王建勇 鄒永梅 葛言彬 王凱 席夢(mèng)利

（1. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210037；2. 福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院/農(nóng)學(xué)院，福州 350002；3. 江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué) 化工學(xué)院，南京 210013；4. 新疆瑪納斯縣平原林場(chǎng)，昌吉回族自治州 832206）

表觀遺傳是指染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中可遺傳的改變，其不涉及DNA序列的變化，但深刻地影響基因表達(dá)和細(xì)胞功能。近年來(lái)，表觀遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，正不斷刷新我們對(duì)生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)。已有研究表明，染色質(zhì)狀態(tài)的改變?cè)诳刂萍?xì)胞分化和脫分化中發(fā)揮重要作用［1］。植物組織培養(yǎng)正是利用細(xì)胞可以脫分化和再分化的特性，進(jìn)行植物的快速繁殖及重要代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。其中植物細(xì)胞脫分化形成愈傷組織是組織培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)。愈傷組織是離體培養(yǎng)時(shí)，植物組織或器官中已分化的細(xì)胞，在外源激素的刺激下改變了原有的細(xì)胞命運(yùn)，經(jīng)細(xì)胞脫分化和不斷增殖所形成的無(wú)特定結(jié)構(gòu)、無(wú)明顯極性的松散組織。愈傷組織的獲得一般是將成熟的體細(xì)胞“逆轉(zhuǎn)”到分化程度較低的狀態(tài)并恢復(fù)其增殖能力［2］。在逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，大量的表觀遺傳修飾參與其中［1，3-8］。表觀遺傳修飾一般會(huì)引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，并伴隨基因表達(dá)水平的變化。在動(dòng)物方面，分化的細(xì)胞染色質(zhì)呈現(xiàn)閉合狀態(tài)，基因表達(dá)穩(wěn)定，而未分化細(xì)胞的染色質(zhì)處于開(kāi)放狀態(tài)，基因表達(dá)會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)的變化。表觀遺傳修飾參與到動(dòng)物細(xì)胞從分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槊摲只癄顟B(tài)的過(guò)程中，將染色質(zhì)從閉合狀態(tài)打開(kāi)，結(jié)合調(diào)控因子，通過(guò)不同途徑，影響下游基因的表達(dá)。在植物方面，雖然在玉米［9］，擬南芥［10］，小麥［11］和甜菜［12］中均已證實(shí)表觀遺傳通過(guò)改變基因表達(dá)和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響植物細(xì)胞的命運(yùn)轉(zhuǎn)變，調(diào)控愈傷組織的形成，但是具體的表觀修飾方式還沒(méi)有統(tǒng)一的定論。本文綜述了植物愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中DNA甲基化，組蛋白修飾，小RNA及染色質(zhì)重塑等常見(jiàn)表觀遺傳修飾的研究進(jìn)展，總結(jié)了存在的問(wèn)題并提出了植物愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中表觀遺傳學(xué)研究的方向。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是DNA化學(xué)修飾的一種，是真核生物中研究最深入的表觀遺傳標(biāo)記。指在不改變DNA序列的前提下，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶在胞嘧啶5'碳上通過(guò)共價(jià)結(jié)合的方式添加一個(gè)甲基基團(tuán)形成5-甲基胞嘧啶［13-15］。常見(jiàn)類(lèi)型可分為3種：CG、CHG和CHH（H = A，T或C）［16］。DNA甲基化可以提供超出植物基因組DNA序列以外的可遺傳信息，如果甲基化水平不足會(huì)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)發(fā)育的異常。因此，DNA甲基化在沉默有害轉(zhuǎn)座子插入，保護(hù)基因組穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)不同發(fā)育階段和不同環(huán)境條件下的基因表達(dá)等方面發(fā)揮著重要作用［15，17］。

在植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，不同的時(shí)期，不同的發(fā)育階段會(huì)伴隨著特定基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。植物DNA甲基化水平的改變?cè)谡{(diào)控基因的表達(dá)和沉默方面起到了重要作用。基因甲基化狀態(tài)一般分為3種類(lèi)型：持家基因通常處于低甲基化狀態(tài)或者不被甲基化，從而保證基因的穩(wěn)定表達(dá)；誘導(dǎo)性基因則在不同發(fā)育階段、組織特異性基因表達(dá)和外界脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)變?yōu)槿ゼ谆癄顟B(tài)；沉默基因通常處于高甲基化狀態(tài)。植物愈傷組織誘導(dǎo)期間會(huì)發(fā)生DNA甲基化水平的改變，這主要是因?yàn)橹参锛?xì)胞在外界植物激素的誘導(dǎo)下脫分化形成愈傷組織時(shí)需要DNA甲基化的全局重編程。愈傷組織形成期間的甲基變化以DNA低甲基化事件為主，但局部DNA，尤其是部分器官?zèng)Q定基因常常需要超甲基化以刺激愈傷組織的形成，但物種之間存在顯著差異［12，18-19］。

1.1 甲基轉(zhuǎn)移酶與DNA甲基化

愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程需要抑制器官發(fā)生基因的表達(dá)，促進(jìn)愈傷組織的形成，因此需要將這些基因的啟動(dòng)子區(qū)或編碼區(qū)進(jìn)行重新甲基化，使得器官發(fā)生基因表達(dá)沉默。植物體內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase1，MET1）主要維持基因組中重復(fù)及單拷貝序列CG位點(diǎn)的甲基化。MET1參與RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（RdDM）途徑，在MET1的作用下引起基因位點(diǎn)的甲基化。MET1的突變會(huì)導(dǎo)致部分基因的啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化，使得該區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，對(duì)DNaseI 敏感性增強(qiáng)，有利于反式作用因子的結(jié)合，進(jìn)一步活化基因，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Berdasco等［20］對(duì)野生型擬南芥和met1突變體葉片和根愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中甲基化水平變化進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在met1突變體誘導(dǎo)的愈傷組織中，篩選出505個(gè)差異表達(dá)基因，其中GLUTATHIONE S-TRANSFERASE TAU 10（GSTU10）、MITOGEN- ACTIVATEDPROTEINKINASE 12（MAPK12）、BETAXYLOSIDASE 1（BXL1）和WUSCHEL（WUS）等器官發(fā)生基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平與野生型相比急劇下降，并伴隨較低的愈傷誘導(dǎo)能力。Li等［21］也得到了相同的結(jié)果，在擬南芥met1突變體中，WUS啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化水平的下降引起WUS基因表達(dá)的上調(diào)，從而造成愈傷組織誘導(dǎo)能力的下降。

1.2 DNA序列差異影響甲基化程度

植物基因組中不同DNA序列的甲基化敏感性不同，造成了異染色質(zhì)區(qū)域如著絲粒區(qū)域、核糖體RNA編碼序列、轉(zhuǎn)座子的序列更容易被甲基化。轉(zhuǎn)座子作為一種DNA重復(fù)序列很容易發(fā)生甲基化的改變。組織培養(yǎng)作為一種外界脅迫，會(huì)招募轉(zhuǎn)座子富集到基因附近的區(qū)域，進(jìn)而發(fā)生超甲基化現(xiàn)象，引起基因表達(dá)沉默。Stelpflug等［22］在篩選玉米幼胚和愈傷組織之間的差異甲基化區(qū)域時(shí)發(fā)現(xiàn)，低甲基化主要富集在不含轉(zhuǎn)座子的區(qū)域，促進(jìn)愈傷組織發(fā)育特異性基因的表達(dá)，而未擴(kuò)散的LTR附近呈現(xiàn)超甲基化現(xiàn)象，抑制附近基因的表達(dá)。Gozukirmizi等［23］將大麥成熟胚置于添加4 mg/L麥草畏的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于4 d的幼苗，LTR轉(zhuǎn)座子在誘導(dǎo)15 d和30 d的愈傷組織中出現(xiàn)超甲基化的現(xiàn)象。

基因在總基因組中僅占據(jù)一小部分，非編碼DNA會(huì)影響基因的精確調(diào)控以及干擾基因的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化作為一種有效機(jī)制可以長(zhǎng)期沉默非編碼DNA，調(diào)控基因的表達(dá)。前期的研究成果表明：在組織培養(yǎng)過(guò)程中甲基化的丟失要多于甲基化的獲得，且DNA甲基化的這種改變主要發(fā)生在愈傷組織誘導(dǎo)的前期，植物激素作為一種誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)相關(guān)基因的去甲基化，促進(jìn)愈傷組織發(fā)育特異性基因的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的變化。雖然甲基轉(zhuǎn)移酶與DNA序列差異都會(huì)影響甲基化水平，但還有很多因素如培養(yǎng)方式的差異也會(huì)影響不同的甲基化模式，因此在未來(lái)的研究工作中需要更加深入地探討愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中DNA甲基化的分子機(jī)制。

2 組蛋白修飾

組蛋白修飾是在核小體的組蛋白N尾上發(fā)生的化學(xué)修飾，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）等。與DNA甲基化這種穩(wěn)定的表觀修飾相比，組蛋白修飾具有更好的可塑性。組蛋白修飾能夠影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，控制DNA的可及性，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性，并可遺傳給子細(xì)胞，在植物發(fā)育的各個(gè)階段均發(fā)揮重要作用［24-29］。

組蛋白修飾主要發(fā)生在基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和基因本身，以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。與已分化的體細(xì)胞相比，在脫分化的愈傷組織細(xì)胞中，激活性組蛋白修 飾 如H3K4me3、H3K36me3、H3ac和H2Aub顯著富集，而抑制性組蛋白修飾如H3K9me2/me3和H3K27me2/me3明顯減少［30］。

2.1 組蛋白乙?；揎棿龠M(jìn)愈傷組織形成

組蛋白乙?；揎椫饕揽拷M蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶和組蛋白脫乙?；腹餐S持動(dòng)態(tài)平衡。組蛋白乙?；揎椀母淖円话銜?huì)影響植物開(kāi)花、胚胎發(fā)育和愈傷組織誘導(dǎo)。其作用機(jī)制主要是促進(jìn)正電荷中和，增大與DNA之間的排斥力，誘導(dǎo)部分染色質(zhì)呈現(xiàn)開(kāi)放狀態(tài)，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，提高基因的表達(dá)水平。前期研究工作表明，在植物愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中組蛋白乙?；纳险{(diào)表達(dá)有助于愈傷組織的形成。Lee、Xu和Furuta等［7-8，31-32］將擬南芥葉片置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，組蛋白脫乙酰基因HISTONE DEACETYLASE9（HDA9）在培養(yǎng)96 h后開(kāi)始上調(diào)表達(dá)，激活生長(zhǎng)素途徑基因LATERAL ORGAN BOUNDARIES-DOMAIN 17（LBD17），LEAFYCOTYLEDON 1（LEC1），伴隨APETALA（AP2），NAM/ATAF1/CUC2（NAC）和BASIC/HELIX-LOOP -HELIX（bHLH）等轉(zhuǎn)錄因子家族基因不同程度的表達(dá)，進(jìn)而觸發(fā)組蛋白的脫乙酰化，引起細(xì)胞狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化，從而使細(xì)胞恢復(fù)分裂能力，形成愈傷組織。而hda9-1突變體細(xì)胞脫分化的能力明顯下降，其愈傷組織鮮重與野生型相比下降約30%，也說(shuō)明了HDA9在促進(jìn)愈傷組織形成中的重要作用。Zhang等［33］發(fā)現(xiàn)將水稻hda710突變體與中華11號(hào)的成熟合子胚置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上18 d后，相對(duì)于中華11號(hào)，hda710的愈傷組織形成明顯受阻，細(xì)胞團(tuán)更小，愈傷組織鮮重降低50%。

2.2 組蛋白去甲基化促進(jìn)愈傷組織形成

組蛋白甲基化主要發(fā)生在H3、H4組蛋白的氨基酸殘基上，主要是增加氨基酸殘基之間的疏水作用力。組蛋白甲基化對(duì)基因表達(dá)的影響主要依賴于被修飾的位置，如激活性組蛋白修飾H3K4me3和H3K36me3，抑制性組蛋白修飾H3K9me2/me3和H3K27me2/me3。愈傷組織的形成需要經(jīng)歷細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變，在這個(gè)過(guò)程中大量的組蛋白修飾因子參與其中以調(diào)控細(xì)胞周期、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA合成的相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)愈傷組織的形成［31，34］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，擬南芥葉片向愈傷組織轉(zhuǎn)變過(guò)程中需要先將組蛋白甲基化，抑制葉的身份特性，隨后通過(guò)組蛋白的脫甲基化激活根的身份特性，促進(jìn)愈傷組織的形成。Jumonji C domain-containing 30（JMJ30）蛋白是一種組蛋白去甲基化酶。JMJ30結(jié)合Auxin response factor 7（ARF7） 和ARF19形 成ARFJMJ30，并招募RABIDOPSIS TRITHORAX-RELATED 2（ATXR2）形成復(fù)合物，靶定LATERAL ORGAN BOUNDARIES -DOMAIN 16（LBD16）和LBD29基因啟動(dòng)子區(qū)域，抑制H3K9me3，激活H3K36me3，使LBD基因上調(diào)，提高細(xì)胞分裂活性，加速擬南芥葉片向愈傷組織的轉(zhuǎn)變（圖1）。Lee等［35］發(fā)現(xiàn)擬南芥jmj30-2突變體愈傷組織的鮮重與野生型相比下降15%。這些結(jié)果說(shuō)明了組蛋白修飾影響了基因的表達(dá)，并調(diào)控愈傷組織的形成。LYSINE-SPECIFIC DEMETHYLASE 1-LIKE3（LDL3）通過(guò)特異性消除H3K4me2，影響下游基因的表達(dá)。LDL3在生長(zhǎng)區(qū)域高表達(dá)以促進(jìn)愈傷組織的形成。Ishihara等［36］將擬南芥ldl3-1和ldl3-2突變體幼苗的根置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后，H3K4me2特異性增加，愈傷組織形成能力顯著下降。

圖1 JMJ30 介導(dǎo)的組蛋白去甲基化模式圖［35］Fig.1 JMJ30-mediated demethylation of histone in callus formation［35］

2.3 組蛋白甲基化影響端粒長(zhǎng)度

端粒作為染色體末端的DNA序列，對(duì)于維持植物染色體的穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用。動(dòng)物中一般認(rèn)為端粒長(zhǎng)度會(huì)隨著細(xì)胞分化而變短，但是在植物中這種情況并不相同。通常情況下，植物體細(xì)胞分化和衰老都會(huì)伴隨端粒長(zhǎng)度的變化，端粒長(zhǎng)度的改變會(huì)引起植物發(fā)育異常和染色體融合頻率的改變。

植物愈傷組織誘導(dǎo)伴隨著細(xì)胞的脫分化，細(xì)胞的分裂過(guò)程中染色體的復(fù)制必然需要合成新的端粒。端粒長(zhǎng)度的維持是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，不僅有基因的參與，還有表觀遺傳修飾因子的影響。植物愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中組蛋白修飾不僅影響基因的表達(dá)情況，還有可能影響端粒的長(zhǎng)度［37-38］。Grafi和 Sováková等［38-39］在Columbia（Col）、Landsberg erecta（Ler）和Wassilevskija（Ws）3種生態(tài)型的擬南芥葉片愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)期間，觀測(cè)到H3K9me2、H3K4me3、H3K4me2和H3K27me3信號(hào)的強(qiáng)度發(fā)生改變，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)愈傷組織的端粒長(zhǎng)度與葉片中的相比發(fā)生了一定程度的增加，但兩者之間的內(nèi)在關(guān)系尚不清楚。有一種解釋是，H3K9組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUVH4/KYP 在植物愈傷組織誘導(dǎo)和端粒長(zhǎng)度改變的過(guò)程中扮演重要角色。雖然SUVH4/KYP可以影響到端粒長(zhǎng)度的改變，但是SUVH4/KYP并不直接控制端粒的長(zhǎng)度變化，而是可能依賴于端粒替代性延長(zhǎng)（alterative lengthening of telomere，ALT）機(jī)制。首先，SUVH4/KYP組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶對(duì)H3K9進(jìn)行從頭甲基化，并激活泛素蛋白水解途徑中的相關(guān)基因；然后，誘導(dǎo)端粒區(qū)域的DNA進(jìn)行重組，使得端粒長(zhǎng)度增加；最后，較長(zhǎng)的端粒有利于細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞分裂，引起細(xì)胞脫分化形成愈傷組織［38-39］。雖然這種解釋可以解析擬南芥中組蛋白修飾的改變與端粒長(zhǎng)度之間的關(guān)系，但是值得注意的是這種現(xiàn)象并不具有普遍性，Gallego 和Fajkus等［40-41］在煙草葉片誘導(dǎo)愈傷組織的過(guò)程中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)端粒長(zhǎng)度的變化。因此兩者之間并不是存在唯一的分子機(jī)制，還有其他的分子機(jī)制或影響因素需要進(jìn)一步研究。

綜合上述研究成果可知，表觀修飾是細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)，而組蛋白修飾在細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變過(guò)程中并不是單獨(dú)起作用，需要與其他因子相互作用，逐步地精細(xì)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)以促進(jìn)愈傷組織的形成，因此對(duì)于組蛋白修飾調(diào)控愈傷組織的形成需要從更多角度進(jìn)行研究。

3 小RNA

小RNA（small RNAs）是指一類(lèi)在植物中高度保守，長(zhǎng)度在21-24 nt的單鏈RNA，通常調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)，主要分為兩類(lèi)：microRNAs（miRNAs）和 small interfering RNAs（siRNAs）［42-44］。小RNA作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，廣泛分布在植物基因組中，對(duì)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脅迫響應(yīng)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3.1 小RNA調(diào)控DNA甲基化促進(jìn)愈傷組織形成

小RNA可以通過(guò)DNA甲基化和染色質(zhì)修飾介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄沉默，以調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)愈傷組織的形成。Liu等［45］研究發(fā)現(xiàn)玉米幼胚誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程中，基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平增加，基因表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)21 nt和22 nt小RNAs與甲基化水平存在較弱的相關(guān)性，而24 nt小RNA與DNA甲基化水平在愈傷組織中呈現(xiàn)正相關(guān)，而與對(duì)照組未誘導(dǎo)的幼胚中的DNA甲基化水平呈負(fù)相關(guān)。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與24 nt小RNA參與RNA介導(dǎo)的DNA甲基化途徑有關(guān)?；蚪M上的重復(fù)序列通過(guò)RNA Pol II轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)的前體mRNA，前體mRNA在Dicer-like 3的作用下進(jìn)行剪接加工。U2 snRNP輔助因子（U2 snRNP auxiliary factor，U2AF）作為參與前體mRNA剪接的重要輔助因子，可以識(shí)別內(nèi)含子富含U或UA的序列，實(shí)現(xiàn)前體mRNA的剪接。24 nt RNA可以通過(guò)靶定下游U2AF亞基引起可變剪接，利用甲基轉(zhuǎn)移酶domains rearranged methyltransferase 2（DRM2）對(duì)其基因組序列進(jìn)行甲基化修飾。DNA甲基化會(huì)導(dǎo)致基因的沉默，促進(jìn)愈傷組織的形成。

3.2 小RNA通過(guò)影響激素信號(hào)途徑調(diào)控愈傷組織形成

激素能參與植物不同的發(fā)育過(guò)程，如細(xì)胞分裂、器官形成和脅迫反應(yīng)等不同的發(fā)育過(guò)程，小RNA可以通過(guò)靶定不同的基因協(xié)調(diào)激素應(yīng)答途徑，調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。小RNA不僅可以促進(jìn)愈傷組織的形成，還會(huì)抑制植物愈傷組織的形成。小RNA受到植物激素的誘導(dǎo)，miRNA抑制靶基因的表達(dá)，而后者直接調(diào)控植物的發(fā)育。Liu和Qiao等［42，46］認(rèn)為miR160可以與AUXIN RESPONSE FACTOR10（ARF10）互作，通過(guò)對(duì)ARF10的可變剪切，抑制ARF10表達(dá)。ARF10進(jìn)一步結(jié)合生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（AuxREs）的啟動(dòng)子區(qū)域，影響生長(zhǎng)素信號(hào)通路，抑制ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR 15（ARR15）表達(dá)，即miR160間接提高ARR15表達(dá)，影響生長(zhǎng)素信號(hào)途徑，抑制愈傷組織形成。Liu等［42］將mARF10（miR160-resistant ARF10）突變體的下胚軸在轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基48 h后，相對(duì)于野生型的下胚軸外植體來(lái)說(shuō)，mARF10的愈傷組織起始更快，然而愈傷組織起始慢于Pro35S：miR160c突變體。這說(shuō)明miR160可以間接抑制愈傷組織的形成。Zhang等［47］認(rèn)為miR156通過(guò)靶定SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE9（SPL9，一類(lèi)保守的DNA結(jié)合蛋白），并與B-ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORs（ARRs）相互作用抑制細(xì)胞分裂素響應(yīng)途徑，從而影響擬南芥根愈傷組織的形成。在愈傷組織誘導(dǎo)的初期miRNA156表達(dá)量突然下調(diào)，然后恢復(fù)到很高的水平，miRNA156可能負(fù)調(diào)控SPL9轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)細(xì)胞脫分化，誘導(dǎo)愈傷組織的形成。這表明小RNA與細(xì)胞分裂素途徑在調(diào)控愈傷組織中密切相關(guān)。

上述研究表明小RNA對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)多以間接形式進(jìn)行調(diào)控，如miRNA可以通過(guò)調(diào)控激素信號(hào)途徑影響愈傷組織的形成。一種miRNA可以參加不同的激素信號(hào)途徑，且不同的信號(hào)途徑之間又具有相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞的脫分化。miRNA通過(guò)不同的途徑調(diào)控下游信號(hào)，不同途徑形成截然相反的作用。因此，未來(lái)的研究需要考慮到miRNA作用的多重性和交互性，繼續(xù)挖掘更多小RNA的有效功能，可為小RNA調(diào)控愈傷組織形成的研究提供參考依據(jù)。

4 染色質(zhì)重塑

染色質(zhì)重塑是植物細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化過(guò)程中重編程的主要現(xiàn)象，涉及核小體的結(jié)構(gòu)及其與DNA相對(duì)序列位置的改變，使組蛋白和DNA之間的結(jié)合狀態(tài)變?yōu)椤笆杷伞睜顟B(tài)，增加了基因啟動(dòng)子區(qū)序列的可接近性，使反式作用因子如轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［48］。

4.1 染色質(zhì)重塑影響基因表達(dá)

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變可引起植物表型的改變，參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能改變的因素相互作用，構(gòu)成了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)、隨機(jī)和不確定性的變化，這種變化可以引起DNA可及性的改變，通過(guò)招募轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因的表達(dá)。染色質(zhì)重塑可以通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)來(lái)影響基因的表達(dá)，因此染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑對(duì)于植物細(xì)胞的脫分化至關(guān)重要。Polycomb group（PcG）可以通過(guò)修飾染色質(zhì)以抑制特定分化狀態(tài)下基因的表達(dá)。Polycomb repressive complex 1（PRC1）和PRC2是PcG中兩類(lèi)重要的表觀遺傳修飾復(fù)合體，一般認(rèn)為它們能催化抑制性組蛋白修飾H3K27me3的形成從而抑制基因表達(dá)，維持植物細(xì)胞的分化狀態(tài)。Lee等［8］發(fā)現(xiàn)擬南芥PRC1或PRC2的 突 變 會(huì) 使LEAFY COTYLEDON 1（LEC1）、LEC2、AGAMOUS-LIKE 15（AGL15）、BABY BOOM（BBM）、WUSCHEL（WUS）和WUSCHEL RELATED HOMEOBOX 5（WOX5）異位表達(dá)使根自發(fā)形成愈傷組織。這說(shuō)明了PcG可以調(diào)控H3K27me3修飾影響愈傷組織的形成。

4.2 染色質(zhì)重塑影響細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變

染色質(zhì)重塑可以通過(guò)抑制染色質(zhì)的重新組裝影響愈傷組織的形成。細(xì)胞可塑性是分化細(xì)胞獲得新命運(yùn)的能力。其中，脫分化形成愈傷組織就是一種細(xì)胞可塑性的表現(xiàn)形式，脫分化過(guò)程可分兩個(gè)階段：細(xì)胞極性的獲得和重新進(jìn)入S期。主要表現(xiàn)在分化細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，該過(guò)程需要具有新命運(yùn)細(xì)胞遺傳物質(zhì)的合成，為脫分化的細(xì)胞增殖做準(zhǔn)備。異染色質(zhì)蛋白1（heterochromatin protein 1，HP1）是異染色質(zhì)的特征性蛋白，最初從果蠅多線染色體異染色質(zhì)中被分離出來(lái)。組蛋白H3K9甲基化可以使HP1重新分布，抑制染色質(zhì)的重新組裝，誘導(dǎo)基因的沉默，引起分化細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變［49］。Williams等［49］在研究擬南芥葉片原生質(zhì)體誘導(dǎo)形成愈傷組織的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)異染色質(zhì)區(qū)的HP1蛋白與retinoblastoma protein（pRb）結(jié)合，招募常染色質(zhì)E2F的靶基因RIBONUCLEOTID REDUCTASE2（RNR2） 和PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN（PCNA），形成pRb/E2F靶基因的復(fù)合體，使E2F的靶基因上調(diào)表達(dá)，在激素處理72 h后促使細(xì)胞進(jìn)入S期，引起細(xì)胞分裂增殖，從而誘導(dǎo)愈傷組織的形成。

分化細(xì)胞向全能性干細(xì)胞的命運(yùn)轉(zhuǎn)變?cè)诩?xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域依然是一個(gè)研究熱點(diǎn)。染色質(zhì)重塑通過(guò)調(diào)控下游細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)，最終影響植物細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變。染色質(zhì)重塑與細(xì)胞周期調(diào)控都有助于愈傷組織的形成，因此染色質(zhì)重塑與細(xì)胞周期調(diào)控的結(jié)合研究有助于我們更好地理解植物愈傷組織形成的具體機(jī)制。

5 轉(zhuǎn)座子

轉(zhuǎn)座子又稱跳躍基因，是一類(lèi)可以移動(dòng)的遺傳因子，指基因組中可以改變位置的DNA序列。最早是由科學(xué)家芭芭拉·麥克林托克在研究玉米籽粒顏色變化中發(fā)現(xiàn)，并提出了著名的“Ac-Ds調(diào)控系統(tǒng)”。植物轉(zhuǎn)座子主要分布在著絲粒和基因密集區(qū)，具有種類(lèi)多，數(shù)量大的特點(diǎn)。通?？煞譃椋篒型轉(zhuǎn)座子、II型轉(zhuǎn)座子及Helitron轉(zhuǎn)座子［12］。雖然轉(zhuǎn)座子數(shù)量龐大，但只有少數(shù)轉(zhuǎn)座子可以表達(dá)。轉(zhuǎn)座子作為表觀遺傳調(diào)控的重要靶位點(diǎn)，影響基因的表達(dá)，在調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)對(duì)環(huán)境變化和細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

5.1 轉(zhuǎn)座子甲基化調(diào)控愈傷組織形成

在細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，愈傷組織誘導(dǎo)伴隨著細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變，細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。重新進(jìn)入細(xì)胞周期需要合成大量的遺傳物質(zhì)，雖然遺傳信息的穩(wěn)定表達(dá)是至關(guān)重要的，但是具有活性的轉(zhuǎn)座子在基因組間的跳躍常常影響基因的表達(dá)，如轉(zhuǎn)座子插入到基因內(nèi)部，則會(huì)引起基因的失活；當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到調(diào)控區(qū)，則會(huì)影響基因的表達(dá)。為了維持DNA復(fù)制的穩(wěn)定性，對(duì)一些轉(zhuǎn)座子進(jìn)行失活，需要抑制性修飾如甲基化來(lái)維持遺傳信息的穩(wěn)定表達(dá)，當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到基因上游，將甲基化的修飾延伸到臨近基因的調(diào)控區(qū)域，則會(huì)引起基因表達(dá)的下降。植物愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中轉(zhuǎn)座子就常伴隨甲基化水平 的改變［12，50-55］。Zhang、Baucom、Wang和Lanciano等［56-59］在玉米愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中，LTR轉(zhuǎn)座子發(fā)生甲基化的改變。這表明LTR類(lèi)型的轉(zhuǎn)座子在玉米愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中具有調(diào)控作用。但是在繼代培養(yǎng)中Copia呈現(xiàn)正調(diào)控作用，而Gypsy呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控作用。在水稻中，Saze等［60］也發(fā)現(xiàn)Gypsy中的Tos17在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中隨著甲基化程度降低而逐漸被激活，并在繼代培養(yǎng)中出現(xiàn)拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象。這進(jìn)一步說(shuō)明由于LTR轉(zhuǎn)座子甲基化抑制的不足，會(huì)造成不同表觀遺傳調(diào)控現(xiàn)象。

5.2 DNA甲基化和組蛋白修飾共同調(diào)控轉(zhuǎn)座子 活性

DNA甲基化不僅可以單獨(dú)調(diào)控轉(zhuǎn)座子的表達(dá)，還可以與組蛋白修飾相互作用共同影響轉(zhuǎn)座子的活性。在擬南芥中，組蛋白脫乙?；窰DA6對(duì)于轉(zhuǎn)座子和胞嘧啶甲基化維持是必需的，HDA6通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白乙?；图谆约稗D(zhuǎn)座子的DNA甲基化狀態(tài)使轉(zhuǎn)座子沉默，有助于穩(wěn)定基因表達(dá)狀態(tài)。Lee等［30］認(rèn)為DEFICIENT IN DNA METHYLATION 1（DDM1）、METHLTRANSFERASE 1（MET1） 和HISTONE DEACETYLASE 6（HDA6）三者形成蛋白復(fù)合體，通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白H3和H4的乙?；约敖M蛋白H3K4甲基化來(lái)保持轉(zhuǎn)座子沉默，從而促進(jìn)愈傷組織的形成。

轉(zhuǎn)座子作為活躍的遺傳因子，在植物基因調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。植物基因組中含有大量的轉(zhuǎn)座子元件，且種類(lèi)豐富，在玉米等具有復(fù)雜基因組的植物中占比高達(dá)85%以上，轉(zhuǎn)座子在基因組中的擴(kuò)增和向基因密集區(qū)的轉(zhuǎn)移為植物基因表達(dá)調(diào)控研究提供了廣闊的空間。前期的研究證明了愈傷組織誘導(dǎo)期間基因表達(dá)的變化需要轉(zhuǎn)座子的參與，但是需要在研究中充分考慮到不同類(lèi)型的轉(zhuǎn)座子在植物愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮的作用，降低轉(zhuǎn)座子對(duì)細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變的影響。

6 總結(jié)與展望

植物離體組織或器官在外源激素的刺激下發(fā)生細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變，即已經(jīng)分化的成熟細(xì)胞逆轉(zhuǎn)成脫分化的多能性干細(xì)胞。在脫分化過(guò)程中伴隨著基因表達(dá)，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，這些改變需要大量的表觀遺傳修飾參與其中，DNA甲基化，組蛋白修飾，小RNA，染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)座子以不同的方式和機(jī)制影響愈傷組織的形成。盡管表觀遺傳調(diào)控植物愈傷組織誘導(dǎo)已有不少研究報(bào)道，但該領(lǐng)域的研究還處于初級(jí)階段，筆者認(rèn)為，以下4個(gè)方面還需進(jìn)一步開(kāi)展研究。

6.1 研究材料的局限性

植物愈傷組織誘導(dǎo)是植物組織培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，盡管多種植物已成功誘導(dǎo)出了愈傷組織，但是仍有大量植物材料（如頑拗植物）不能誘導(dǎo)出愈傷組織。即使在已經(jīng)誘導(dǎo)出愈傷組織的材料中依然存在很多難題，如單子葉植物可以誘導(dǎo)愈傷組織的外植體部位有限，裸子植物誘導(dǎo)相對(duì)于被子植物更加困難。在可以成功誘導(dǎo)愈傷組織的植物中，表觀遺傳學(xué)研究主要集中在擬南芥、玉米和水稻等模式植物，對(duì)于其他非模式植物開(kāi)展的相關(guān)研究卻非常有限。由于研究材料的類(lèi)型不同，外植體的生理狀態(tài)及取材時(shí)間的差異，常常會(huì)得到不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。例如，全基因組范圍的H3K27me3積累對(duì)于擬南芥葉片誘導(dǎo)愈傷組織是必需的，但是這種修飾對(duì)于根作為外植體卻影響很?。?8］。因此，應(yīng)廣泛開(kāi)展不同植物及不同外植體在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中的表觀遺傳學(xué)研究，積累更多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為揭示植物愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中的表觀遺傳學(xué)規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

6.2 研究方法的局限性

表觀遺傳學(xué)的研究方法主要有chromatin Immunoprecipitation（ChIP），RNA binding protein Immunoprecipitation（RIP）和SmartFlare等。雖 然針對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程有大量的表觀修飾的研究，但是研究方法依然存在很多的局限性：一是使用的抗體相對(duì)較單一，無(wú)法全面反映植物體內(nèi)的表觀遺傳修飾；二是種類(lèi)繁多的小RNA及轉(zhuǎn)座子的鑒定在很大程度上依賴于生物信息學(xué)的研究，對(duì)其功能研究卻相對(duì)滯后，無(wú)法得知在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中的具體功能，尤其是可能存在相反的調(diào)控結(jié)果；三是研究方法主要集中在探究一種類(lèi)型的表觀遺傳修飾，并沒(méi)有將多個(gè)遺傳修飾結(jié)合起來(lái)研究。因此，未來(lái)研究需要結(jié)合下一代的測(cè)序技術(shù)，如染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性測(cè)序（assay for transponsase-accessible chromatin with high-throughput sequencing，ATACseq）、DNA親和純化測(cè)序（DNA affinity purification sequencing，DAP-seq）、單細(xì)胞技術(shù)和基因編輯技術(shù)等多種手段，并不斷改進(jìn)現(xiàn)有的研究方法，整合多組學(xué)、跨學(xué)科的研究手段，探尋能夠全方面多維度反映植物愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中的表觀調(diào)控機(jī)制。

6.3 理論知識(shí)的缺乏

隨著表觀遺傳研究的不斷深入，大量的表觀遺傳修飾被發(fā)掘，并應(yīng)用到生物學(xué)研究中，但是應(yīng)用到植物愈傷誘導(dǎo)研究的表觀遺傳修飾只有少數(shù)幾類(lèi)，因此我們無(wú)法將現(xiàn)有零碎的知識(shí)整合起來(lái)全面地研究表觀修飾所反映的內(nèi)在機(jī)制。另外，表觀遺傳因子可以聚集在一起，受到上游不同基因的調(diào)控，同時(shí)又調(diào)節(jié)眾多下游基因的表達(dá)，從而影響諸多的發(fā)育過(guò)程。這些復(fù)雜的信號(hào)通絡(luò)，構(gòu)成了立體的空間網(wǎng)絡(luò)。目前的研究多集中在某個(gè)單一的信號(hào)通路上，對(duì)多種通路是否有相同的功能和多信號(hào)通路之間的相互作用探索不夠深入。在未來(lái)的研究中需要建全動(dòng)態(tài)的復(fù)雜表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深化表觀遺傳對(duì)愈傷組織調(diào)控的理論知識(shí)。

6.4 分子機(jī)制的薄弱

現(xiàn)有的研究多集中在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中總DNA甲基化水平的改變，對(duì)于單基因甲基化水平的改變及如何精細(xì)化調(diào)節(jié)基因表達(dá)依舊不明確；組蛋白修飾之間相互作用比較復(fù)雜。例如，H3ac與H3K27me3皆可以拮抗激活根發(fā)育基因PLTs，又能協(xié)同抑制LECs基因。因此，可能存在其他的機(jī)制調(diào)控兩者之間的關(guān)系；小RNA的研究主要集中在生長(zhǎng)素和赤霉素方面，對(duì)于獨(dú)腳金內(nèi)酯等新型激素的研究還是空白，同時(shí)由于小RNA主要以家族形式存在，目前研究中的小RNA轉(zhuǎn)基因材料只是表達(dá)水平下降，并不能真正反映小RNA的功能；植物體內(nèi)多種染色質(zhì)重塑復(fù)合體是如何特異性調(diào)節(jié)靶基因，以及如何與組蛋白修飾相互作用介導(dǎo)基因沉默的機(jī)制還有待研究；轉(zhuǎn)座子的激活和沉默機(jī)制還需要具體分析。

細(xì)胞的分化和脫分化是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，愈傷組織作為分化細(xì)胞脫分化的產(chǎn)物，被廣泛應(yīng)用到生物學(xué)研究的多個(gè)領(lǐng)域［61］。在植物愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中，分化細(xì)胞與脫分化形成的愈傷組織細(xì)胞，非胚性愈傷組織向胚性愈傷組織的定向誘導(dǎo)，需要平衡分化和脫分化的關(guān)系，從遺傳和表觀遺傳協(xié)同的角度去理解并調(diào)控該發(fā)育過(guò)程。隨著人們對(duì)植物發(fā)育機(jī)制的深入解析，未來(lái)將可能設(shè)計(jì)更強(qiáng)大的分子工具，進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的“私人訂制”。