蔚慧欣，秦丹，王燕*，張志旭

（1.山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術中心，山西 汾陽 032205；2.湖南農業(yè)大學食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.湖南農業(yè)大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；4.湖南農業(yè)大學園藝學院，湖南 長沙 410128）

中國白酒釀造是一種古老的食品發(fā)酵技術，也是一種多菌種參與的固態(tài)發(fā)酵技術體系。汾酒以其獨特的固態(tài)發(fā)酵釀造環(huán)境，造就了具有獨特生理性能的微生物菌群，在白酒發(fā)酵中起著關鍵作用[1-2]。近年來，基于高通量測序結果研究表明，汾酒發(fā)酵過程主要包括2個階段：階段I（0～7 d），乳桿菌和畢赤酵母是豐度最高的微生物；階段II（7 d～28 d），耐酸乳桿菌和釀酒酵母是豐度最高的微生物。其中耐酸乳桿菌的數量與白酒中乳酸乙酯的數量呈現正相關關系[3-4]，芽孢桿菌在整個發(fā)酵過程占比維持穩(wěn)定，參與風味物質的形成。因此，監(jiān)測發(fā)酵過程中耐酸乳桿菌、芽孢桿菌和酵母菌的生物量可以為產品品質的人工調控提供更為準確的數據，為進一步利用特定微生物資源以及控制發(fā)酵代謝的深入研究做好基礎鋪墊。

白酒釀造過程中微生物群落組成復雜，隨著發(fā)酵的進行微生物菌群組成會發(fā)生變化。采用可培養(yǎng)技術檢測原位系統(tǒng)微生物菌群組成較為困難，無法準確分析微生物之間以及微生物與環(huán)境之間的相互關系[5]。高通量測序技術對微生物多樣性及其動態(tài)的研究并不全面，無法對真菌和細菌同時進行準確定量。

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是將普通PCR和光譜分析、實時檢測等手段巧妙結合到一起的一項技術，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、自動化程度高等優(yōu)點，已被成功用于復雜微生物群落中微生物的定量分析，如魏娜等[6]應用qPCR對濃香型白酒窖泥中優(yōu)勢菌群進行研究。已有學者采用微生物純培養(yǎng)技術、變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）和高通量測序技術等對食醋發(fā)酵過程中微生物群落的結構進行了解析[7-9]。陳筆等[10]嘗試用qPCR技術研究白酒發(fā)酵過程中塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）生物量變化。路虎等[11]利用該技術定量分析了產土味素的鏈霉菌。但是清香型白酒微生物的定量數據報道較少。

本研究采用qPCR技術對汾酒發(fā)酵過程酒醅中總細菌、總真菌、耐酸乳桿菌、芽孢桿菌和酵母菌生物量進行定量分析，為清香型白酒釀造機理解析、發(fā)酵工藝過程控制提供重要參數[12-14]。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

發(fā)酵過程酒醅樣品取樣于山西杏花村汾酒廠股份有限公司，采樣時間點為大茬、二茬發(fā)酵0、7、15、28 d，選擇同一車間4個班組作為平行樣品，用無菌袋采樣后迅速放置冰盒內，取樣時間與樣品處理時間間隔不大于20 min。

1.2 試劑與儀器

RNA 酶（10 mg/mL）、溶菌酶（50 mg/mL）、瓊脂糖、細菌基因組DNA提取試劑盒（均為優(yōu)級純）：天根生化科技有限公司；引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；鹽酸、乙二胺四乙酸、磷酸鈉、溴化十六烷三甲基銨、氯化鈉、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、無水乙醇（均為化學純）：國藥集團股份有限公司；2×Taq MasterMix、Puc-T TA cloning kit、感受態(tài)細胞DH5α（均為優(yōu)級純）：康為世紀生物科技有限公司；SYBR?Premix Ex TaqTMII（TliRNaseHPlus）ROXplus、DL2000DNAMarker（均為優(yōu)級純）：寶生物工程（大連）有限公司。

ABI 7500實時定量PCR儀、核酸濃度測定儀BioSpectrometer?basic：賽默飛世爾科技公司；Power－PacBasic核酸電泳儀：美國BIO-RAD公司；Geldocit310凝膠成像系統(tǒng)：英國UVP公司；FMB40制冰機：日本SANYO公司；RC-6TMPlus離心機：Eppendorf公司。

1.3 酒醅總DNA的提取

酒醅總DNA提取采用月桂酸鈉法。稱取20 g酒醅，懸浮于180 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，漩渦振蕩，靜置1 min收集上清液。12 000 r/min，4℃離心1 min后收集細胞沉淀，液氮速凍并充分研磨。將研磨好的粉末轉移到混合裂解液[9]中，渦旋振蕩20 min，加入等體積的抽提液（酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1，體積比），搖勻?；旌弦涸?12 000 r/min，4℃條件下離心10 min，吸取上清液，加入10 μL RNA酶，于37℃靜置30 min，然后加入等體積的抽提液，抽提1次，再加入0.7倍體積異丙醇，置于-20℃，靜置30 min；4℃，12 000 r/min離心20 min，收集沉淀。用70%乙醇洗滌沉淀2次，真空干燥。加入20μL的ddH2O溶解30min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用核酸濃度測定儀確定DNA濃度，分析A260/A280評價DNA純度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA純度及濃度。

1.4 qPCR特異性引物設計

針對酒醅中總細菌、總真菌、耐酸乳桿菌、芽孢桿菌和酵母菌分別設計特異性引物用于qPCR擴增，引物名稱及序列見表1[15-17]。

表1 特異性引物的名稱及序列Table 1 The information of specific primer

1.5 酒醅微生物的qPCR定量分析

采用絕對定量法跟蹤白酒發(fā)酵過程中微生物的生物量，其中標準品為重組質粒，根據重組質粒的拷貝數與擴增循環(huán)數之間的線性關系構建標準曲線[18]。為了使從不同樣品獲得的結果具有更好的可比性，質量濃度轉換成為模板拷貝數濃度的公式，公式如下。

CN=M×N/L×D

式中：M為質量濃度，g/mL；N為阿佛加德羅常數，6.02×1023；L為核酸分子長度（總長度為靶片段加載體之和），kb；D 為轉換因子（dsDNA），6.6×105g/mol·kb。

qPCR反應體系如下：2×UltraSYBRMixture10μL，引物各 0.5 μL，模板 2 μL，加 ddH2O 至 20 μL。將質粒標準品進行10倍梯度稀釋，每個梯度取2 μL為模板建立標準曲線。擴增程序為變性階段95℃30 s；循環(huán)階段95℃5 s、60℃40 s，40個循環(huán)。qPCR擴增結束后通過熔解曲線分析，驗證擴增的特異性。

以白酒酒醅樣品DNA為模板進行qPCR特異性擴增，并根據標準曲線計算酒醅中各類微生物的拷貝數。每份樣本先稀釋10倍，然后取稀釋液DNA 2 μL作為反應量，每個樣本進行3次重復檢測。

1.6 標準曲線及熔解曲線

標準品檢測結果和標準曲線回歸方程如表2所示。

表2 標準品信息和標準曲線Table 2 Standard reference materials and standard curve

結果表明標準曲線可以用于熒光定量分析（R2>0.99）。

2 結果與分析

2.1 酒醅樣品總DNA的提取

分析采用月桂酸鈉法提取樣品總DNA，瓊脂糖凝膠電泳驗證結果如圖1所示。

圖1 部分樣品DNA電泳圖Fig.1 The electrophoretogram of parts of sample DNA

由圖1可知，本研究所提取的基因組較為完整。核酸濃度檢測的A260/A280比值均在1.8至1.9左右，質量較好。

2.2 大茬、二茬發(fā)酵過程中微生物生物量的動態(tài)變化

大茬、二茬酒醅發(fā)酵過程中各類微生物實時擴增曲線如圖2～圖6所示，生物量的變化如圖7所示。

圖2 總細菌標準曲線及樣品中總細菌實時擴增曲線Fig.2 Standard curve and melting curve of total bacteria

圖3 耐酸乳桿菌標準曲線及樣品中耐酸乳桿菌實時擴增曲線Fig.3 Standard curve and melting curve of L.acetotolerans

圖4 芽孢桿菌標準曲線及樣品中芽孢桿菌實時擴增曲線Fig.4 Standard curve and melting curve of Bacillus

圖5 總真菌標準曲線及樣品中總真菌實時擴增曲線Fig.5 Standard curve and melting curve of total fungi

圖6 酵母菌標準曲線及樣品中酵母菌的實時擴增曲線Fig.6 Standard curve and melting curve of yeast

圖7 酒醅發(fā)酵過程中各微生物動態(tài)變化曲線Fig.7 Dynamic curve of the microorganism during the fermentation process

汾酒大茬、二茬發(fā)酵過程中功能微生物前期（0～7 d）演替規(guī)律相似，二茬發(fā)酵中后期菌群呈現顯著衰亡趨勢。大茬總細菌的生物量呈上升趨勢，耐酸乳桿菌和芽孢桿菌的生物量呈先上升后下降趨勢，分別于第 28、15、7 天達到最大值（5.53×1016、1.40×1013、1.21×106copies/g酒醅DNA）。二茬總細菌、耐酸乳桿菌和芽孢桿菌的生物量整體呈先上升后下降趨勢，分別于第15、15、7 天達到最大值（1.33×1016、6.77×1012、1.21×106copies/g酒醅DNA）。大茬總真菌在發(fā)酵過程中呈遞增趨勢，酵母菌在0～7 d增長，7 d～15 d下降，隨后增長至大茬發(fā)酵結束。大茬總真菌和酵母菌的生物量在發(fā)酵0～7 d差異不大，呈快速增長趨勢，且均在發(fā)酵結束達到最高（1.07×1015、1.56×1014copies/g酒醅DNA）。二茬總真菌和酵母菌在發(fā)酵過程中呈先增后減趨勢。二茬中總真菌和酵母菌的生物量均在第7天達到最大值（1.51×1015、1.43×1014copies/g酒醅 DNA），第 7 天至發(fā)酵結束，總真菌和酵母菌的生物量逐漸降低。

在清香型白酒發(fā)酵過程中，酵母菌和乳酸菌是豐度最高的兩類微生物，與發(fā)酵過程產醇、產酸密切相關。由圖7可知，在整個發(fā)酵過程中總細菌生物量高于總真菌，耐酸乳桿菌的生物量高于酵母菌，采用qPCR方法輔助分析酒醅中優(yōu)勢菌能夠較全面地反映各發(fā)酵階段微生物群落結構。隨著發(fā)酵的進行，地缸內逐漸形成厭氧、高濃度的有機酸和乙醇等特殊環(huán)境[19-20]，大部分微生物由于不能適應而衰亡，然而乳酸菌和釀酒酵母菌屬于兼性厭氧菌，且能夠耐受較低的pH值，這些特性可能導致其逐漸成為發(fā)酵酒醅中主要微生物。但在二茬發(fā)酵后期，可能由于營養(yǎng)物質的逐漸消耗，各菌種的生長均受到限制，出現下降趨勢。

3 討論與結論

近些年qPCR方法雖然在醫(yī)藥、食品等研究中得到了廣泛的應用，但用于檢測白酒釀造過程中的微生物生物量還少見報道。本文針對汾酒發(fā)酵過程中功能菌群建立了一套qPCR方法，從基因組提取、設計引物、引物專一性驗證、標準曲線的建立、方法準確性的驗證，再到生產實踐的具體應用。本研究證實了耐酸乳桿菌和酵母菌為酒醅中的主體微生物，二者分別占總細菌和總真菌總和的80%以上。與瀘香型酒、芝麻香型等其他固態(tài)發(fā)酵體系相比，汾酒相應微生物菌群生物量除芽孢桿菌外數量級均高于前人研究。生物量是表征生物活性的一個重要指標，而白酒釀造微生物主要來源于大曲，推測該結果與汾酒大曲中低溫培制工藝相關。

傳統(tǒng)白酒固態(tài)發(fā)酵中，微生物菌群的結構與占比受環(huán)境因子以及微生物之間相互作用的影響。熒光定量PCR方法可與預測微生物學相結合，構建具有較強應用價值的數學模型，用于解析環(huán)境因素對微生物組成和生理特性的影響，微生物之間的相互作用關系，有助于實現發(fā)酵過程的人工調控。吳衍廉[13]在研究濃香型酒老窖時應用實時熒光定量PCR技術和預測微生物學建立了關于甲烷細菌與己酸菌的數學模型，開發(fā)了甲烷細菌與己酸菌共窖的二元發(fā)酵技術，探究兩種菌在二元發(fā)酵中的數量變化規(guī)律及環(huán)境對其發(fā)酵的影響，優(yōu)化了發(fā)酵工藝，降低了發(fā)酵成本。同時，該定量方法可以為研究釀酒微生物的生態(tài)模型提供基礎數據，為白酒走出地域化提供可能。本研究構建了特定類群的快速定量方法，有助于建立針對不同生產周期新產酒質量的科學、全面的統(tǒng)一標準體系。