李 靜，耿志軍，鄭 晶，王 濤，應沖濤，郭 普

碳青霉烯耐藥腸桿菌科細菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae,CRE)的臨床分離率不斷增加，其治療已成為我國抗感染治療的嚴峻問題。產(chǎn)碳青霉烯酶是CRE最重要的耐藥機制之一[1]。目前，研究發(fā)現(xiàn)碳青霉烯酶主要包括A類酶(KPC)、B類酶(IMP、NDM及VIM等)及D類酶(OXA-48)[2]。臨床試驗證明新型β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復合物等抗生素對大多數(shù)產(chǎn)A類和D類酶CRE菌株有效，但對B類酶無效。因此，區(qū)分CRE產(chǎn)酶類型對合理選擇抗生素及臨床治療具有重要意義。目前，臨床實驗室檢測碳青霉烯酶的方法主要有紙片協(xié)同試驗、mCIM(modified carbapenem inactivation method)和eCIM(EDTA-carbapenem inactivation method)聯(lián)合實驗、改良Hodge實驗、顯色培養(yǎng)和基因檢測方法等。其中mCIM和eCIM聯(lián)合實驗室目前臨床使用較多的碳青霉烯酶檢測方法[3]。但該實驗需要兩階段的孵育培養(yǎng)，結(jié)果時效性較差，且無法準確給出酶的分型結(jié)果。膠體金免疫層析法是最新研發(fā)的碳青霉烯酶快速檢測方法，該法將5種碳青霉烯酶的單克隆抗體與膠體金偶聯(lián)，并固定于醋酸纖維素膜上,用于培養(yǎng)后獲取的細菌樣本中碳青霉烯酶的體外定性檢測。本研究以蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院所收集的CRE菌株為研究對象，通過膠體金免疫層析法檢測CRE菌株的產(chǎn)碳青霉烯酶類型，并與基因檢測結(jié)果進行一致性分析，評估分析膠體金免疫層析法在CRE產(chǎn)碳青霉烯酶類型檢測中的應用效能。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2017年7月至2020年12月期間臨床分離的腸桿菌科細菌，對厄他培南、亞胺培南耐藥，剔除同一病人同一部位分離的腸桿菌科菌株，共收集細菌80株；另外收集對碳青霉烯類抗生素敏感的腸桿菌科細菌作為對照菌株，共計21株。

1.2 主要儀器與試劑 凝膠成像儀(Bio-Rad公司)、PCR 擴增儀(Applied Biosystems公司)、冷凍高速離心機(Thermo Fisher Scientific公司)、干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)、哥倫比亞血瓊脂平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司)、西班牙瓊脂糖(Biowest)、GeneGreen核酸染料(北京天根生化科技有限公司)、2×Taq PCR Mix(北京天根生化科技有限公司)、Trans2K DNA Marker(北京全式金生物)、碳青霉烯酶基因PCR引物自上海生工生物合成、 1×TBE 緩沖液(北京天根生化科技有限公司)、亞胺培南紙片(10 mg，OXOID公司)、細菌培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司)、生物安全柜(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)、含珠菌種保存管(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、碳青霉烯酶檢測試劑盒(長沙中生眾捷生物技術(shù)有限公司)、渦旋儀(合肥艾本森科學儀器有限公司)。

1.3 PCR檢測方法 將保存的菌株接種到血瓊脂平板上，在37 ℃、5%CO2細菌培養(yǎng)箱內(nèi)隔夜培養(yǎng)進行復蘇。采用加熱煮沸法提取細菌DNA模板，采用10 μL接種環(huán)挑取一環(huán)細菌，置于1 mL無菌去離子水中，于干式恒溫器中煮沸10 min，離心12 000 r/min，10 min，將含DNA的上清液轉(zhuǎn)移至新EP管中，待進行PCR檢測。本實驗檢測5個常見的碳青霉烯酶基因，基因種類及引物序列見表1，擴增條件和PCR反應體系參考文獻[4]設計。PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，100 V，30 min，于凝膠成像儀中曝光并拍照。

表1 PCR引物序列表

1.4 膠體金免疫層析法檢測 膠體金免疫層析法檢測CRE碳青霉烯的方法參照試劑盒說明書進行，將碳青霉烯酶檢測卡盒和提取緩沖液平衡至室溫。于EP管中加入150 μL提取緩沖液，使用1 μL接種環(huán)取一環(huán)細菌樣本置于含提取緩沖液的EP管中。樣本使用渦旋儀混合震蕩5 s使標本混合均勻(如果樣本黏稠，震蕩3 min并室溫靜置10 min后進行檢測)。取100 μL樣本混合液，加入檢測卡盒的樣本孔中，室溫放置15 min，讀取結(jié)果。試劑檢測結(jié)果解釋：(1)陰性結(jié)果，僅在C線區(qū)域出現(xiàn)一條紅線，則樣本中不含所測5種碳青霉烯酶或含量低于檢測線，判讀為陰性結(jié)果。(2)陽性結(jié)果，在C線區(qū)域中出現(xiàn)一條紅線并且在K、O、V、I、N檢測線區(qū)域中出現(xiàn)一條或多條紅線，判讀為陽性結(jié)果，樣本中含有一種或多種碳青霉烯酶。(3)無效結(jié)果，在C線區(qū)域未出現(xiàn)紅線，則測試結(jié)果無效。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。以PCR檢測結(jié)果為標準，計算膠體金免疫層析法的敏感性、特異性，Kappa值>0.750，說明一致性程度較好。

2 結(jié)果

2.1 臨床分離CRE菌株分布 101例臨床分離的腸桿菌科細菌，主要來自ICU、急診科等臨床科室；體外藥敏試驗表型為CRE 80株(包括肺炎克雷伯菌60株、陰溝腸桿菌7株、大腸埃希菌13株)，對碳青霉烯酶類抗生素敏感的菌株21株(包括肺炎克雷伯菌13株、陰溝腸桿菌2株、大腸埃希菌5株、產(chǎn)氣腸桿菌1株)。菌株分布結(jié)果見表2。

表2 臨床分離CRE菌株分布

2.2 CRE碳青霉烯類耐藥基因檢測結(jié)果 80株CRE菌株中碳青霉烯酶基因陽性為79株，碳青霉烯酶基因陰性為1株，其中檢測到KPC基因型61株(76.25%)，NDM基因型10株(12.50%)，IMP基因型6株(7.50%)，VIM基因型2株(2.50%)；未檢測到OXA-48基因型，21株對碳青霉烯類抗生素敏感的細菌均未檢測到耐藥基因。代表性CRE菌株基因型檢測結(jié)果見圖1。

2.3 膠體金免疫層析法檢測 經(jīng)膠體金免疫層析法檢測，結(jié)果顯示，61株KPC基因型均為陽性，10株NDM基因型均為陽性，6株IMP基因型均為陽性，2株VIM基因型均為陽性，膠體金免疫層析法對CRE的篩選敏感性為100%，特異性為100%，四種酶型分別與PCR結(jié)果進行一致性檢驗分析，Kappa值均為1，完全一致。具體分析結(jié)果見表3。

3 討論

目前，臨床感染性疾病中革蘭陰性細菌感染率約占50%，碳青霉烯類抗菌藥物作為最后一道防線已被臨床廣泛應用。細菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率逐年增加[5-6]。目前的研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，腸桿菌科細菌主要通過產(chǎn)碳青霉烯酶發(fā)揮對碳青霉烯類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，碳青霉烯酶依據(jù)Ambler分類主要分為三類，包括A類酶、B類酶和D類酶。A類酶在含有絲氨酸殘基的部位進行催化作用，又稱為絲氨酸酶，其中KPC基因是我國最常見的基因型；B類酶又稱金屬酶，可被 EDTA 等含有金屬離子螯合劑抑制，包括 IMP、VIM、NDM等基因，IMP 基因是目前報道的最早發(fā)現(xiàn)的金屬酶，其水解碳青霉烯類抗生素的能力較強；D類酶對亞胺培南具有較高水解活性，在腸桿菌科細菌中發(fā)現(xiàn)的唯一基因型是OXA-48，目前臨床分離的產(chǎn)D類酶菌株較少[9-10]。臨床試驗證明新型β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復合物等抗生素對大多數(shù)產(chǎn)A類和D類酶CRE菌株有效，但對B類酶無效。因此，區(qū)分CRE產(chǎn)酶類型對合理選擇抗生素及臨床治療具有重要意義。

表3 PCR法與膠體金免疫層析法結(jié)果對比分析

本研究針對蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2017年7月至2020年12月收集的CRE菌株，進行耐藥基因檢測，在80株CRE菌株中，79株檢測出耐碳青霉烯酶基因，其中表達KPC基因有61株，表達NDM基因有10株，表達IMP基因有6株，表達VIM基因有2株；未檢測到OXA-48基因型。本研究中檢測到的最主要基因型是KPC，由此可見本地區(qū)臨床分離的CRE菌株KPC仍是最主要的碳青霉烯酶基因型，與前期報道[11-12]基本一致。另外，我們還檢測到NDM、IMP及VIM基因型，本研究中的10株產(chǎn)NDM菌株對碳青霉烯類抗生素在內(nèi)的其他藥物幾乎全部耐藥。我國海南、武漢等地均有從腸桿菌科細菌中檢出NDM的報道[11]。由于抗生素的不合理使用，目前CRE的耐藥機制多樣，除產(chǎn)碳青霉烯酶外，還包括外膜蛋白的缺失或合并產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及藥物外排泵高度表達等[13]。本研究中1株碳青霉烯類抗生素耐藥菌株的PCR法及膠體金免疫層析法檢測結(jié)果均為陰性，可能原因是該菌株通過產(chǎn)生其他碳青霉烯酶(OXA-23、GIM、SPM及GES等)或存在其他耐藥機制，需要我們進一步分析研究。

目前，臨床實驗室檢測碳青霉烯酶的方法主要有紙片協(xié)同試驗、mCIM和eCIM聯(lián)合實驗、改良Hodge實驗、顯色培養(yǎng)和PCR法等。改良Hodge試驗及mCIM試驗是2017版美國臨床和試驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦的碳青霉烯酶表型篩選方法。而mCIM和eCIM聯(lián)合實驗室是目前臨床使用較多的碳青霉烯酶檢測方法。膠體金免疫層析法是最新研發(fā)的碳青霉烯酶快速檢測方法，該法將KPC、IMP、VIM、NDM和OXA-48型5種碳青霉烯酶的單克隆抗體與膠體金偶聯(lián)，并固定于醋酸纖維素膜上，用于培養(yǎng)后獲取的細菌樣本中KPC、IMP、VIM、NDM和OXA-48型5種碳青霉烯酶的體外定性檢測，可快速鑒定細菌樣本中是否存在5種碳青霉烯酶中一種或幾種，從而鑒定感染病人是否對碳青霉烯類抗生素具有耐藥性[14]。目前該方法在中國尚未作為臨床常規(guī)檢測CRE碳青霉烯酶，其檢測效能尚需進一步評價，本研究采用膠體金免疫層析法對79株CRE菌株進行產(chǎn)酶檢測，并與PCR檢測結(jié)果進行一致性分析，結(jié)果證實膠體金免疫層析法對KPC、IMP、VIM、NDM的檢測敏感性高(100%)、特異性強(100%)，更重要的是操作簡單快速，僅需20 min左右即可鑒定出CRE產(chǎn)碳青霉烯酶類型。

總之，膠體金免疫層析法是一種操作簡便、快速高效的CRE碳青霉烯酶檢測方法，該法檢測產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型的敏感性和特異性較高，對流行病學調(diào)查、感染控制及臨床抗菌藥物管理優(yōu)化均具有重要的意義。