差別分離，“地毯式”分離出能夠培養(yǎng)出的所有菌株，保存后再進(jìn)行特定功能菌株的篩選鑒定。

1.12 菌株保藏

目標(biāo)菌株經(jīng)過(guò)純化和篩選之后，需要保藏菌種，一方面是保藏菌種資源，另一方面保藏原種防止其在不斷傳代過(guò)程中發(fā)生退化。菌種長(zhǎng)期保藏的方法有-80℃保藏和冷凍真空保藏，-80℃保藏需要添加保護(hù)劑，包括甘油、吐溫-80、DMSO等，劉玉承［27］研究發(fā)現(xiàn)甘油的保藏效果最好，其中以10%的甘油保存效果最佳，也有使用15%［37］、20%［38］或40%［39］濃度的甘油進(jìn)行菌株保藏。不同菌種對(duì)超低溫冷凍保藏保護(hù)劑的偏好不同，保藏效果不僅與保護(hù)劑種類及濃度有關(guān)，也與菌種類別有關(guān)［40］，筆者建議參考最相近菌種的保藏方法。除了冷凍低溫保存，也可采用真空保存，將菌種加入牛奶等保護(hù)劑，經(jīng)過(guò)冷凍真空干燥制成菌粉，保存在真空安培管中，放置在4℃下長(zhǎng)期保存［41-42］，相對(duì)超低溫保存來(lái)說(shuō)更便于攜帶和郵寄。另外，菌種的短期保藏可選用試管斜面，菌體長(zhǎng)成后，將斜面菌種置于4℃保存，方便菌種的隨時(shí)取用、活化和實(shí)驗(yàn)，此方法可保存1-3個(gè)月，時(shí)間過(guò)久易發(fā)生菌種退化或死亡，需要進(jìn)行定期活化［39］。

2 特定功能細(xì)菌的分離篩選方法

有目的地分離目標(biāo)菌株可用于特定功能工業(yè)菌株的高效篩選，選擇性培養(yǎng)基分離法是目前分離瘤胃細(xì)菌的常用方法。

2.1 培養(yǎng)基的基本成分組成

培養(yǎng)基的配方多種多樣，同一種培養(yǎng)基也可進(jìn)行組分改良［43］，但是總體來(lái)說(shuō)，瘤胃細(xì)菌分離培養(yǎng)基成分可以總結(jié)為幾大要素：緩沖液系統(tǒng)、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和礦物質(zhì)、厭氧指示劑、固化劑。其中無(wú)機(jī)鹽和礦物質(zhì)可以使用不同的無(wú)機(jī)化合物配比，也可以在無(wú)機(jī)化合物配比的基礎(chǔ)上，添加一定含量的無(wú)菌瘤胃液，增加微生物原生環(huán)境中的微量元素和生長(zhǎng)因子。使用不同培養(yǎng)基分離出的細(xì)菌種類見(jiàn)表1。碳源和氮源的改變可以制備功能不同的選擇性培養(yǎng)基，例如，不添加氮源的培養(yǎng)基可用來(lái)分離固氮細(xì)菌［44］：纖維素作為唯一碳源可用來(lái)分離纖維素降解菌［19］；淀粉作為唯一碳源，用來(lái)分離淀粉降解菌［72-73］；尿素作為唯一氮源，用來(lái)分離尿素分解菌［59］。雖然如此，使用選擇培養(yǎng)基分離出的細(xì)菌不一定都屬于目標(biāo)菌株，Hobson等［74］發(fā)現(xiàn)甘油唯一碳源培養(yǎng)基分離出的細(xì)菌有些并不能利用甘油，僅僅能夠利用酵母膏和瘤胃液生長(zhǎng)，因此，分離出的菌株均需進(jìn)一步復(fù)篩，驗(yàn)證其生長(zhǎng)性能和功能。

表1 培養(yǎng)基類型及分離細(xì)菌Table 1 Types of culture medium and isolated bacteria

2.2 纖維素降解菌的分離

纖維素降解菌培養(yǎng)基的底物主要分為不可溶性和可溶性纖維素。羧甲基纖維素鈉（CMC）被廣泛用作分離纖維素降解菌的碳源［33，45，75］，其溶于水，能夠均勻分布在培養(yǎng)基中，還可以配合剛果紅染色，根據(jù)透明圈的直徑大小初步篩選纖維素降解菌［19］。另外，纖維二糖作為纖維素的基本結(jié)構(gòu)單元，可被β-葡萄糖苷酶水解為2分子D-（+）-葡萄糖，溶于水，也常被用于纖維素降解菌富集、分離、純化培養(yǎng)基的制備以及作為檢測(cè)β-葡萄糖苷酶活性的底物。此外，也可使用不可溶纖維素制備分離培養(yǎng)基，Hungate采取酸處理加球磨震蕩的方法處理濾紙和脫脂棉［76］，使其均勻分布在培養(yǎng)基中。稻秸［18］、玉米秸稈［18］、木屑［18］、微晶纖維素［13，77-78］等經(jīng)處理后也都可被用作纖維素降解菌培養(yǎng)基的底物，Jung等［79］發(fā)現(xiàn)使用濾紙作為底物，相比較處理過(guò)的牧草來(lái)說(shuō)，能夠分離到更多的纖維素降解菌，可能由于濾紙中的纖維素相對(duì)牧草更容易被降解。但是，自然界中的纖維素往往伴隨有半纖維素和木質(zhì)素等同時(shí)存在，使用CMC等作為底物篩選出的菌有些并不能降解自然界中真正的不可溶纖維素，不可溶纖維素篩選出的菌往往具有更健全的降解自然界纖維素的能力［80］，僅僅使用單一纖維素進(jìn)行纖維素降解菌的分離具有一定局限性。

2.3 木聚糖降解菌的分離

Butterworth等［81］使用小麥戊聚糖為碳源從瘤胃中分離到一株木聚糖降解菌，屬于丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）。Sewell等［56］以燕麥木聚糖為唯一碳源從厭氧發(fā)酵罐中分離到6株木聚糖降解菌，屬于溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）。張貝貝［57］使用以木聚糖為唯一碳源的初篩固體培養(yǎng)基從奶牛瘤胃中分離到4株木聚糖降解菌，其中酶活最高的一株屬于類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。Nyonyo等［82］以CMC為碳源，共分離到129株菌，其中105株菌具有木聚糖酶活性。Palakawong等［26］使用直鏈淀粉作為唯一碳源，分別從牛和羊瘤胃中鑒定到兩個(gè)新種：產(chǎn)琥珀酸放線桿菌未定種（Actinomyces succiniciruminis sp. nov.）和甘油放線菌未定種（Actinomyces glycerinitolerans sp. nov.），均具有木聚糖降解活性。Simunek等［83］使用CMC為碳源的培養(yǎng)基從赤鹿瘤胃中分離到一株嚴(yán)格厭氧的木聚糖降解菌，同時(shí)具有纖維素降解活性。能夠降解纖維素的菌株大部分也能夠分泌木聚糖酶，以丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）的菌株為代表。

2.4 乳酸菌的分離

乳酸菌常被用作益生菌的開(kāi)發(fā)來(lái)源，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。MRS是分離乳酸菌的常用培養(yǎng)基，制備MRS固體培養(yǎng)基時(shí)添加CaCO3，可通過(guò)溶鈣圈的形成初步篩選乳酸菌［64］。Ghali等［84］使用MRS培養(yǎng)基從駱駝和鹿的瘤胃液中分離到8株牛鏈球菌（Streptococcus bovis），牛鏈球菌被認(rèn)為是產(chǎn)生乳酸的關(guān)鍵菌株之一。徐鳳等［65］使用MRS培養(yǎng)基從山羊胃腸道中分離到5個(gè)屬9個(gè)種的乳酸菌類群。王德光［64］從山羊瘤胃液、皺胃液等18種不同來(lái)源中共分離到75株乳酸菌，分屬于11個(gè)種。分離乳酸菌也可使用SL培養(yǎng)基，楊龍龍［30］使用SL固體培養(yǎng)基分離、MRS培養(yǎng)基純化共獲得60株乳酸菌：包括嗜酸乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和乳明串珠菌。Jensen等［85］使用SL、Brihhs和強(qiáng)化脫脂牛奶3種培養(yǎng)基從瘤胃中共分離到168株乳酸菌：包括噬酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、短乳桿菌（L. brevis）、布氏乳桿菌（L. buchneri）、干酪乳桿菌（L. casei）、發(fā)酵乳桿菌（L. fermenti）、植物乳桿菌（L. plantarum）。

2.5 蛋白質(zhì)降解菌的分離

蛋白降解菌通常以蛋白質(zhì)作為主要氮源進(jìn)行菌株分離。Mcsweeney等［86］使用BHI（腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基）配合單寧分離菌株，使用RHS培養(yǎng)基配合HCL沖洗，篩選出數(shù)株蛋白降解菌，其中一株蛋白降解效率最高的菌株屬于肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridium botulinum）。Blackburn等［58］以酪蛋白為主要氮源并添加多種碳源從羊瘤胃中分離蛋白降解菌，包括嗜淀粉擬桿菌（Bacteroides amylophilus）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、新月形單胞菌屬（Selenomonas）、毛螺旋菌屬（Lachnospira）和一些未知種，蛋白降解的功能不局限于某一類菌，瘤胃中很多菌都能夠不同程度的降解蛋白。盧玉飛［15］以酪蛋白為主要氮源的培養(yǎng)基對(duì)蛋白降解菌進(jìn)行富集，通過(guò)組學(xué)技術(shù)探究了奶牛瘤胃蛋白降解菌的主要細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

2.6 非蛋白氮降解菌的分離

非蛋白氮幾乎不能被豬、禽等非反芻動(dòng)物利用，但能夠被反芻動(dòng)物很好的利用，瘤胃微生物能夠?qū)⒎堑鞍椎到鉃榘?，再利用氨合成真蛋白，是降低反芻動(dòng)物飼料成本的重要途徑之一。Bellingham等［60］使用雙縮脲作為非蛋白氮來(lái)源，從瘤胃中分離到一株能夠在瘤胃中降解雙縮脲的菌株。John等［87］從飼喂了尿素的奶牛瘤胃中分離到一株尿素降解菌，屬于反芻月形單胞菌（Selenomonas ruminantium）。Cook［59］以尿素作為培養(yǎng)基氮源，從綿羊瘤胃中分離尿素降解菌，但分離的1 200株細(xì)菌中只有6株具有尿素降解活性，包括葡萄球菌屬（Staphylococcus），干酪乳桿菌（L. casei）和產(chǎn)氣克雷伯氏菌（Kleisiella aerogenes），其它菌株屬于依靠培養(yǎng)基中其它成分生長(zhǎng)的菌株；另外，通過(guò)富集培養(yǎng)，還分離到一株尿素降解活性最高且在瘤胃中豐度較高的糞鏈球菌（Streptococcus faecium）。非蛋白氮降解菌的分離篩選和應(yīng)用有助于提高反芻動(dòng)物對(duì)非蛋白的利用效率，降低飼料成本。

2.7 甲烷氧化菌的分離

甲烷氧化菌能夠利用甲烷，降低甲烷排放，通常使用甲醇或甲烷作為唯一碳源進(jìn)行分離。劉歡［88］使用以甲醇為唯一碳源的NMS液體培養(yǎng)基進(jìn)行甲烷氧化菌的富集，若富集成功培養(yǎng)液呈現(xiàn)粉色，再使用NMS固體平板配合甲烷通入進(jìn)行分離，純化后得到一株甲基桿菌屬（Methylobacterium）的甲烷氧化菌。高效率的甲烷氧化菌的生產(chǎn)應(yīng)用有助于降低反芻動(dòng)物甲烷排放，減少溫室氣體排放量，保護(hù)環(huán)境。

2.8 毒害物質(zhì)降解菌的分離

有些粗飼料本身含有活性毒性成分，如氟乙酸鈉、單寧、棉酚等，飼料由于儲(chǔ)存不當(dāng)也容易發(fā)生霉變，產(chǎn)生霉菌毒素，對(duì)動(dòng)物機(jī)體健康及生產(chǎn)性能造成影響。Intanoo等［10］從牛瘤胃中分離得到降解黃曲霉毒素B1的菌株，包括3株酵母菌和3株細(xì)菌，細(xì)菌屬于屎腸球菌（Enterococcus faecium）、熒光棒桿菌（Corynebacterium phoceense）和瘤胃棒桿菌（C. vitaeruminis）。另外，分離培養(yǎng)基中添加200 ng/mL的毒素，發(fā)酵后使用ELISA方法可檢測(cè)剩余毒素含量，毒素降解菌的開(kāi)發(fā)利用可用于降低飼料中的毒素污染。Zhang等［17］使用棉酚唯一碳源培養(yǎng)基從牛瘤胃液中分離到一株降解棉酚的枯草芽孢桿菌（Ba- cillus subtilis），對(duì)棉籽粕的發(fā)酵具有應(yīng)用潛力。李興芳等［71］從山羊瘤胃中分離單寧降解菌，首先使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基過(guò)夜富集，再使用不同濃度單寧的固體平板進(jìn)行分離純化，使用沒(méi)食子酸丙酯作為底物測(cè)定單寧酶的活力，復(fù)篩得到4株降解單寧的菌株，分別屬于產(chǎn)堿普羅威登斯菌（Providencia alcalifaciens）、克氏菌屬（Kerstersia）、普羅威登菌屬（Providencia sp.）和綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。Sharma等［89］使用單寧培養(yǎng)基從山羊瘤胃中分離到3株單寧降解菌，屬于變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）（2株）和肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae），且能降解9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮，一種植物毒素。氟乙酸鈉是植物中的一種活性毒性成分，Camboim等［90］和Pimentel等［36］分別使用添加有氟乙酸鈉的培養(yǎng)基，從瘤胃中各分離到2株降解氟乙酸鈉的菌株，分別屬于Pigmentiphaga kullae、Ancylobacter dichloromethanicus和糞腸球菌（Entero- coccus faecalis）、芽孢桿菌屬未知種（Bacillus sp.）。

2.9 產(chǎn)脂肪酶菌株的分離

Hobson等［74］使用亞麻籽油作為培養(yǎng)基碳源，添加綿羊腮腺唾液作為亞麻籽油的乳化劑，使得脂肪在培養(yǎng)基中均勻分布。Faruque等［91］使用三丁酸甘油酯和三油酸甘油酯作為培養(yǎng)基中的能量來(lái)源，從牛瘤胃中分離到3株脂肪酶降解菌。Henderson［92］以三月桂酸甘油酯作為碳源，進(jìn)行脂肪降解菌的分離，具有脂肪酶活性的細(xì)菌會(huì)在培養(yǎng)基上形成明顯的透明圈。韓生義等［93］以橄欖油為唯一碳源，以中性紅為指示劑，從牦牛瘤胃中篩選到6株產(chǎn)脂肪酶高活力的菌株，包括液化沙雷氏菌和真菌。Priji等［94］使用花生油作為能源物質(zhì)，使用超聲法使得花生油在培養(yǎng)基中形成懸濁液，分離到一株脂肪酶產(chǎn)生菌，且后續(xù)驗(yàn)證該菌株還能夠產(chǎn)生鼠李糖酯類生物表面活性劑［95］，有較高的生產(chǎn)應(yīng)用潛力。

2.10 產(chǎn)琥珀酸及蛋氨酸菌株的分離

產(chǎn)琥珀酸和產(chǎn)蛋氨酸的菌株，可用于琥珀酸或蛋氨酸的生產(chǎn)發(fā)酵。李興江等［69］使用添加地克球利的琥珀酸鈉富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，結(jié)合溴甲酚綠中性平板分離獲得300株產(chǎn)酸菌，再通過(guò)薄層色譜法點(diǎn)樣篩選到31株產(chǎn)琥珀酸能力的菌株，能力最強(qiáng)的菌株來(lái)自于腸膜明串珠菌。陳曉暉［70］使用以葡萄糖和玉米漿為主要碳源的富集培養(yǎng)基進(jìn)行菌群富集，在富集培養(yǎng)基中添加莫能菌素和富馬酸鈉，以促進(jìn)琥珀酸產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)，減少?gòu)?fù)篩壓力，后使用添加了溴甲酚綠的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行菌株分離，產(chǎn)酸菌的菌落周圍可變?yōu)辄S色，結(jié)合薄層色譜最終從牛瘤胃中篩選獲得28株產(chǎn)琥珀酸菌。另外，王鐵良等［96］使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離到18株菌，通過(guò)后續(xù)的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)測(cè)定蛋氨酸產(chǎn)量，復(fù)篩到3株能夠產(chǎn)蛋氨酸的菌株，產(chǎn)量最高者屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。

3 已分離到的瘤胃菌株現(xiàn)狀

從瘤胃中鑒定出的菌株數(shù)量眾多，包括許多新種，從瘤胃中鑒定出的新種有產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（Actinomyces succiniciruminis sp. nov.）［26］、甘 油放 線 菌（Actinomyces glycerinitolerans sp. nov.）［26］、反芻小單胞菌（Micromonospora ruminantium sp. nov.）［97］、反 芻 庫(kù) 特 氏 菌（Kurthia ruminicola sp. nov）［32］、反芻白桿菌（Leucobacter ruminantium sp. nov.）［98］、六 角 巨 球 菌（Megasphaera hexanoica sp. nov.［99］、Oscillibacter ruminantium sp. nov.［35］。近 些年，高通量和菌株分離均表明，瘤胃中仍存在眾多未定種等待被分離、鑒定和功能挖掘。瘤胃作為纖維素發(fā)酵的重要場(chǎng)所，纖維素降解菌的分離是重中之重，也是目前瘤胃細(xì)菌分離工作的研究重心。目前已從瘤胃中分離到多種纖維素降解菌，包括反芻小單胞菌（Micromonospora ruminantium sp.nov.）［97］、大 腸 桿 菌（Escherichia coli）［19］、溶纖 維 擬 桿 菌（Cillobacterium cellulosolvens）［100］、溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）［101］、白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）［101-102］、黃色瘤胃球菌（R. flavefaciens）［11，101-102］、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobacter succinogenes）［原命名產(chǎn)琥珀酸擬桿菌（Bacteroides succinogenes）］［76］、地 衣 芽 胞 桿 菌（Bacillus licheniformis）［75］、腸桿菌屬（Enterobacter）［45］、志賀氏菌屬（Shigella）［103］等。目前認(rèn)為瘤胃中最重要的3種纖維素降解菌是產(chǎn)琥珀酸絲狀桿 菌（Fibrobacter succinogenes）、白 色 瘤 胃 球 菌（Ruminococcus albus）和黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）［82］。總體來(lái)說(shuō)，從瘤胃中分離出的纖維素降解好氧菌主要屬于放線菌門（Actinobacteria），厭氧菌主要屬于厚壁菌門（Firmicutes）［104］，具有纖維素降解能力的菌株分布廣泛，但是纖維素降解能力極強(qiáng)的菌株篩選工作仍需要不斷探索。

4 目前分離方法的改進(jìn)與建議

瘤胃的自然環(huán)境中有特定的營(yíng)養(yǎng)、溫度、濕度、氣體條件，在實(shí)驗(yàn)室人工模擬的條件下，很難完全重現(xiàn)瘤胃內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境。因此，配制的人工培養(yǎng)基可能適合其中某幾類菌的生長(zhǎng)，卻由于營(yíng)養(yǎng)或氣體條件等的限制，導(dǎo)致大量的瘤胃微生物仍然無(wú)法被培養(yǎng)出來(lái)，或者培養(yǎng)出來(lái)后極易死亡。因此，目前用于瘤胃細(xì)菌分離的培養(yǎng)方法仍有可改進(jìn)的進(jìn)步空間。

4.1 嚴(yán)格厭氧環(huán)境的控制

大部分的瘤胃細(xì)菌包括腸道細(xì)菌都屬于嚴(yán)格厭氧菌，嚴(yán)格厭氧的操作環(huán)境是保障能夠分離到瘤胃關(guān)鍵菌株的重要條件之一。由于嚴(yán)格厭氧環(huán)境的控制較難，嚴(yán)格厭氧菌即使分離出來(lái)，在保藏和傳代的過(guò)程中由于條件控制不當(dāng)也極易死亡。傳統(tǒng)的Hungate滾管法具有較好的控制嚴(yán)格厭氧的效果，但是挑取單菌落的純化過(guò)程仍然不易操作［27］，限制了此方法的應(yīng)用。近些年厭氧工作站的發(fā)展同時(shí)兼顧到了厭氧條件的控制和純化過(guò)程的便捷，目前也有更多的實(shí)驗(yàn)室有條件通過(guò)厭氧工作站開(kāi)展培養(yǎng)工作，為瘤胃中大量嚴(yán)格厭氧菌種資源的獲取創(chuàng)造了技術(shù)條件。

4.2 營(yíng)養(yǎng)組分的限制

培養(yǎng)基的組分不能完全模擬瘤胃自然發(fā)酵狀態(tài)下的營(yíng)養(yǎng)成分狀態(tài)，也是限制瘤胃菌種資源開(kāi)發(fā)的重要因素之一。更接近瘤胃液營(yíng)養(yǎng)條件的培養(yǎng)基配比往往能夠分離出多樣性更豐富的菌群，但由于大多數(shù)培養(yǎng)基成分需具有可溶性或均一性的限制，很多飼料并不能被直接制備成培養(yǎng)基，因此，無(wú)菌瘤胃液的添加至關(guān)重要［74］。無(wú)菌瘤胃液可以在實(shí)驗(yàn)室條件為菌株生長(zhǎng)提供必要的微量元素和生長(zhǎng)因子，研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加無(wú)菌瘤胃液能夠顯著加快菌株生長(zhǎng)速度，同時(shí)也能夠支持更多樣的菌株生 長(zhǎng)［18，105］。瘤胃液可以從屠宰場(chǎng)大量獲得，經(jīng)過(guò)離心滅菌后，凍存?zhèn)溆谩３藷o(wú)菌瘤胃液的添加，另有研究表明培養(yǎng)基中的瓊脂可能會(huì)對(duì)部分微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，使用結(jié)蘭膠為固化劑的培養(yǎng)基所分離到的菌群相比較瓊脂擁有更高的Chao1指數(shù)，能夠支持更多樣的菌株生長(zhǎng)［82］，結(jié)蘭膠對(duì)瓊脂的一定程度的替代仍需進(jìn)一步研究。

4.3 菌株生長(zhǎng)速度限制

生長(zhǎng)速度快的菌株首先形成菌落，被優(yōu)先分離出來(lái)，而生長(zhǎng)慢的菌株被生長(zhǎng)速度快的菌株覆蓋，生長(zhǎng)不起來(lái)。Jone等［87］在37℃厭氧條件下培養(yǎng)尿素分解菌大都需要1-2周的時(shí)間形成菌落，Van［106］提出使用選擇性培養(yǎng)基需要在39℃培養(yǎng)4周，使用非選擇性培養(yǎng)基需要培養(yǎng)1周。Battumur等［107］從瘤胃中分離菌株需要在38℃培養(yǎng)2周。因此，在進(jìn)行瘤胃菌株分離培養(yǎng)時(shí)，適當(dāng)延長(zhǎng)菌株分離的培養(yǎng)時(shí)間，可以兼顧到一些生長(zhǎng)速度較慢的菌株。

5 展望

國(guó)內(nèi)外對(duì)于瘤胃菌種資源的開(kāi)發(fā)已開(kāi)展了半個(gè)世紀(jì)之久，但已經(jīng)被開(kāi)發(fā)利用的菌種資源非常有限，瘤胃中仍有廣袤的資源等待被挖掘。國(guó)際和國(guó)內(nèi)瘤胃菌種資源庫(kù)的建立和共享，是未來(lái)瘤胃菌種資源開(kāi)發(fā)的必然趨勢(shì)。除了傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)，以原位培養(yǎng)、共培養(yǎng)、高通量微滴培養(yǎng)等為代表的最新技術(shù)也逐漸興起，原位培養(yǎng)通過(guò)模擬目標(biāo)微生物的自然生活環(huán)境來(lái)培養(yǎng)微生物，解除了人工培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的限制，濾膜允許小分子物質(zhì)通過(guò)的同時(shí)可阻擋微生物，從而實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜的原生環(huán)境下獲得純培養(yǎng)。共培養(yǎng)技術(shù)利用輔助微生物提供必要的營(yíng)養(yǎng)代謝產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)“未培養(yǎng)微生物”的培養(yǎng)。高通量微滴培養(yǎng)利用微滴技術(shù)可從一個(gè)環(huán)境樣本中實(shí)現(xiàn)10 000多個(gè)菌株的培養(yǎng)。但最新的培養(yǎng)技術(shù)仍在探索和完善中，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法仍是目前絕大部分實(shí)驗(yàn)室使用的主流技術(shù)，且不可被替代。本綜述針對(duì)瘤胃細(xì)菌的分離培養(yǎng)流程及功能菌的分離方法進(jìn)行了總結(jié)歸納，分離流程的總結(jié)梳理對(duì)于瘤胃菌種資源開(kāi)發(fā)利用和資源庫(kù)的擴(kuò)建具有重要的應(yīng)用價(jià)值和借鑒意義。