劉娜 劉世科 王倩男

（海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228）

膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）寄主廣泛，其多個(gè)不同的生理小種能夠侵染諸如橡膠樹(shù)、香蕉、火龍果、香瓜、西瓜等多種經(jīng)濟(jì)作物，是造成農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的主要病害之一。深入研究膠孢炭疽菌的致病力機(jī)制，有助于新型防控措施的開(kāi)發(fā)。

細(xì)胞極性的確立和維持在真核生物的形態(tài)發(fā)生過(guò)程中起著重要的作用。絲狀真菌的分生孢子萌發(fā)后，菌絲呈現(xiàn)出明顯的極性生長(zhǎng)現(xiàn)象［1-3］。在這個(gè)極性生長(zhǎng)過(guò)程中，細(xì)胞壁及細(xì)胞膜前體物質(zhì)、細(xì)胞器以及囊泡等不斷運(yùn)輸匯集到菌絲頂端的特殊結(jié)構(gòu)（spitzenk?rper，Spk）［4］。Spk由密集的囊泡、細(xì)胞骨架、核糖體及其他多種物質(zhì)組成［5-6］；與此同時(shí)，Spk介導(dǎo)的菌絲頂端胞外物質(zhì)分泌也與真菌的生長(zhǎng)發(fā)育及致病力密切相關(guān)［7-8］。雖然目前關(guān)于Spk的形成及其機(jī)制還尚不清楚，但是普遍認(rèn)為細(xì)胞骨架在其中起著重要作用。細(xì)胞骨架廣泛存在于真核生物的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中。細(xì)胞骨架在細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長(zhǎng)等多項(xiàng)生理活動(dòng)中具有重要的功能。細(xì)胞質(zhì)骨架主要包括微絲、微管和中間纖維，其中關(guān)于微絲和微管的研究較多。微絲（microfilament）是由單體肌動(dòng)蛋白（actin）呈螺旋狀排列組裝而成；微管（microtubule）是由α-微管蛋白（tubulin）和β-微管蛋白通過(guò)非共價(jià)鍵連接組成的中空管狀結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞內(nèi)，微絲和微管均處于聚合和解聚的高度動(dòng)態(tài)循環(huán)中，而這一動(dòng)態(tài)過(guò)程分別受一系列微絲結(jié)合蛋白（actin binding protein，ABP）和微管結(jié)合蛋白（microtubule associated protein，MAP）的精密調(diào) 控［9-10］。至今為止，尚未有關(guān)膠孢炭疽菌細(xì)胞骨架研究的相關(guān)報(bào)道。

Lifeact是來(lái)自出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）ABP140（actin binding protein 140）一段17個(gè)氨基酸的多肽，其序列被廣泛用作真核生物細(xì)胞內(nèi)微絲骨架標(biāo)記探針［11-12］，已有研究結(jié)果表明Lifeact能很好的標(biāo)記出稻瘟菌、灰霉菌等真菌細(xì)胞中的微絲骨架結(jié)構(gòu)［13-14］。而在微管研究中發(fā)現(xiàn)，鼠微管相關(guān)蛋白MAP4（microtubule associated protein 4）的微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域MBD（microtubule binding domain）能很好的標(biāo)記出植物細(xì)胞內(nèi)微管的結(jié)構(gòu)［12，15］。因此，本研究構(gòu)建了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP（enhanced green fluorescent protein）與Lifeact及MBD的融合表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化膠孢炭疽菌并獲得了相應(yīng)的重組菌株。與此同時(shí)，還在膠孢炭疽菌β-微管蛋白（β-tubulin）編碼基因（CgTUB1）后面原位敲入了EGFP的編碼序列，構(gòu)建了CgTUB1-EGFP標(biāo)記菌株。顯微觀(guān)察及生理表型分析結(jié)果表明，所構(gòu)建的Lifeact-EGFP及CgTUB1-EGFP的重組菌株的微絲及微管骨架標(biāo)記清晰，為進(jìn)一步研究膠孢炭疽菌細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化及骨架結(jié)合蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌野生型菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存，并在前期工作中完成該菌株的基因組測(cè)序工作。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)所用基因表達(dá)載體pPgTH由本實(shí)驗(yàn)室改造，以pMD19-T為骨架，在Pst I和Xba I位點(diǎn)處連入構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子PgpdA，在Sac I和EcoR I處連入構(gòu)巢曲霉色氨酸合成基因trpC的終止子（TtrpC）及潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶抗性基因（HPT）。PCR引物合成及DNA測(cè)序由華大基因及擎科生物公司完成。DNA聚合酶、DNA Marker及大腸桿菌感受態(tài)均購(gòu)自北京全式金公司，限制性?xún)?nèi)切酶及T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo Scientific公司，膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根公司。羧芐青霉素、卡那霉素購(gòu)自索萊寶公司，潮霉素購(gòu)自Roche公司，其它化學(xué)試劑采用國(guó)產(chǎn)分析純。膠孢炭疽菌的培養(yǎng)使用土豆浸膏培養(yǎng)基 （PDA，PDB）及基本培養(yǎng)基（minimal medium）。

1.2 方法

1.2.1 微絲骨架標(biāo)記載體的構(gòu)建 采用隨機(jī)重組原理敲入標(biāo)記基因，具體策略如圖1-A所示，將Lifeact與綠色熒光蛋白EGFP的融合編碼序列Lifeact-EGFP連入基因表達(dá)載體pPgTH的Xba I和Sac I位點(diǎn)，構(gòu)建微絲標(biāo)記載體。

1.2.2 微管骨架標(biāo)記載體的構(gòu)建 分別采用隨機(jī)重組原理及同源重組原理等兩種策略構(gòu)建兩種微管骨架標(biāo)記載體［16］。（1）將鼠MAP4的微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域MBD與綠色熒光蛋白EGFP的融合編碼序列MBDEGFP連入載體pPgTH的Xba I和SacI位點(diǎn)，構(gòu)建微管標(biāo)記載體（圖1-B）。（2）將膠孢炭疽菌β1 tubulin DNA序列CgTUB1的3'端序列（去除終止密碼子，853 bp）連入載體pPgTH的Xba I和Kpn I位點(diǎn)，將EGFP編碼序列連入Kpn I和Sac I位點(diǎn)，再使用引物CgTub-SF/hph-splR將這兩個(gè)片段與潮霉素抗性基因編碼序列（HPT）的5'端序列PCR擴(kuò)增備 用，所得產(chǎn)物為左側(cè)敲除片段；之后將HPT的3'端序列與CgTUB1的下游序列（flanking region，804 bp）進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增備用，所得產(chǎn)物為右側(cè)敲除片段；最后將兩個(gè)敲除片段共同轉(zhuǎn)化野生型菌株，將CgTUB1 DNA的3'端序列作為上游同源臂、CgTUB1的下游序列作為下游同源臂，利用同源重組原理將EGFP編碼序列原位敲入CgTUB1的下游，構(gòu)建敲入重組菌株（圖1-C）。

圖1 細(xì)胞骨架熒光標(biāo)記載體原理圖Fig. 1 Diagram of fluorescent labeled cytoskeleton vectors

1.2.3 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)［3］所述方法進(jìn)行。在轉(zhuǎn)化前，將Lifeact-EGFP、MBD-EGFP及CgTUB1-EGFP標(biāo)記載體用Pst I進(jìn)行酶切線(xiàn)性化處理。

1.2.4 重組菌株的鑒定 本實(shí)驗(yàn)中采用潮霉素（300 μg/mL）篩選轉(zhuǎn)化子。待轉(zhuǎn)化、再生培養(yǎng)后，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取其基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定。對(duì)于轉(zhuǎn)化過(guò)Lifeact-EGFP或MBD-EGFP的轉(zhuǎn)化子，以其基因組為模板，分別擴(kuò)增其基因組中是否已經(jīng)轉(zhuǎn)入目標(biāo)序列。對(duì)于CgTUB1-EGFP轉(zhuǎn)化子，為了檢測(cè)敲入重組菌株中EGFP編碼序列是否重組到CgTUB1基因后面，本實(shí)驗(yàn)中采用兩輪PCR檢測(cè)方法鑒定轉(zhuǎn)化子，在重組片段中的上游同源臂的外側(cè)及EGFP序列中設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物CgTub-JCF/EGFP-R；同理，再在下游同源臂的外側(cè)及抗性基因HPT序列中設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物HPT-JCF/CgTub-JC3R；通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)重組片段是否正確整合到目標(biāo)基因的位點(diǎn)（表1）。在獲得以上所述3種陽(yáng)性重組菌株后，通過(guò)單孢分離對(duì)篩選到的重組菌株進(jìn)行分離純化。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.5 激光掃描共聚焦顯微鏡觀(guān)察重組菌株中細(xì)胞骨架 將獲得的純合體重組菌株接種于PDB培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)2 d后，過(guò)濾收集孢子，用ddH2O洗滌2遍后重懸，再于激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察孢子內(nèi)微絲或微管骨架的分布情況。與此同時(shí)，將上述孢子接種于新鮮的PDB培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)24 h后，于激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察菌絲內(nèi)微絲或微管骨架的分布情況。所有熒光圖片均采自L(fǎng)eica SP8激光掃描共聚焦熒光顯微鏡。EGFP由Argon 激光器488 nm通道激發(fā)，檢測(cè)的發(fā)射波長(zhǎng)范圍是505-540nm。靜態(tài)層掃圖片的步距為0.5 μm。所有圖片均通過(guò)Image J 軟件進(jìn)行后期疊加及處理。

1.2.6 生長(zhǎng)速率及產(chǎn)孢量檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［3］所述方法進(jìn)行。

1.2.7 致病力分析 參照文獻(xiàn)［3］所述方法進(jìn)行。每個(gè)處理共包含30片葉片，分為3組。本實(shí)驗(yàn)共重復(fù)2次。

2 結(jié)果

2.1 重組菌株的鑒定

膠孢炭疽菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后分別獲得了多個(gè)具有潮霉素抗性的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。接著將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到PDA平板進(jìn)行培養(yǎng)，提取其DNA，并利用PCR檢測(cè)各轉(zhuǎn)化子。實(shí)驗(yàn)中共獲得了多個(gè)Lifeact-EGFP及MBD-EGFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)化子；分別隨機(jī)挑取4個(gè)轉(zhuǎn)化子，并用PCR擴(kuò)增檢測(cè)其基因組中是否已轉(zhuǎn)入Lifeact-EGFP或MBD-EGFP片段。結(jié)果這兩組轉(zhuǎn)化子均能檢測(cè)到目標(biāo)片段（圖2-A，B），表明標(biāo)記重組菌株構(gòu)建成功，分別將這兩組重組菌株命名為PgpdA∷Lifeact-EGFP和PgpdA∷MBD-EGFP。與此同時(shí)，挑取了10個(gè)CgTUB1-EGFP基因敲入重組轉(zhuǎn)化子，并對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行兩輪PCR檢測(cè)。結(jié)果有3個(gè)轉(zhuǎn)化子能夠同時(shí)成功擴(kuò)增出1 722 bp、1 648 bp大小的目標(biāo)條帶（圖2-C，D），且PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果也與預(yù)期結(jié)果一致，表明這3個(gè)轉(zhuǎn)化子均已在CgTUB1的DNA序列后面敲入了EGFP編碼序列，因此將這3個(gè)轉(zhuǎn)化子命名為CgTUB1-EGFP。之后通過(guò)單孢分離，分別獲得了PgpdA∷Lifeact-EGFP、PgpdA∷MBD-EGFP和CgTUB1-EGFP的純合體重組菌株。

圖2 細(xì)胞骨架熒光標(biāo)記重組菌株的PCR鑒定Fig. 2 PCR diagnosis of cytoskeleton labeling recombinant strains

2.2 重組菌株細(xì)胞骨架觀(guān)察

將上述獲得的PgpdA∷Lifeact-EGFP純合體重組菌株制片后置于共聚焦顯微鏡下觀(guān)察其微絲骨架。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在其孢子及菌絲細(xì)胞內(nèi)均能檢測(cè)到明顯的熒光，并且與只表達(dá)EGFP的對(duì)照菌株相比，重組菌株孢子內(nèi)微絲主要以點(diǎn)狀信號(hào)分布，也有少量絲狀結(jié)構(gòu)存在（圖3）。在菌絲中，可在其頂端觀(guān)察到明顯的微絲聚集現(xiàn)象，呈明顯的極性分部；此外在細(xì)胞中間部位，也能觀(guān)察到絲狀結(jié)構(gòu)（圖4）。以上結(jié)果表明Lifeact-EGFP能夠較好的標(biāo)記膠孢炭疽菌的微絲骨架。隨后，選擇了其中一株熒光強(qiáng)度較高的重組菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

將上述獲得的PgpdA∷MBD-EGFP及CgTUB1-EGFP純合體重組菌株制片后置于共聚焦顯微鏡下觀(guān)察其微管骨架。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PgpdA∷MBD-EGFP菌株細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度極低，難以觀(guān)測(cè)到其孢子及菌絲內(nèi)部的微管骨架結(jié)構(gòu)（結(jié)果未展示）；而CgTUB1-EGFP標(biāo)記重組菌株的孢子及菌絲細(xì)胞內(nèi)均能檢測(cè)到明顯的熒光。如圖3所示，與對(duì)照菌株相比，標(biāo)記菌株孢子內(nèi)的微管主要呈點(diǎn)狀和絲狀結(jié)構(gòu)。在菌絲內(nèi)部微管也呈現(xiàn)出較明顯的極性分布現(xiàn)象，此外，微管主要以點(diǎn)狀和絲狀分布于菌絲中間（圖4）。以上結(jié)果表明CgTUB1-EGFP能較好的標(biāo)記微管骨架。隨后，選擇了其中一株熒光強(qiáng)度較高的CgTUB1-EGFP重組菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 熒光標(biāo)記重組菌株孢子中的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)Fig. 3 Cytoskeleton structure in conidiophores of fluorescent labeled recombinant strains

圖4 熒光標(biāo)記重組菌株菌絲中的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)Fig. 4 Cytoskeleton structure in the hypha of fluorescent labeled recombinant strains

2.3 重組菌株生長(zhǎng)速率及產(chǎn)孢量檢測(cè)

在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，PgpdA∷Lifeact-EGFP、CgTUB1-EGFP重組菌株與野生型菌株相比，其菌落生長(zhǎng)速率及菌落形態(tài)都沒(méi)有顯著差別（圖5-A），在培養(yǎng)4 d后，菌落直徑均約為6 cm。與此同時(shí)，在液體PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，重組菌株的產(chǎn)孢量與野生型相比也沒(méi)有顯著變化，孢子產(chǎn)量都約為35×105個(gè)/mL（圖5-B）。

圖5 野生型菌株與重組菌株菌落直徑及產(chǎn)孢量Fig. 5 Clony diameters and conidiations of WT and mutant strains

2.4 重組菌株致病力分析

將PgpdA∷Lifeact-EGFP、CgTUB1-EGFP重組菌 株與野生型菌株同時(shí)接種橡膠樹(shù)葉片。在接種后，重組菌株與野生型菌株均能侵染橡膠樹(shù)葉片并造成病斑；與此同時(shí)，在接種2 d及3 d后，重組菌株與野生型菌株形成的病斑直徑均約為10 mm及20 mm（圖6）。表明重組菌株與野生型菌株致病力沒(méi)有明顯差異。

圖6 接種野生型菌株與重組菌株后橡膠樹(shù)葉片的發(fā)病情況及病斑直徑Fig. 6 Virulence assay on rubber tree leaves and lesion diameter after inoculation with WT and recombinant strains

3 討論

細(xì)胞骨架廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，并在其形態(tài)建成、物質(zhì)運(yùn)輸與極性生長(zhǎng)等方面有著重要的功能。絲狀真菌的生長(zhǎng)和發(fā)育主要依賴(lài)菌絲尖端的極性生長(zhǎng)，而這種極性生長(zhǎng)受到細(xì)胞內(nèi)骨架的嚴(yán)格調(diào)控［17-18］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究揭示了細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化在絲狀真菌形態(tài)發(fā)生與致病過(guò)程中的作用［19-21］。因此，要研究膠孢炭疽菌中細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化及相關(guān)蛋白功能，對(duì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架進(jìn)行熒光標(biāo)記和活體細(xì)胞觀(guān)察是必要的。由于actin-GFP（green fluorescent protein）難以加入到聚合的微絲中，若直接對(duì)actin進(jìn)行熒光標(biāo)記還會(huì)導(dǎo)致單體肌動(dòng)蛋白被標(biāo)記且呈現(xiàn)較強(qiáng)熒光背景［22］。此外，actin-GFP的表達(dá)嚴(yán)重影響了盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞（Dictyostelium）的胞質(zhì)分裂等生理生化活動(dòng)［22］。目前對(duì)于微絲骨架的活體細(xì)胞成像來(lái)說(shuō)，主要通過(guò)微絲結(jié)合蛋白來(lái)標(biāo)記F-actin，如擬南芥AtFIM1的微絲結(jié)合結(jié)構(gòu)域ABD2［23］，以及酵母ABP140的一段僅17個(gè)氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域Lifeact［24-29］。Delgado-Alvarez的相關(guān)研究表明，通過(guò)對(duì)粗糙脈孢霉（Neurospora crassa）多個(gè)微絲結(jié)合蛋白及其結(jié)構(gòu)域與綠色熒光蛋白GFP進(jìn)行融合表達(dá)，構(gòu)建了多種熒光標(biāo)記菌株：Fimbrin-GFP，ARP3-GFP，tropomyosin-GFP，Lifeact-GFP；結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的熒光標(biāo)記菌株能標(biāo)記出菌絲內(nèi)不同的微絲骨架結(jié)構(gòu)，但Lifeact-GFP能較好的標(biāo)記出菌絲不同部位的多種結(jié)構(gòu)［30］。此外，Lifeact也被廣泛用于其他真菌胞內(nèi)微絲骨架的標(biāo)記［13，31-33］。在此基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建了PgpdA∷lifeact-EGFP表達(dá)載體，通過(guò)膠孢炭疽菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化成功構(gòu)建了重組菌株，并對(duì)微絲骨架的三維立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了活體觀(guān)察。結(jié)果表明，在膠孢炭疽菌中微絲主要以點(diǎn)狀信號(hào)分布于孢子中，以點(diǎn)狀和絲狀結(jié)構(gòu)分布于菌絲中，且呈現(xiàn)出明顯的極性分布現(xiàn)象，這一結(jié)果也與其它真菌中觀(guān)察到的結(jié)果相類(lèi)似［13，30］。在絲狀真菌中，點(diǎn)狀微絲結(jié)構(gòu)是細(xì)胞內(nèi)吞作用的標(biāo)志［34］。稻瘟菌中菌絲頂端點(diǎn)狀微絲結(jié)構(gòu)的減少會(huì)導(dǎo)致胞吞作用明顯延遲，效應(yīng)因子分泌受阻，致病力受到嚴(yán)重的影響［35］。

而對(duì)于微管骨架，常用小鼠MAP4的MBD與熒光蛋白融合進(jìn)行標(biāo)記［15，36］，或直接用tubulin與熒光蛋白融合來(lái)標(biāo)記動(dòng)植物細(xì)胞中的微管骨架［37］；但是在不同生物的不同組織中，兩種標(biāo)記方法的效果不盡相同。在構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中，利用GFP-TUA（α-tubulin）菌株來(lái)觀(guān)察菌絲中的微管骨架結(jié)構(gòu)［38-39］。在粗糙脈孢霉中，β-tubulin-GFP被用來(lái)標(biāo)記胞內(nèi)的微管骨架［40］。在禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）中，多用FgTub1-GFP及FgTub2-GFP來(lái)標(biāo)記胞內(nèi)的微管骨架［21，41-42］。在本研究中分別使用了兩種方法對(duì)膠孢炭疽菌的微管結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記：構(gòu)建了PgpdA∷MBD-EGFP-TtrpC表達(dá)載體與CgTUB1基因位點(diǎn)后EGFP敲入載體，并通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化成功獲得重組菌株。結(jié)果表明，MBD-EGFP標(biāo)記重組菌株中熒光強(qiáng)度較低，而CgTUB1-EGFP標(biāo)記重組菌株熒光強(qiáng)度較高；與此同時(shí)，在CgTUB1-EGFP重組菌株孢子和菌絲中都可觀(guān)察到明顯的點(diǎn)狀和絲狀信號(hào)，且在菌絲尖端的微管骨架也呈現(xiàn)出一定的極性分布現(xiàn)象。

為了檢測(cè)兩種骨架標(biāo)記重組菌株是否會(huì)對(duì)膠孢炭疽菌正常的生理活動(dòng)產(chǎn)生影響，本研究分別選擇了兩株熒光強(qiáng)度較高的PgpdA∷lifeact-EGFP和CgTUB1-EGFP重組菌株，對(duì)其生理表型進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞骨架的熒光標(biāo)記并不影響膠孢炭疽菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及致病力，表明本研究所構(gòu)建的重組菌株能夠用于后續(xù)分析。

絲狀真菌細(xì)胞頂端極性的建立、維持都需要細(xì)胞骨架的參與，其結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化在細(xì)胞生長(zhǎng)、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸以及外泌過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色，因而在其致病過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用［43］。細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)由肌動(dòng)蛋白、微管蛋白及很多相關(guān)蛋白（ABPs，MAPs）共同調(diào)控。且微管蛋白還是很多真菌殺菌劑的作用靶點(diǎn)［42］。鑒于此，對(duì)于膠孢炭疽菌中微絲微管骨架的熒光標(biāo)記將有利于推動(dòng)對(duì)其菌絲生長(zhǎng)及致病過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)骨架分布、動(dòng)態(tài)變化及其相關(guān)蛋白功能，以及對(duì)殺菌劑作用機(jī)理的研究。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了膠孢炭疽菌微絲及微管骨架的標(biāo)記重組菌株，為今后深入研究膠孢炭疽菌微絲和微管骨架的結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)變化、以及細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的功能奠定了良好的基礎(chǔ)。