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      基于CaCO3模板制備大豆蛋白微球及槲皮素的體外釋放研究

      2021-09-17 13:53:12董亞博蘭天趙俊娜江連洲隋曉楠張妍
      食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年17期
      關(guān)鍵詞:懸浮液槲皮素微球

      董亞博,蘭天,趙俊娜,江連洲,隋曉楠,張妍,2*

      1(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱,150030) 2(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院,黑龍江 哈爾濱,150030)

      在體內(nèi)條件下,微粒形態(tài)可以保護(hù)生物分子不被降解,并且有選擇性地達(dá)到控制釋放,同時(shí)也降低了免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[1]。近幾十年來(lái),微粒被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)[2]。蛋白質(zhì)和多肽作為重要的殼材料,在臨床中得到廣泛應(yīng)用[3]。大豆分離蛋白(soybean protein isolate,SPI)具有良好的理化性質(zhì)和功能性質(zhì)[4]。作為微粒的單一或復(fù)合殼材料,SPI已被廣泛使用。自組裝[5]、乳化[6]以及噴霧干燥[7]等是目前常用的制備微粒的方法,但是這些方法一般難以控制粒徑,且難以保持蛋白的品質(zhì)。目前,一種以CaCO3為模板制備微球的方式十分流行。

      CaCO3由于制備過(guò)程簡(jiǎn)單和溫和的分解條件,常用于多層膠囊的制造。制備的CaCO3顆粒是粒徑均一、多孔的球體[8]。利用靜電吸附作用也可以實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)微球的制備。如利用CaCO3制備花青素微球,改善花青素的遞送和消化規(guī)律[9]。通過(guò)CaCO3的模板作用改進(jìn)阿霉素-殼聚糖微球,改善阿霉素在體內(nèi)的消化特性等[10]。

      槲皮素是對(duì)人體十分有益的物質(zhì)。然而,槲皮素的水溶性低,生物利用度差,以及在生理介質(zhì)中的不穩(wěn)定性,限制了槲皮素作為健康促進(jìn)劑的應(yīng)用。本研究首次將SPI應(yīng)用到CaCO3模板上,制備大豆蛋白微球,通過(guò)包埋率的計(jì)算、掃描電鏡、冷凍電鏡等方法,對(duì)SPI包埋特性以及蛋白微球性能進(jìn)行分析。并以槲皮素為例,制備槲皮素-蛋白質(zhì)復(fù)合微球,探究其對(duì)槲皮素模擬體外釋放特性的影響,以期該大豆蛋白微球?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、藥物等在體內(nèi)遞送提供新型的運(yùn)輸載體。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      大豆,黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院;無(wú)水氯化鈣、無(wú)水碳酸鈉,恒興化學(xué)試劑制造有限公司;實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純。

      UV-2600紫外分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;Microfuge 20R冷凍離心機(jī),美國(guó)貝克曼公司;S-3400 N SEM場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡,日本日立公司;Mastersizer 2000激光粒度儀,英國(guó)馬爾文儀器有限公司;rf-6000熒光譜儀,日本島津公司。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 大豆分離蛋白的制備

      參考鞠夢(mèng)楠等[11]的方法,將脫脂豆粉分散在蒸餾水中,用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0,并離心,收集上清液并用2 mol/L HCl溶液將pH值調(diào)節(jié)至4.5,離心收集沉淀物并用2 mol/L NaOH溶液調(diào)至中性,然后水洗除去雜質(zhì),將此蛋白溶液冷凍干燥后得到SPI,經(jīng)研磨后放入干燥器備用。

      1.2.2 SPI-CaCO3復(fù)合微球的制備

      參考VOLODKIN等[12]的方法稍作修改,將10 mL 0.33 mol/L的Na2CO3溶液分別加入到含有不同質(zhì)量濃度SPI(0、1、3、5 mg/mL)的10 mL 0.33 mol/L的CaCl2溶液中?;旌先芤河么帕嚢杵髟? 000 r/min下攪拌30 min。然后將所得懸浮液過(guò)濾,將濾紙上剩余殘?jiān)谜麴s水沖洗3遍。沉淀放入烘箱烘干并稱質(zhì)量,收集所有的濾液及漂洗水。利用紫外分光光度計(jì)在280 nm處測(cè)定懸浮液濾液和漂洗水的吸光值,以此計(jì)算濾液中蛋白的含量。包埋率計(jì)算如公式(1)所示:

      (1)

      未包埋的蛋白含量為測(cè)得的濾液和漂洗水中的蛋白含量總和。利用包埋率計(jì)算CaCO3上包埋蛋白質(zhì)的質(zhì)量,總沉淀物的質(zhì)量減去這部分蛋白質(zhì)的質(zhì)量,將剩余其他沉淀物的質(zhì)量除以Na2CO3與CaCl2質(zhì)量之和,計(jì)算得出CaCO3的產(chǎn)率。蛋白質(zhì)的荷載比計(jì)算如公式(2)所示:

      (2)

      1.2.3 大豆蛋白微球的制備

      參考MADADLOU等[13]的方法稍作修改,將CaCO3沉淀按其原pH進(jìn)行復(fù)溶,并向SPI-CaCO3復(fù)合微球懸浮液(10 mg/mL)中加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(0.1 unit/mg SPI),磁力攪拌2 h(37 ℃,200 r/min)。攪拌結(jié)束后,將CaCO3顆粒懸浮液冷卻至室溫,并把配制好的0.25 mol/L 的乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)與SPI-CaCO3復(fù)合微球懸浮液按照體積比1∶1加入到懸浮液中。隨后將懸浮液磁力攪拌24 h(4 ℃,100 r/min),以此來(lái)螯合CaCO3模板。所得樣品在蒸餾水中透析3 d,除去EDTA和Ca2+,在透析袋中加入疊氮化鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.005%)來(lái)抑制微生物的生長(zhǎng)。

      1.2.4 粒徑表征

      參考VOLODKIN等[14]的方法稍加修改,利用激光粒度儀對(duì)CaCO3、SPI-CaCO3復(fù)合微球和大豆蛋白微球樣品進(jìn)行粒徑分布測(cè)定,以此來(lái)表征整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中CaCO3以及大豆蛋白的粒徑變化。

      1.2.5 冷凍掃描電鏡

      參考YU等[15]的方法稍加修改,將SPI-CaCO3復(fù)合微球和大豆蛋白微球分別放置在鋁鉑上,在液氮(-210 ℃)中進(jìn)行冷凍,隨后將冷凍后的樣品轉(zhuǎn)移到低溫系統(tǒng)中,最終在放大倍數(shù)50 000×下獲得冷凍掃描圖像。

      1.2.6 熱穩(wěn)定性分析

      根據(jù)MIRIANI等[16]的方法稍作修改,將SPI與制備好的大豆蛋白微球用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)稀釋到0.1 mg/mL,在80 ℃下加熱20 min。使用280 nm的激發(fā)光譜以及300~450 nm的發(fā)射光譜對(duì)加熱后的樣品進(jìn)行熒光檢測(cè)。

      1.2.7 槲皮素-蛋白質(zhì)復(fù)合微球的制備

      將0.1 g槲皮素與10 mL 0.33 mol/L的Na2CO3進(jìn)行混合,利用磁力攪拌器在300 r/min下攪拌15 min,隨后將10 mL 0.33 mol/L CaCl2加入混合溶液,后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作與大豆蛋白微球制備方法一致,制備完成即為蛋白質(zhì)槲皮素復(fù)合微球。

      1.2.8 槲皮素-蛋白質(zhì)復(fù)合微球的定量及體外釋放

      將20 mg槲皮素-蛋白質(zhì)復(fù)合微球溶于20 mL PBS中,加入2 μL水解蛋白酶,在50 ℃下水解3 h,用紫外分光光度計(jì)在374 nm波長(zhǎng)下測(cè)定水解液吸光值,從而確定復(fù)合微球中槲皮素含量。參考MINEKUS等[17]的方法,配制胃、腸模擬液,取20 mg樣品溶液于20 mL電解液中,胃部的模擬pH值為3,加入25 000 U/mg的胃蛋白酶,隨后將混合液置于透析袋中,每15 min取1次透析液,利用紫外分光光度計(jì)在374 nm下測(cè)定吸光值。將樣品在胃部的模擬環(huán)境中釋放1 h,隨后加入15 000 U/mg的胰蛋白酶以及5 mg/mL的膽鹽,將pH值調(diào)節(jié)至7,后續(xù)與胃部模擬一致。釋放過(guò)程中取透析液在374 nm處測(cè)定吸光值。

      1.3 統(tǒng)計(jì)分析

      所有的測(cè)量均在3次以上,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA) 和鄧肯檢驗(yàn)(P<0.05)。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 包埋特性的分析

      由圖1可知,加入SPI后CaCO3的生成率沒(méi)有明顯變化。但包埋率隨著SPI濃度的增加有所下降,而裝載率隨著蛋白濃度的增加而相應(yīng)的增加。在MADADLOU等[13]的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了相似的變化規(guī)律。這可能與SPI吸附到CaCO3微球表面的方式有關(guān)。一般來(lái)說(shuō),由于CaCO3多孔的結(jié)構(gòu)會(huì)為SPI的吸附提供一定的毛細(xì)力,CaCO3與蛋白質(zhì)攜帶的不同電荷也為吸附作用提供了靜電相互作用。當(dāng)包埋到CaCO3表面的SPI到達(dá)一定量后,毛細(xì)力和靜電相對(duì)減弱,因此SPI不會(huì)無(wú)休止的吸附到CaCO3上。近年來(lái),BABABUSHEVICH等[18]研究了抑肽酶、胰島素和過(guò)氧化氫酶包埋到CaCO3上的包埋規(guī)律,發(fā)現(xiàn)相較于蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量,蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)更能主導(dǎo)裝載量的變化。因此可以推斷靜電相互作用是蛋白質(zhì)包埋的主要作用力。

      圖1 SPI添加量對(duì)CaCO3的包埋特性的影響Fig.1 The yield of CaCO3 microparticles,coating efficiency and loading ratio in different SPI concentration

      2.2 粒徑分析

      由圖2可知,CaCO3的粒徑比較均一,主要分布在3~12 μm,這與VOLODKIN等[12]的研究結(jié)果一致。CaCO3因其具有非常小的粒徑分布范圍,在一些抗癌藥物的遞送中有著優(yōu)異的表現(xiàn)[19]。如圖2所示,在CaCO3模板上包埋SPI后,SPI-CaCO3復(fù)合微球的粒徑會(huì)增大。D50指樣品的累計(jì)粒度分布百分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的粒徑。樣品A~D的D50分別是9.150, 10.258, 11.701和8.669μm。結(jié)合圖3掃描電鏡圖片,在加入SPI后,生成的SPI-CaCO3復(fù)合微球是非常圓滑的球面,而未加蛋白的CaCO3微球表面附著了一些不規(guī)則的CaCO3附著物,由此推斷這可能是在加入SPI后復(fù)合微球粒徑減小的主要原因,在MADADLOU等[13]的研究中也解釋了類似的現(xiàn)象,在加入蛋白后促進(jìn)了離子更好的融合,減少了不規(guī)則的物質(zhì),從而形成了更小的微粒。當(dāng)使用EDTA螯合CaCO3后,蛋白微球的粒徑增大,這可能是因?yàn)槟0宓娜コ筍PI不能繼續(xù)維持完整球形結(jié)構(gòu),具有“坍塌”的現(xiàn)象,因此粒徑會(huì)增大。

      A-CaCO3微球;B-1 mg/mL SPI-CaCO3復(fù)合微球;C-3 mg/mL SPI-CaCO3復(fù)合微球;D-5 mg/mL SPI-CaCO3復(fù)合微球; E-1 mg/mL SPI微球;F-3 mg/mL SPI微球;G-5 mg/mL SPI微球圖2 粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution

      2.3 掃描電鏡分析

      由圖3-a可知,未添加SPI的CaCO3表面多孔,賦予了它非常高的表面積。由圖3-b可知,添加SPI后,CaCO3的表面十分光滑,且更加均一,分散程度更好,這可能是由于SPI的加入限制了CaCO3的成長(zhǎng),減少了表面附著的不規(guī)則的CaCO3[20]。由圖3-c可知,當(dāng)SPI失去CaCO3模板的支撐后會(huì)形成塌陷的結(jié)構(gòu),不會(huì)繼續(xù)維持完整的球形。這些結(jié)構(gòu)的變化也與粒徑的變化規(guī)律相符,表面附著物的減少,使得粒徑有所降低,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的坍塌變形,造成粒徑變大。在VOLODKIN等[21]的實(shí)驗(yàn)中,有著類似的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象,蛋白質(zhì)的脫水以及脫去模板后蛋白質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度降低是造成蛋白質(zhì)坍塌的主要原因[22]。但是即便如此,蛋白微球依舊維持著多孔的結(jié)構(gòu),這為蛋白微球作為遞送載體承載藥物或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供了可能,類似球形的結(jié)構(gòu)也使蛋白微球擁有制備高蛋白飲料的機(jī)會(huì)。

      a-CaCO3;b-3 mg/mL SPI-CaCO3復(fù)合微球;c-3 mg/mL SPI微球圖3 CaCO3、3 mg/mL SPI-CaCO3復(fù)合微球和3 mg/mL SPI微球的掃描電鏡圖Fig.3 The scanning electron microscopy (SEM) images of CaCO3,3 mg/mL CaCO3-SPI microparticles,and 3 mg/mL SPI microparticles

      2.4 蛋白微球的熱穩(wěn)定性分析

      由圖4可知,相較于SPI,將SPI制備成蛋白微球后,熒光強(qiáng)度有所增加。一般情況下,堿性環(huán)境使蛋白質(zhì)變性,從而在355 nm附近有吸收峰,但本實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)在355 nm處沒(méi)有出現(xiàn)吸收峰,這代表堿性條件沒(méi)有使蛋白質(zhì)變性[23]。隨著蛋白質(zhì)濃度的增加,熒光強(qiáng)度有所降低,熒光的強(qiáng)度與蛋白質(zhì)內(nèi)疏水性色氨酸殘基的暴露程度密切相關(guān),同時(shí)二硫鍵會(huì)淬滅色氨酸熒光,?;霓D(zhuǎn)移也會(huì)使熒光降低[24]。熒光強(qiáng)度的降低可能是由于蛋白質(zhì)濃度增加時(shí),蛋白質(zhì)被谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化生成了更多的二硫鍵以及?;霓D(zhuǎn)移所致。此外,經(jīng)過(guò)加熱的蛋白微球僅發(fā)生了較小范圍的紅移(由333 nm紅移到337 nm),然而未經(jīng)加工的SPI則發(fā)生了較大的紅移(由328nm紅移到344 nm)。熱處理會(huì)通過(guò)破壞氫鍵和非極性疏水基團(tuán)來(lái)影響蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)的破壞使得熒光峰值發(fā)生偏移。因此,蛋白微球的制備增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

      圖4 不同濃度下制備的蛋白微球和加熱后的 蛋白微球熒光圖譜Fig.4 Fluorescence spectra of unheated and heated SPI,SPI microparticles of different concentration

      2.5 槲皮素-蛋白質(zhì)復(fù)合微球體外釋放

      槲皮素在人體內(nèi)的吸收主要在小腸,所以槲皮素的延緩釋放非常重要,通過(guò)對(duì)槲皮素蛋白質(zhì)復(fù)合微球的體外釋放行為的研究能夠很好地評(píng)價(jià)復(fù)合微球的緩釋行為。如圖5所示,槲皮素-蛋白質(zhì)復(fù)合微球在模擬胃部釋放的過(guò)程中呈現(xiàn)出勻速的釋放方式,2 h內(nèi)釋放量達(dá)到槲皮素總量的32.419%,在腸道內(nèi)的釋放,前期釋放較慢,在45~90 min內(nèi)釋放速度較快,達(dá)到槲皮素總量的35.580%,后續(xù)在釋放時(shí)間為4 h時(shí)達(dá)到槲皮素總量的71.205%,證實(shí)了蛋白微球?qū)﹂纹に氐尼尫庞幸欢ǖ难泳忈尫诺淖饔?。?fù)合微球在模擬胃液和模擬腸液中都沒(méi)有達(dá)到100%的釋放量,這可能是由于復(fù)合微球制備過(guò)程中碳酸鈣的脫去不完全,導(dǎo)致復(fù)合微球中碳酸鈣對(duì)蛋白質(zhì)及槲皮素有一定的吸附作用,從而影響了槲皮素的釋放速率。

      a-pH 3;b-pH 5圖5 槲皮素-蛋白復(fù)合微球的體外模擬釋放特性Fig.5 In vitro release profiles of quercetin-CaCO3 composite microsphere

      3 結(jié)論與討論

      在本研究中,利用多孔、高表面積、粒徑均一的碳酸鈣作為模板,首次將大豆分離蛋白包埋到碳酸鈣模板上,通過(guò)調(diào)節(jié)不同的蛋白加入量,螯合掉碳酸鈣模板,制備出粒徑均一的蛋白微球,主要為需要在體內(nèi)特定部位釋放的物質(zhì)提供一種新型的更天然、更具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的運(yùn)輸載體,并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了探究。通過(guò)電子顯微鏡,激光共聚焦和冷凍電鏡結(jié)果可知,蛋白質(zhì)的加入會(huì)改善碳酸鈣不規(guī)則的樣貌,蛋白質(zhì)會(huì)進(jìn)入到碳酸鈣的表面以及孔隙中,且制備的蛋白微球維持多孔結(jié)構(gòu),具有作為微膠囊遞送藥物或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的潛力。最后通過(guò)對(duì)熱處理后的蛋白微球進(jìn)行熒光分析可知,本實(shí)驗(yàn)制備的蛋白微球具有較好的熱穩(wěn)定性,能夠承受巴氏殺菌等需加熱的加工過(guò)程。槲皮素作為示例物質(zhì),其在微球中釋放特性表明,復(fù)合微球?qū)﹂纹に鼐哂幸欢ǖ木忈屪饔?這一結(jié)果有效解決了槲皮素生物利用度差的問(wèn)題,因此大豆蛋白微球作為一種遞送載體具有一定的可行性。

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