馮瑋，宋鵬

（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252000）

羧肽酶（caboxypeptidases，CPs）是一類重要的外切蛋白酶，水解蛋白或多肽鏈的C端特定肽鍵，逐個(gè)降解釋放游離氨基酸。根據(jù)催化機(jī)制不同，羧肽酶分為絲氨酸羧肽酶（EC3.4.16.-）、金屬羧肽酶（EC3.4.17.-）和半胱氨酸羧肽酶（EC3.4.18.-）[1]。羧肽酶由于具有獨(dú)特的水解作用，在食品工業(yè)中常用于酶法生產(chǎn)氨基酸[2]、制備寡肽[3]、蛋白水解物脫苦和提升風(fēng)味[4]，部分特殊種類的羧肽酶還應(yīng)用到生物技術(shù)領(lǐng)域中多肽的特異性裂解[5]和多肽氨基酸序列測(cè)定[6]。

羧肽酶在動(dòng)植物、真菌及細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn)[7]，但動(dòng)植物體內(nèi)羧肽酶含量低、成分復(fù)雜，提取成本較高，利用微生物發(fā)酵是當(dāng)今獲得羧肽酶的主要方法。目前已有多種來源的羧肽酶被克隆表達(dá)，主要是微生物羧肽酶尤其是真菌來源的羧肽酶[8]。其中，已被克隆表達(dá)的黑曲霉羧肽酶有2種：羧肽酶D-I（PepF）和羧肽酶DII（PepG）[9]。

黑曲霉CBS 513.88的基因組序列于2007年完成解析并公布，但黑曲霉的蛋白數(shù)據(jù)庫顯示還有許多功能未確定的蛋白[10]。本文通過對(duì)黑曲霉CBS 513.88基因組全面閱讀和必要的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)疑似編碼絲氨酸羧肽酶的基因，并將該基因在畢赤酵母進(jìn)行克隆與表達(dá)，系統(tǒng)解析了重組酶的酶學(xué)性質(zhì)，為進(jìn)一步挖掘其應(yīng)用價(jià)值奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉CGMCC 3.7193：中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏；克隆宿主菌大腸桿菌（E.coli JM109）、表達(dá)宿主菌畢赤酵母（P.pastoris GS115）、表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K：聊城大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養(yǎng)基、最小葡萄糖（minimaldextrose，MD）培養(yǎng)基、緩沖復(fù)合甘油（buffered glycerol-complex medium，BMGY）培養(yǎng)基、緩沖復(fù)合甲醇（buffered methanol-complex medium，BMMY）培養(yǎng)基：北京索萊寶生物技術(shù)有限公司。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物CapA-F：5′-GTAGTCCTCCAGCCAGAGGAACCATC-3′、CapA-R：5′-TGCTCTAGATCACTCAGTAAACGATGCCCCG-3′（下劃線部分為限制性酶切位點(diǎn)）：由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

限制性內(nèi)切酶、Pyrobest DNA聚合酶、T4DNA連接酶：TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒：北京莊盟國際生物基因科技有限公司；RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒：Invitrogen公司；化學(xué)合成底物芐氧羰基-丙氨酰-精氨酸（N-carboben zoxy-L-alanyl-L-arginine，CBZ-Ala-Arg）、芐氧羰基-脯氨酰-甘氨酸（N-carboben zoxy-L-prolyl-L-glycine，CBZPro-Gly）、芐氧羰基-丙氨酰-賴氨酸（N-carboben zoxy-L-alanyl-lysine，CBZ-Ala-Lys）、芐氧羰基-甘氨酰-丙氨酸（N-carboben zoxy-L-glycyl-alanine，CBZGly-Ala）、芐氧羰基-丙氨酰-谷氨酸（N-carboben zoxy-L-alanyl-glutamate，CBZ-Ala-Glu）、芐氧羰基-苯丙氨酰-亮氨酸（N-carboben zoxy-L-phenylalanyl-L-leucine，CBZ-Phe-Leu）：由浙江昂拓萊司生物技術(shù)有限公司合成。

ArktikTMPCR熱循環(huán)儀：賽默飛世爾公司；MicroPulser電穿孔儀：美國伯樂（Bio-Rad）公司；DYCP-31DN凝膠電泳儀、DYCZ-25E型P4垂直電泳儀：北京六一儀器廠；JY04S-3C凝膠成像系統(tǒng)：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；SP-2012UV型分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因克隆與重組菌構(gòu)建

黑曲霉總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，用已合成引物以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，及后續(xù)的PCR產(chǎn)物純化、酶切、連接、轉(zhuǎn)化E.coli JM109，篩選陽性克隆子按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行[11]；重組質(zhì)粒線性化、電轉(zhuǎn)化P.pichia GS115及畢赤酵母重組菌GS115（pPIC-CapA）的篩選按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)提供的方法進(jìn)行。

1.2.2 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)與初步純化

畢赤酵母重組菌GS115（pPIC-CapA）在YPD平板上純化，挑選單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基（25 mL），于30℃、200 r/min培養(yǎng)18 h～20 h，然后，1%接種量轉(zhuǎn)接BMGY培養(yǎng)基（25 mL），于30℃、200 r/min培養(yǎng)16 h～18 h至對(duì)數(shù)期（OD600=2.0～6.0），8 000 r/min 離心5 min收集菌體，再將菌體重懸于適當(dāng)體積BMMY培養(yǎng)基，至OD600值為1.0，于30℃、200 r/min培養(yǎng)誘導(dǎo)，每24 h補(bǔ)加無水甲醇至終濃度0.5%，維持誘導(dǎo)120 h，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵液4℃，8 000 r/min離心收集上清液，即為粗酶液。

粗酶液經(jīng)30%～70%的硫酸銨分級(jí)沉淀，用截留分子量為50 kDa的透析袋透析，實(shí)現(xiàn)初步純化。

1.2.3 重組羧肽酶活力測(cè)定

羧肽酶酶活測(cè)定參照Morita等[3]的方法，并做簡(jiǎn)單優(yōu)化。酶活測(cè)定以CBZ-Phe-Leu為底物，用pH6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（0.1 mol/L）配制1 mmol/L底物溶液。取450 μL底物，加入50 μL適當(dāng)稀釋的酶液于37℃反應(yīng)60 min，立即加入500 μL 0.5%茚三酮溶液，混合液置于100℃水浴加熱15 min，加熱完畢后自來水冷卻5 min，用分光光度計(jì)測(cè)定A570的吸光值。配制不同濃度標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，同樣條件下與茚三酮反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活定義：在37℃，1 min水解底物生成1 μg酪氨酸的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.4 重組羧肽酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.4.1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性測(cè)定

分別檢測(cè)羧肽酶在30℃～70℃，pH 6.0條件下的酶活值，確定該酶最適作用溫度。

將酶液分別置于30℃～70℃，保溫處理0.5、1、1.5、2 h，按1.2.3項(xiàng)進(jìn)行酶活測(cè)定，未進(jìn)行熱處理的酶液作對(duì)照（酶活為100%），計(jì)算相對(duì)酶活，考察羧肽酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.4.2 最適pH值及pH穩(wěn)定性測(cè)定

分別檢測(cè)羧肽酶在pH 4.0～8.0，45℃條件下的酶活值，確定該酶最適作用pH值。

將酶液分別置于pH 4.0～8.0緩沖液中保溫1 h（溫度45℃），按1.2.3項(xiàng)進(jìn)行酶活測(cè)定。酶活最高值為100%，考察羧肽酶的pH穩(wěn)定性。使用的緩沖液是0.1 mol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0）。

1.2.4.3 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活的影響

在羧肽酶和底物反應(yīng)體系中分別加入終濃度1 mmol/L的金屬離子和化學(xué)試劑。按1.2.3項(xiàng)進(jìn)行酶活測(cè)定。以不加金屬離子和化學(xué)試劑體系中的酶活為100%，計(jì)算各金屬離子和化學(xué)試劑存在時(shí)的相對(duì)酶活。

1.2.4.4 底物特異性分析

羧肽酶分別與1 mmol/L的CBZ-Ala-Arg、CBZPro-Gly、CBZ-Ala-Lys、CBZ-Gly-Ala、CBZ-Ala-Glu 或CBZ-Phe-Leu反應(yīng)，按照1.2.3項(xiàng)進(jìn)行酶活測(cè)定。以CBZ-Phe-Leu為底物時(shí)的酶活測(cè)定值為100%，計(jì)算其它底物與羧肽酶反應(yīng)的相對(duì)酶活值。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

利用美國國家生物信息中心網(wǎng)站查找黑曲霉和其它來源絲氨酸羧肽酶氨基酸序列；用Clustal X2和Biodit進(jìn)行序列比對(duì)分析；MEGA 5.0以臨近法（Neighbour-joining）構(gòu)建進(jìn)化樹，分析親緣關(guān)系[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 羧肽酶基因的克隆與序列分析

A.niger CBS 513.88基因組（EMBL AM270980-AM270998）已經(jīng)解析[10]，通過閱讀其基因組信息和BLAST分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的疑似絲氨酸羧肽酶基因（carboxypeptidase，CapA）。以CapA-F和CapA-R為引物，提取的黑曲霉F0510 cDNA為模板，成功擴(kuò)增出該基因，并構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC-CapA。測(cè)序確定CapA具有完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF），而且核苷酸序列與A.niger CBS 513.88基因組公布的序列完全一致。該絲氨酸羧肽酶基因1 479 bp，編碼492個(gè)氨基酸。

采用Clustal X2分析比對(duì)不同來源的絲氨酸羧肽酶氨基酸序列，整理后匯總于圖1。

圖1 不同來源絲氨酸羧肽酶的氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Multiple sequence alignment of serine carboxypeptidases from different microorganisms

CapA在結(jié)構(gòu)上存在4個(gè)參與底物結(jié)合和催化的保守結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域1是保守的底物結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域2～4是保守的催化結(jié)構(gòu)域，包含由絲氨酸（S）、天門冬氨酸（D）和組氨酸（H）組成的保守三聯(lián)體（Ser-Asp-His）[3，7]，以及一個(gè)空間上包圍絲氨酸活性殘基的GX-S-X保守序列（位于結(jié)構(gòu)域1中）[13]。在負(fù)責(zé)催化的絲氨酸殘基之前有一個(gè)保守的谷氨酸（Glu）（位于結(jié)構(gòu)域2中），被認(rèn)為是絲氨酸羧肽酶在酸性條件發(fā)揮最佳催化作用的原因[13]。與其它羧肽酶一樣，CapA屬于SC族羧肽酶中的S10家族[14]。

利用MEGA 5.0將CapA進(jìn)一步與已報(bào)道的絲氨酸羧肽酶的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖2所示。

圖2 進(jìn)化樹描述不同來源的絲氨酸羧肽酶的遺傳距離Fig.2 Phylogenetic tree describing the genetic distances among various serine carboxypeptidases from different microorganisms

進(jìn)化樹反映了10種不同來源絲氨酸羧肽酶之間的遺傳距離，遺傳距離短說明親緣關(guān)系近，并聚集在一起。CapA與其他絲氨酸羧肽酶氨基酸序列相似度介于 15.76%（SpCap）～93.09%（AlCap），平均值為30.45%。CapA與AlCap的相似度最高，為93.09%。

2.2 羧肽酶的誘導(dǎo)表達(dá)

重組質(zhì)粒pPIC-CapA經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacⅠ線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，經(jīng)過一系列篩選，獲得重組菌GS115（pPIC-CapA）。采用搖瓶培養(yǎng)，并伴隨甲醇誘導(dǎo)120 h后，粗酶液酶活達(dá)到最高值109.7 U/mL。通過鹽析、透析對(duì)CapA的粗酶液初步純化后，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）見圖 3。

圖3 蛋白電泳分析重組酶CapA的純化效果Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purification of the recombinant enzyme CapA

由圖3分析表明，CapA的分子量約為60.0 kDa，略大于理論分子量52.7 kDa，推斷是糖基化所致，絲氨酸羧肽酶在合成過程中普遍要進(jìn)行糖基化修飾[7]。

2.3 羧肽酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性

溫度對(duì)CapA酶活性和穩(wěn)定性的影響如圖4。

圖4 溫度對(duì)CapA酶活性和穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of CapA

由圖4a可知，CapA的最適溫度是45℃，在30℃～55℃相對(duì)酶活可維持在70%以上。熱穩(wěn)定性研究表明（圖4b），在30℃～50℃孵育1 h后，CapA的酶活可保持80%以上，在60℃和70℃孵育2 h，酶活仍能分別保留30%和10%以上。

CapA的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性明顯高于A.oryzae羧肽酶的最適溫度（30℃）和熱穩(wěn)定性（60℃孵育 30 min，酶活低于 10%）[3]，也高于 S.cerevisiae來源重組羧肽酶Y的最適溫度（約30℃）和熱穩(wěn)定性（60℃孵育1 h，幾乎檢測(cè)不到酶活）[16]。CapA相比于其它羧肽酶有更好的耐熱性，使其應(yīng)用時(shí)在簡(jiǎn)化工藝、提高效率和降低成本等方面存在優(yōu)勢(shì)[21]。

2.3.2 最適pH值及pH值穩(wěn)定性

pH值對(duì)CapA的酶活性和穩(wěn)定性的影響如圖5所示。

圖5 pH值對(duì)CapA的酶活性和穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of CapA

由圖5a可知，CapA的最適pH值是6.0，在pH 5.0～6.5相對(duì)酶活可維持在60%以上。pH值小于5.0或大于6.0時(shí)，酶活快速下降。pH值穩(wěn)定性研究表明（圖 5b），CapA 在 pH 4.0～8.0都比較穩(wěn)定，孵育 1 h，酶活可保持60%以上，CapA和其它來源的羧肽酶相似，都在酸性條件發(fā)揮最佳水解作用，但與大多絲狀真菌和酵母菌來源的羧肽酶最適pH值位于4.0附近不同[3，22-23]，CapA的最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定范圍更偏向中性，和已報(bào)道的S.cerevisiae來源的羧肽酶Y相似[16]，其發(fā)揮作用偏向中性pH值的反應(yīng)體系，更方便酶作用后產(chǎn)物的后續(xù)處理。

2.3.3 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活的影響

金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)CapA酶活的影響見表1。

表1 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)CapA酶活的影響Table 1 Effect of metal ions and chemicals on the enzymatic activity of CapA

Mg2+顯著提高 CapA 酶活，Cu2+、Fe2+和 Co2+明顯抑制酶活，而Ca2+、Zn2+和Mn2+則對(duì)酶活幾乎沒有影響。CapA屬絲氨酸蛋白酶，其活性中心不需要金屬離子輔助[23]，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）螯合后，酶活不受影響也說明了這一點(diǎn)。所以金屬離子應(yīng)該是與酶的一些關(guān)鍵氨基酸形成配位鍵后改變了酶的構(gòu)象，從而影響了酶的活性[24]。苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）對(duì)重組酶的酶活性抑制率達(dá)80%以上，PMSF作為絲氨酸蛋白酶的特異性抑制劑，對(duì)曲霉羧肽酶OcpC、紅曲霉羧肽酶等絲氨酸羧肽酶都有抑制作用[3]。

2.3.4 CapA水解底物特異性

以6種CBZ-aa-aa為底物，CapA的水解特異性結(jié)果見圖6。

圖6 重組羧肽酶的底物特異性Fig.6 Substrate specificity of recombinant carboxypeptidase

CBZ-Phe-Leu是CapA的最適作用底物。CapA水解6種底物能力大小如下：CBZ-Phe-Leu＞CBZ-Gly-Ala＞CBZ-Ala-Lys＞CBZ-Pro-Gly＞CBZ-Ala-Glu＞CBZAla-Arg（無水解活性）。CapA底物特異性較廣泛，并且偏好水解形成寡肽苦味的羧基端疏水性氨基酸Leu和Lys，在蛋白C端測(cè)序和寡肽脫苦中有良好的應(yīng)用潛力[6，8，25]，有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究首次鑒定了黑曲霉來源的絲氨酸羧肽酶CapA，并成功進(jìn)行了異源表達(dá)。解析了CapA的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性、最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定性、金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活影響、底物特異性等基本酶學(xué)特征。系統(tǒng)研究表明，CapA最適反應(yīng)溫度和pH值分別為45℃和6.0；相比已報(bào)道羧肽酶，有更好的耐熱性（60℃孵育2 h，酶活仍能保留30%）和pH值穩(wěn)定性（在pH 4.0～8.0環(huán)境孵育1 h，酶活可保持60%）；其水解底物特征表明CapA在蛋白C端測(cè)序和寡肽脫苦中具有應(yīng)用潛力。