許英瑞,朱妍麗,薛元泰,張衛(wèi)兵,楊曉麗,張炎,馬瑞娟,王瑩,文鵬程*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730070) 2(甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司,甘肅 蘭州,730000)

黑枸杞(LyciumruthenicumMurray)為茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)多棘刺灌木[1],主要分布于我國(guó)的甘肅、寧夏、新疆、內(nèi)蒙古、西藏和陜北的黃土高原一帶,生長(zhǎng)于鹽堿、干旱和沙漠地區(qū)[2]。在古代,黑枸杞就已被用于治療心臟病、更年期和月經(jīng)不調(diào)等疾病[3],其果實(shí)含有豐富的生物活性物質(zhì)[4],多糖作為黑枸杞果實(shí)最主要的活性成分之一,具有抗氧化[5]、抗輻射[6]、增強(qiáng)機(jī)體免疫[7]等能力。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)黑枸杞多糖的研究主要集中于高效提取、結(jié)構(gòu)特征和生物活性方面,熱水浸提是提取黑枸杞多糖最常用且較為簡(jiǎn)單的方法,但是高溫和較長(zhǎng)的提取時(shí)間會(huì)導(dǎo)致多糖降解[8]。超聲波能有效破壞細(xì)胞壁,增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)容物的傳質(zhì)能力,可以大幅縮短提取時(shí)間,提高提取率[9]。

黑枸杞因其多糖、花青素類物質(zhì)含量較高而作為一種天然抗氧化物被廣泛應(yīng)用于食品保鮮領(lǐng)域[10]。乳酸菌作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品的主要發(fā)酵菌株,不僅能夠利用碳水化合物生成乳酸,還可以發(fā)酵糖類產(chǎn)生豐富的風(fēng)味物質(zhì),在發(fā)酵食品中發(fā)揮著重要的作用[11]。

活性多糖可以作為促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)或改善發(fā)酵乳抗氧化能力的添加劑[12-15],然而將多糖直接應(yīng)用于乳酸菌本身以研究多糖對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)特性或抗氧化能力影響等方面卻鮮有報(bào)道。本文以野生黑枸杞為原料,采用單因素與響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲波提取黑枸杞多糖的工藝條件；研究黑枸杞多糖對(duì)嗜熱鏈球菌G2與副干酪乳桿菌L9的生長(zhǎng)特性的影響以及多糖對(duì)2株乳酸菌抗氧化能力的影響,初步探索將黑枸杞多糖應(yīng)用于發(fā)酵乳制品以及發(fā)酵食品的可行性,為開(kāi)發(fā)更多的活性多糖食品打好堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑枸杞,采自甘肅民勤,均為野外生長(zhǎng),鮮果采摘經(jīng)自然晾干后保存于4 ℃冰箱；副干酪乳桿菌L9、嗜熱鏈球菌G2,由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院分離鑒定并保存；L9與G2的培養(yǎng)分別采用MRS固體培養(yǎng)基與GM17固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基同為MRS與GM17。

苯酚、濃硫酸、乙醇(95%)、正丁醇、三氯甲烷、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、鐵氰化鉀、抗壞血酸等,均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-ⅡD超聲細(xì)胞破碎儀、Scientz-ND真空冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司；723型可見(jiàn)分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、HG303-4電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黑枸杞的預(yù)處理

篩選表面無(wú)傷口且無(wú)腐爛的野生黑枸杞,放置于室外陽(yáng)光充足處自然曬干,將曬干的黑枸杞干果粉碎并過(guò)篩網(wǎng),保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 超聲波提取黑枸杞多糖的工藝優(yōu)化

1.3.2.1 黑枸杞多糖浸提液的制備

稱量黑枸杞粉末2.00 g,加入一定量的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆虿⑦M(jìn)行超聲波提取。完成后離心(4 000 r/min,15 min)并抽濾,去沉淀留上清液,精確吸取上清液1 mL于100 mL容量瓶,定容后用于多糖含量的測(cè)定。

1.3.2.2 黑枸杞多糖含量的測(cè)定

采用硫酸-苯酚法[16],葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=11.429x-0.022 4,R2=0.993 2；多糖提取率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：0.9,葡萄糖轉(zhuǎn)化為多糖的轉(zhuǎn)化因子；n,多糖浸提液稀釋倍數(shù)；ρ,多糖浸提液中糖濃度,g/L；V,提取液總體積,mL；m,所稱取黑枸杞粉末的質(zhì)量,g。

1.3.2.3 單因素試驗(yàn)

稱量黑枸杞粉末2.00 g,設(shè)定超聲波功率為250 W、超聲時(shí)間15 min,顆粒過(guò)篩目數(shù)為60目,選用不同液料比[20、30、40、50、60 (mL∶g)]探究液料比對(duì)黑枸杞多糖提取率的影響；設(shè)定液料比為上述單因素最佳、超聲功率為250 W、過(guò)篩目數(shù)為60目,選用不同提取時(shí)間(5、10、15、20、25 min)探究超聲時(shí)間對(duì)黑枸杞多糖提取率的影響；設(shè)定液料比和超聲時(shí)間為上述單因素試驗(yàn)最佳、過(guò)篩目數(shù)為60目,探究不同超聲功率(50、150、250、350、450 W)對(duì)黑枸杞多糖提取率的影響；在液料比、超聲時(shí)間、超聲功率為最佳的基礎(chǔ)上,選用不同的篩網(wǎng)(20、40、60、80、100目)探究黑枸杞顆粒粒度大小對(duì)多糖提取率的影響。

1.3.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

由圖1-d可知,當(dāng)篩網(wǎng)孔徑<60目時(shí),多糖提取率提升并不顯著,且篩網(wǎng)孔徑越小原料浪費(fèi)越多,故選擇液料比(A)、超聲時(shí)間(B)、超聲功率(C)3個(gè)單因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of the Box-Behnken experiment design

1.3.3 黑枸杞多糖凍干粉的制備

采用最優(yōu)工藝制備黑枸杞多糖浸提液,將浸提液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/4,加4倍體積的95%乙醇4 ℃醇沉24 h后離心得沉淀,沉淀用無(wú)水乙醇清洗(脫脂)3次,加純水復(fù)溶并使用Sevag試劑進(jìn)行脫蛋白操作,將上清液保留并分裝于培養(yǎng)皿進(jìn)行冷凍干燥后得黑枸杞粗多糖凍干粉,保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.4 乳酸菌的純化培養(yǎng)

無(wú)菌環(huán)境下,分別稱取L9與G2的凍干菌粉0.06 g于100 mL生理鹽水(0.85%)中復(fù)水30 min,以10倍梯度稀釋法取10-4～10-8五個(gè)濃度梯度涂平板,放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后挑取生長(zhǎng)良好的單菌落劃線培養(yǎng)3代,經(jīng)鏡檢確定為純種菌后保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.5 黑枸杞多糖對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)特性的影響

無(wú)菌環(huán)境下挑取預(yù)先純化的乳酸菌單菌落于液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)3代,制得液體種子。將黑枸杞多糖按不同添加量[17](0、0.5、1、1.5 g/L)加入新鮮無(wú)菌的液體培養(yǎng)基加熱使其溶解并滅菌,待冷卻后按1%的接種量接入液體種子,放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱待測(cè)。

乳酸菌的生長(zhǎng)曲線[18]采用比濁法繪制；產(chǎn)酸用pH計(jì)直接測(cè)定。

1.3.6 黑枸杞多糖對(duì)乳酸菌抗氧化能力的影響

1.3.6.1 乳酸菌菌懸液及無(wú)細(xì)胞提取物的制備

乳酸菌的活化培養(yǎng)同1.3.5。將黑枸杞多糖按不同的添加量(0.0、0.5、1.0、1.5 g/L)加入新鮮無(wú)菌的液體培養(yǎng)基,加熱使其溶解,滅菌后冷卻至37 ℃接入液體種子,放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

將培養(yǎng)完成的乳酸菌液體培養(yǎng)基離心(10 000 r/min,20 min)后獲得乳酸菌菌體,用PBS緩沖液(0.02 mol/L,pH=7.4)洗滌2次以除去殘留的培養(yǎng)基成分與多糖成分,將乳酸菌菌體重懸于PBS緩沖液中并調(diào)節(jié)菌液濃度為1.0×109CFU/mL(OD600=1.0)；共設(shè)置2組菌懸液,一組為完整細(xì)胞組(intact cells,IC),另一組進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎處理(300 W,20 min；開(kāi)5 s,關(guān)5 s)后離心(10 000 r/min,20 min)取上清液作為無(wú)細(xì)胞提取物(cell free extracts,CFE)。

1.3.6.2 抗氧化能力的測(cè)定

DPPH自由基清除能力的測(cè)定參考RIZZELLO等[19]的方法,總還原力的測(cè)定參考WU等[20]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所做平行次數(shù)均為3次,取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),Origin 2018繪圖,SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析,Design-Expert.V 8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1呈現(xiàn)了液料比、超聲時(shí)間、超聲功率、篩網(wǎng)孔徑大小的單因素試驗(yàn)結(jié)果。分析黑枸杞多糖的提取率隨各個(gè)單因素不同水平的變化規(guī)律并綜合考慮實(shí)際操作與節(jié)能等原因,選擇液料比為40(mL:g)、超聲15 min、超聲波功率為350 W作為最佳條件,并在液料比30～50(mL:g)、超聲10～20 min、超聲波功率250～450 W進(jìn)行中心復(fù)合試驗(yàn)。

a-料液比；b-超聲波時(shí)間；c-超聲波功率；d-過(guò)篩目數(shù)圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Single factor experiment results 注：圖中不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

本次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)共17組,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

續(xù)表2

2.2.2 回歸模型分析

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

模型中1次項(xiàng)A、B、C,2次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)多糖的提取率影響高度顯著(P<0.01)；交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)多糖的提取率影響不顯著；方差分析結(jié)果表明,影響黑枸杞多糖提取率的因素主次順序?yàn)椋撼暪β?超聲時(shí)間>液料比。

2.2.3 響應(yīng)面作用交互分析

由圖2可知,各個(gè)交互項(xiàng)之間均呈現(xiàn)不同的彎曲程度,其中圖2-a的響應(yīng)曲面圖相對(duì)較陡,故因素B和A交互效應(yīng)最大,該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

a-提取時(shí)間與液料比；b-提取功率與液料比；c-提取功率與提取時(shí)間圖2 各因素交互作用對(duì)黑枸杞多糖提取率的影響Fig.2 Effect of interaction of various factors on extraction rate of L.ruthenicum Murray polysaccharide

2.2.4 超聲波提取黑枸杞多糖最佳工藝參數(shù)確定

通過(guò)模型預(yù)測(cè)得到黑枸杞多糖的最佳提取條件為：液料比41.46(mL∶g),提取15.78 min,提取功率416.66 W,黑枸杞多糖的提取理論值為14.106%。依據(jù)最佳條件并考慮實(shí)際操作將其做出調(diào)整：液料比41.5(mL∶g),超聲16 min,超聲波功率418 W。以該實(shí)際提取條件為基礎(chǔ)進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn),得到黑枸杞多糖的實(shí)際提取率為(14.13±0.74)%,與預(yù)測(cè)值相差不大,說(shuō)明此提取條件適用于黑枸杞多糖提取工藝的優(yōu)化。將得到的黑枸杞多糖凍干粉加三級(jí)水復(fù)溶,溶解后采用硫酸-苯酚法測(cè)得其多糖含量為65%。

2.3 黑枸杞多糖對(duì)G2、L9生長(zhǎng)特性的影響

圖3-a顯示了黑枸杞多糖對(duì)嗜熱鏈球菌G2生長(zhǎng)特性的影響。結(jié)果表明,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),黑枸杞多糖不僅縮短了G2的生長(zhǎng)停滯期使其提前進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,而且加快了乳酸菌的增殖速度,整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程多糖組生物量始終高于對(duì)照組；由產(chǎn)酸曲線可知,黑枸杞多糖能夠加速體系pH下降速度。不同多糖添加量處理中,0.5 g/L多糖組不僅獲得了最大的乳酸菌生物量,同時(shí)pH下降速度也最快,表明0.5 g/L的黑枸杞多糖對(duì)嗜熱鏈球菌G2的促生長(zhǎng)效果明顯。

a-嗜熱鏈球菌G2；b-副干酪乳桿菌L9圖3 黑枸杞多糖對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)特性的影響Fig.3 Effect of L.ruthenicum Murray polysaccharides on the growth characteristics of lactic acid bacteria

圖3-b反映了黑枸杞多糖對(duì)副干酪乳桿菌L9生長(zhǎng)特性的影響。添加黑枸杞多糖的培養(yǎng)過(guò)程中,L9的生長(zhǎng)沒(méi)有出現(xiàn)明顯的停滯期,能較快適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；培養(yǎng)過(guò)程中,黑枸杞多糖延長(zhǎng)了L9的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,并加快了乳酸菌的增殖速度。產(chǎn)酸曲線顯示,不同多糖添加水平,其pH下降速度與對(duì)照組幾乎保持一致,說(shuō)明黑枸杞多糖對(duì)L9產(chǎn)酸影響較弱,這可能是由于L9前期產(chǎn)酸較多、產(chǎn)酸速率較快導(dǎo)致乳酸菌的生長(zhǎng)環(huán)境受到限制,無(wú)法從多糖及其他成分中吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行代謝,使乳酸菌的生長(zhǎng)受到了抑制；不同多糖含量對(duì)L9的促生長(zhǎng)效果影響微弱,且各多糖組間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 黑枸杞多糖對(duì)G2、L9抗氧化能力的影響

2.4.1 黑枸杞多糖對(duì)G2、L9 DPPH自由基清除能力的影響

由圖4-a可知,黑枸杞多糖對(duì)嗜熱鏈球菌G2清除DPPH自由基的能力影響顯著。G2本身清除自由基的能力較弱,G2的菌懸液(IC-G2)清除自由基的能力稍強(qiáng)于G2的無(wú)細(xì)胞提取物(CFE-G2)；將黑枸杞多糖應(yīng)用于G2生長(zhǎng)環(huán)境,發(fā)現(xiàn)IC-G2與CFE-G2清除自由基的能力均顯著提升(P<0.05),且清除效果隨多糖添加量的增加而顯著提高(P<0.05)；其中,1.5 g/L的多糖組其IC-G2與CFE-G2均獲得了最高的自由基清除率,這可能是由于黑枸杞多糖同時(shí)促進(jìn)了G2胞內(nèi)與胞外抗氧化物質(zhì)的生成,從而提高清除DPPH自由基的能力。由圖4-c可知,黑枸杞多糖對(duì)副干酪乳桿菌L9清除DPPH自由基的能力無(wú)顯著提升效果。對(duì)比不同處理組,發(fā)現(xiàn)黑枸杞多糖對(duì)L9的菌懸液(IC-L9)清除自由基的能力影響并不顯著(P>0.05),只有微弱的提升效果；對(duì)L9的無(wú)細(xì)胞提取物(CFE-L9)清除自由基的能力影響顯著(P<0.05),但依賴較高的劑量關(guān)系,且各多糖組之間并無(wú)顯著差異。對(duì)比IC-L9與CFE-L9清除DPPH自由基的能力,發(fā)現(xiàn)IC-L9自由基清除率明顯高于CFE-L9,初步證明L9清除自由基的能力主要依靠胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)。

a-嗜熱鏈球菌G2；b-副干酪乳桿菌L9圖4 黑枸杞多糖對(duì)乳酸菌DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effect of L.ruthenicum Murray polysaccharide on DPPH free radical scavenging ability of lactic acid bacteria 注：完整細(xì)胞組(IC)的差異顯著用a的形式表示,無(wú)細(xì)胞提取物 組(CFE)的差異顯著用a’的形式表示(P<0.05)(下同)

2.4.2 黑枸杞多糖對(duì)乳酸菌還原力的影響

研究了黑枸杞多糖對(duì)此2株乳酸菌(嗜熱鏈球菌G2和副干酪乳桿菌L9)的還原力的影響。由圖5-b與圖5-c可知,黑枸杞多糖對(duì)G2與L9還原力的影響效果都較為顯著(P<0.05),IC-G2、CFE-G2與IC-L9、CFE-L9的還原力強(qiáng)度隨黑枸杞多糖添加量的增大而提高；通過(guò)對(duì)比IC與CF兩組數(shù)據(jù)間的差異,發(fā)現(xiàn)G2與L9其IC的還原力都強(qiáng)于CFE,且1.5 g/L的多糖組都獲得了最高的還原力。

a-嗜熱鏈球菌G2；b-副干酪乳桿菌L9圖5 黑枸杞多糖對(duì)乳酸菌還原力的影響Fig.5 Effect of L.ruthenicum Murray polysaccharide on the reducing power of lactic acid bacteria

3 討 論

本試驗(yàn)基于超聲波法提取黑枸杞多糖,得到多糖的實(shí)際提取率為(14.13±0.74)%,在同為超聲波法提取黑枸杞多糖的前提下,前人通過(guò)工藝優(yōu)化得出的提取率分別可以達(dá)到7.01%[21]、8.25%[5],本工藝在僅提取1次的條件下多糖提取率可達(dá)14.13%,與前人所得的多糖提取率相比,得到大幅提高。

黑枸杞多糖對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)特性影響的試驗(yàn)結(jié)果表明,添加量為0.5 g/L的多糖組對(duì)G2的促生長(zhǎng)作用表現(xiàn)最佳,但多糖含量對(duì)L9的促生長(zhǎng)效果影響微弱。孟鴿等[22]將霍山石斛多糖加入嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)環(huán)境中,發(fā)現(xiàn)添加6 g/L霍山石斛多糖能夠顯著提升其生物量,表現(xiàn)出最佳的促生長(zhǎng)作用。劉麗莎等[23]發(fā)現(xiàn),隨著白術(shù)多糖添加量的增大,植物乳桿菌的促生長(zhǎng)作用顯著增強(qiáng)并在2.0%時(shí)達(dá)飽和；但對(duì)嗜酸乳桿菌而言,白術(shù)多糖對(duì)其促生長(zhǎng)作用僅在1.0%的范圍內(nèi)隨多糖添加量增加而增強(qiáng),且促生長(zhǎng)效果明顯低于對(duì)植物乳桿菌的促生長(zhǎng)效果。這表明多糖能夠影響乳酸菌生長(zhǎng)的因素較多,機(jī)理較為復(fù)雜。

乳酸菌的抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示,G2與L9本身抗氧化性能較弱,2個(gè)菌株均不屬于高抗氧化菌種。本研究將黑枸杞多糖作用于乳酸菌生長(zhǎng)環(huán)境,得出隨著黑枸杞多糖添加量的增加,完整細(xì)胞懸液與無(wú)細(xì)胞提取物的抗氧化能力也逐漸上升,且1.5 g/L的多糖組對(duì)乳酸菌的抗氧化能力促進(jìn)效果最好。結(jié)果表明,通過(guò)黑枸杞多糖的添加,成功改善了菌株的抗氧化能力；同時(shí),王婧瑩[24]等研究發(fā)現(xiàn)0.1%～0.3%的NaCl能提高保加利亞乳桿菌的體外抗氧化能力,且0.2% NaCl抗氧活性最好,但是否為NaCl促進(jìn)了菌種抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生還有待驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素與響應(yīng)面設(shè)計(jì)獲得了黑枸杞多糖的最佳提取條件,得到一種簡(jiǎn)便且高效的黑枸杞多糖超聲提取方法,大幅縮短了黑枸杞多糖的提取時(shí)間并相對(duì)提高了多糖提取率。黑枸杞多糖不僅能夠促進(jìn)嗜熱鏈球菌G2的增殖并加快其降酸速度,而且延長(zhǎng)了副干酪乳桿菌L9的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；其中0.5 g/L多糖對(duì)G2的促生長(zhǎng)作用強(qiáng),但對(duì)L9促生長(zhǎng)效果影響不明顯；同時(shí),隨著黑枸杞多糖添加量的增加,G2與L9的抗氧化性能均有所提升,其中1.5 g/L多糖組抗氧化性能最強(qiáng)。黑枸杞多糖對(duì)2株乳酸菌生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用,并且能夠有效提升其抗氧化能力,本研究為今后有效發(fā)揮乳酸菌菌株的作用、開(kāi)發(fā)功能性發(fā)酵食品提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。