王康 徐成 吳晉鋒 楊愷 元冰

(蘇州大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 軟凝聚態(tài)物理及交叉研究中心, 蘇州 215006)

近年來, 單分子追蹤技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展為研究細胞膜界面生物學(xué)過程提供了一條新的途徑, 然而細胞膜內(nèi)生物分子運動的異質(zhì)性特征使得從大量分子軌跡中區(qū)分和分離不同的分子運動模式變得非常困難, 迫切需要發(fā)展簡單易行的分析方法.本文以蜂毒肽和單組分平板支撐脂膜的相互作用體系為例, 發(fā)展了一種利用單分子運動位移標(biāo)準(zhǔn)差的頻數(shù)分布來區(qū)分和分離不同運動模式脂分子的數(shù)據(jù)分析方法, 提供了比傳統(tǒng)基于位移或回旋半徑頻數(shù)分布的分析方法更高的準(zhǔn)確度和更多的定量信息.利用該方法成功分離得到了脂分子在平板膜內(nèi)的快慢兩種運動狀態(tài), 并發(fā)現(xiàn)其分布情況部分相符于脂分子在上下葉的位置分布; 在不同濃度蜂毒肽的表面吸附或跨膜成孔作用的影響下, 這兩部分脂分子的運動受到了不同的干擾.本文針對生物膜體系內(nèi)分子運動的復(fù)雜異質(zhì)性特征發(fā)展了一種實現(xiàn)分子運動模式分離的數(shù)據(jù)分析方法, 并利用此方法獲得了蜂毒肽破膜成孔的不同階段對脂膜上下葉的不同影響.該方法的開發(fā)將對利用單分子追蹤技術(shù)研究生物體系動力學(xué)過程有重要幫助.

1 引 言

近年來的諸多研究表明, 細胞膜不僅是隔絕細胞內(nèi)外環(huán)境的屏障, 還與細胞生物功能的實現(xiàn)緊密相關(guān).諸如配體-受體的識別和吸附、離子的跨膜輸運、病毒對細胞的感染、以及天然抗菌肽的破膜殺菌等許多復(fù)雜的生物反應(yīng)都發(fā)生在細胞膜界面系統(tǒng)中.因此, 深入理解細胞膜界面的性質(zhì)對于認(rèn)識和調(diào)控細胞的生物功能具有重要意義[1].

蜂毒肽與細胞膜的相互作用是一類典型的細胞膜界面相互作用系統(tǒng).蜂毒肽是最具代表性的抗菌肽種類之一, 包含26個氨基酸, 帶6個正電荷.根據(jù)目前普遍接受的觀點, 蜂毒肽與細胞膜的相互作用過程大致遵循“兩態(tài)”模型[1?4]: 當(dāng)吸附到膜表面后, 蜂毒肽會由原本的無規(guī)卷曲變?yōu)棣谅菪Y(jié)構(gòu); 當(dāng)達到某一臨界濃度, 這些吸附的多肽會進一步插入膜中, 形成跨膜孔和導(dǎo)致物質(zhì)泄漏.對于蜂毒肽與細胞膜的相互作用, 其研究方法主要集中在靜態(tài)表象的研究, 例如核磁共振成像、單層巨囊泡泄露檢驗等[5,6].例如, 我們曾經(jīng)結(jié)合共聚焦熒光成像技術(shù)和分子動力學(xué)模擬, 揭示了蜂毒肽在跨膜成孔過程中的“細胞膜對稱性破缺”模型[2,5].研究發(fā)現(xiàn), 蜂毒肽在膜表面的吸附和聚集會導(dǎo)致脂膜的變形和外葉脂分子的抽離, 由此帶來的脂膜對稱性破缺會降低多肽分子跨膜插入的自由能勢壘并促使“花冠型”跨膜孔的形成.近年來單分子追蹤技術(shù)的發(fā)展使得從單分子運動學(xué)的角度來揭示抗菌肽與細胞膜相互作用的更多分子細節(jié)成為可能[7?9].最近我們對蜂毒肽與脂膜作用過程中單個多肽的三維運動進行實時追蹤, 發(fā)現(xiàn)蜂毒肽跨膜過程中會形成U型多肽構(gòu)象, 并存在兩種不同插膜深度的亞穩(wěn)態(tài), 位置分別位于脂膜上葉的頭尾界面處以及下葉的頭尾界面處; 而單個磷脂分子的運動分析結(jié)果也揭示了多肽形成花冠型膜孔的動力學(xué)特性[10].然而, 這方面的研究尚處于起步階段, 還存在許多困難.一方面, 在細胞膜界面體系中組分分子會具有多種復(fù)雜的狀態(tài)以完成不同的生物功能, 例如細胞膜上脂筏的形成會導(dǎo)致不同區(qū)域內(nèi)脂分子運動的異質(zhì)性, 膜蛋白在發(fā)揮其生物功能與未發(fā)揮生物功能時處于兩種不同的運動狀態(tài)等[11,12].另一方面, 單分子追蹤實驗往往需要對大量數(shù)據(jù)(例如同一實驗參數(shù)下獲得幾百甚至上千條分子軌跡)進行復(fù)雜的數(shù)據(jù)處理[13].因此, 如何從這些復(fù)雜的運動學(xué)數(shù)據(jù)中準(zhǔn)確提取出不同的運動狀態(tài)并進行深入研究對于理解細胞膜界面體系非常重要.

本文以蜂毒肽與細胞膜相互作用過程為例, 針對細胞膜內(nèi)脂分子運動環(huán)境的復(fù)雜性, 提出了一種新的分子運動軌跡數(shù)據(jù)處理方法, 用于準(zhǔn)確區(qū)分大量單分子運動軌跡中所包含的不同運動狀態(tài), 從而避免了由于不同運動狀態(tài)相互耦合而可能導(dǎo)致的多肽-膜相互作用過程的錯誤信息.最終, 基于對不同濃度蜂毒肽作用下磷脂分子運動情況的研究, 從單分子運動學(xué)的角度闡釋了蜂毒肽對脂膜上下葉的影響及其濃度依賴性質(zhì).

2 實驗方法與模型

2.1 實驗材料

磷脂分子1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)、熒光標(biāo)記的磷脂分子1, 2-dipalmitoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (Rh-PE)、以及孔徑為100 nm的聚碳酸酯膜皆購于Avanti Polar Lipids.蜂毒肽購于南京杰肽生物科技有限公司.碘化鉀(KI)、硫代硫酸鈉(Na2S2O3)購于Sigma Aldrich.磷酸緩沖液(PBS)購于BioSharp.

2.2 樣品制備

支撐磷脂雙層膜以囊泡融合法制備: 向DOPC中混合入0.1%摩爾比的Rh-PE之后以氯仿溶液充分溶解(2.0 mg/mL), 隨后利用氮氣流吹干氯仿并真空干燥2 h以上, 以確保氯仿完全揮發(fā).加入一定體積的PBS溶液(0.2 mg/mL), 在200 W的功率下超聲45 min, 使其重新水化為囊泡, 隨后使用孔徑為100 nm的聚碳酸酯膜擠壓21次得到尺寸均勻的小囊泡分散液.將小囊泡溶液轉(zhuǎn)移至進行過親水化處理的樣品倉中, 室溫孵育2 h以上.最后使用1 mL的PBS溶液沖洗三遍以洗去未融合的小囊泡, 即可獲得熒光標(biāo)記的支撐磷脂雙層膜, 用以進行單分子追蹤實驗.在原始脂雙層膜觀察艙內(nèi)原位加入熒光淬滅劑(100 mmol/L KI,0.1 mmol/L Na2S2O3), 室溫孵育15 min后清洗三遍, 即可獲得上葉熒光淬滅的脂膜.在原始脂雙層膜觀察艙內(nèi)原位加入確定濃度的蜂毒肽溶液(0.5或5.0 mg/mL), 室溫孵育30 min后即可獲得在不同濃度蜂毒肽影響下的脂膜.

2.3 樣品表征

樣品的觀察采用裝有全內(nèi)反射 (TIRF, 100 × )鏡頭的熒光顯微鏡 (IX71; Olympus) 進行, 使用EMCCD (Andor DU-897 U) 采集圖片數(shù)據(jù), 采集幀率為30 fps.每個實驗體系皆進行至少3 次獨立重復(fù)實驗, 每次實驗在不同的樣品或同一樣品的不同區(qū)域共計采集6—8 組視頻數(shù)據(jù).視頻采集后, 采用Image J軟件MOSAIC 插件對所記錄的每一個熒光標(biāo)記脂質(zhì)的軌跡進行分析, 從中選取有效軌跡.

2.4 單分子運動軌跡分析

對于單分子運動軌跡, 需要分析其在x或y方向位移 (Δx或Δy)、回旋半徑(radius of gyration,Rg)、位移標(biāo)準(zhǔn)差(displacement standard deviation,Dstd), 并針對某一物理量統(tǒng)計該實驗體系中大量分子的頻數(shù)分布 (probability distribution function,PDF).

位移Δx (或Δy)是指軌跡中相隔某一時間段在x或y方向的位置變化:

回旋半徑( Rg) 是衡量軌跡在一段時間內(nèi)運動造成的尺寸大小的物理量:

其中, x和y分別代表某一時刻軌跡中的x以及y坐標(biāo), 〈 x〉 和 〈 y〉 對應(yīng)于這兩個坐標(biāo)的平均值.

一條軌跡位移的標(biāo)準(zhǔn)差(Dstd)是指一條軌跡中每一個時間點產(chǎn)生位移的標(biāo)準(zhǔn)差:

此外, 統(tǒng)計某一物理量在該體系中大量分子的頻數(shù)分布PDF是指統(tǒng)計物理量在各個數(shù)值范圍內(nèi)的出現(xiàn)次數(shù).

對該分布進行高斯函數(shù)擬合, 函數(shù)為

擬合參數(shù)包括a, b和c.擬合優(yōu)度是指用于衡量擬合函數(shù)與原數(shù)據(jù)相符程度的系數(shù).計算方法如下:

其中y為待擬合數(shù)值, yˉ 為其平均值, f為擬合值.R2越接近于1, 代表擬合函數(shù)對于原數(shù)據(jù)描述得越好.

2.5 數(shù)值模擬方法

對于理想布朗運動, 其位移的兩個分量Δx以及Δy應(yīng)滿足正態(tài)分布:

其中σ是這一正態(tài)分布的標(biāo)準(zhǔn)差, 其平均值為0,因此:

而用于衡量布朗運動擴散能力的物理量擴散系數(shù)滿足:

其中D為擬合參數(shù), 即擴散系數(shù).因此, 從形式上來說, 布朗運動的擴散能力可視為由位移的標(biāo)準(zhǔn)差決定.在數(shù)值模擬中, 我們根據(jù)這一特性, 利用正態(tài)隨機數(shù)生成器, 生成了不同擴散能力的布朗運動軌跡以便進一步研究(附錄圖A1).

3 結(jié)果與討論

3.1 模擬軌跡數(shù)據(jù): 利用不同分析方法實現(xiàn)運動模式分離

由于所使用的實驗體系和細胞膜自身的特點,磷脂分子在膜中的運動行為極其復(fù)雜.例如, 支撐磷脂雙層膜是單分子追蹤實驗中最常用的一種細胞膜模型.一般認(rèn)為, 由于支撐膜上下葉所處環(huán)境不同(下葉周圍的水層很薄, 僅有1 nm左右[14]),支撐膜中部分的磷脂分子會呈現(xiàn)出異常的擴散行為, 其擴散能力會處于較低的水平[15].此外, 由于受到蛋白或周圍環(huán)境的作用, 細胞膜中同一個脂分子在不同時刻也可能會體現(xiàn)出不同的運動模式[16,17].因此, 實驗中所獲得的數(shù)據(jù)常常是不同運動模式下的磷脂分子運動軌跡的混合.這一現(xiàn)象大大增加了對磷脂分子運動行為分析的難度, 因此迫切需要一種有效的方法來分離分子軌跡中的不同運動模式.目前常用方法主要是通過分析一定時間間隔內(nèi)分子在x或y方向位移(Δx或Δy)和回旋半徑( Rg)的頻數(shù)分布(PDF)來研究運動的情況[18], 但實際效果并不十分理想.

例如, 我們利用數(shù)值模擬方法生成了兩類不同運動模式的軌跡, 其中標(biāo)準(zhǔn)差較大的一類記為 Tfast,其 σ =1.25 , 而標(biāo)準(zhǔn)差較小的一類記為 Tslow, 其σ=1 , 混合之后的軌跡為 Tmixed.分別計算了上述三類軌跡的位移PDF和回旋半徑PDF的分布情況, 結(jié)果如圖1所示.這里, Tmixed的位移和回旋半徑的PDF由混合前兩類軌跡的平均值來產(chǎn)生:

圖1 利用傳統(tǒng)的位移和回旋半徑PDF進行軌跡分析 (a) 軌跡的位移頻數(shù)分布情況, 包括兩類原始軌跡 T (σ=1) ,T(σ=1.25) 和二者混合之后的軌跡 T mixed ; (b) 三類軌跡的回旋半徑頻數(shù)分布情況Fig.1.Conventional PDF analysis of the displacement and R g of trajectories: (a) Displacement PDF of the trajectories before mixing ( T (σ=1) , T (σ=1.25) ) and after mixing ( T mixed ); (b) R g PDF of the three conditions.

結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三類軌跡的位移PDF的區(qū)分度并不是很高, 特別是在Δx較小的部分, 差別很小.回旋半徑 Rg是通過計算一條軌跡每一時刻相對于平均位置的平均偏移水平來體現(xiàn)一條軌跡所代表的運動能力:

與前文所描述的位移PDF情況類似, 在軌跡的標(biāo)準(zhǔn)差相差較小的情況下, 不同軌跡之間 Rg的區(qū)別也較小, 不易區(qū)分.

鑒于此, 本文提出一類新的分析方法, 通過計算每一條軌跡位移的標(biāo)準(zhǔn)差(Dstd)來進行PDF分析, 以期實現(xiàn)不同軌跡運動模式的區(qū)分.如圖2(a)所示, 包含兩類運動模式軌跡的 Tmixed, 其Dstd頻數(shù)呈現(xiàn)典型的雙峰分布, 因此可以使用兩個高斯函數(shù)的疊加對這一分布進行擬合, 擬合所得的兩個高斯函數(shù)稱為 G1和 G2.為了精確區(qū)分這兩類不同的運動模式, 我們嘗試將這兩個高斯函數(shù)的交點作為區(qū)分兩種不同運動模式的閾值: 將低于這一閾值的部分記為, 而高于這一閾值的部分則為分離之后得到的軌跡數(shù)量 Ns與混合前 Tslow的軌跡數(shù)量 N0之比即為這一分離操作的準(zhǔn)確率:

圖2 利用Dstd頻數(shù)分布進行軌跡分析舉例 (a) T mixed(σ=1,1.25) ; (b) T mixed(σ=1,1.5); (c) T mixed(σ=1,2); (d) 三種Tmixed經(jīng)過Dstd軌跡分離法處理之后所得軌跡數(shù)量的準(zhǔn)確率Fig.2.Typical examples showing trajectory analysis based on the PDF of Dstd: (a) T mixed(σ=1,1.25); (b)Tmixed(σ=1,1.5);(c) T mixed(σ=1,2); (d) accuracy of the seperation shown in Fig.(a) (c).

圖2給出了利用此方法對具有不同σ值的混合軌跡組 Tmixed的處理效果(對應(yīng)的擬合優(yōu)度可見附錄表A1).結(jié)果表明, σ越大, Dstd頻數(shù)分布的兩個高斯峰之間的差別越明顯, 分離準(zhǔn)確率也越高;但即便是在σ較小的情況(如 σ =1.25 ), 其準(zhǔn)確率也仍高于90%.這些結(jié)果充分表明, 對于包含不同運動模式的分子軌跡來說, 利用Dstd頻數(shù)分布來進行分析具有比傳統(tǒng)位移和回旋半徑PDF分析方法更大的優(yōu)勢, 而利用高斯函數(shù)的交點作為區(qū)分兩種不同運動模式的閾值的方法也具有良好的定量區(qū)分效果.

3.2 平板磷脂雙層膜: 脂分子軌跡的Dstd頻數(shù)分布分析

使用傳統(tǒng)的囊泡融合法制備了平板支撐DOPC磷脂雙層膜, 利用單粒子追蹤技術(shù)追蹤了磷脂分子在膜內(nèi)的運動軌跡.圖3(a)和圖3(b)為典型的單個磷脂分子位置變化的時間序列照片和軌跡曲線,清晰顯示了該分子在膜內(nèi)的擴散運動行為.此外,導(dǎo)致磷脂分子具有不同運動模式的原因之一是其上下葉所處的環(huán)境不同, 因此我們在原始脂膜體系中加入熒光淬滅劑碘化鉀和硫代硫酸鈉, 以淬滅脂膜上葉的絕大部分熒光基團[17].然后, 利用Dstd頻數(shù)分布法對基于原始脂膜和上葉熒光淬滅后脂膜內(nèi)的脂分子軌跡數(shù)據(jù)(每種條件>1300條)分別進行了分析.

純脂膜中脂質(zhì)分子Dstd的頻數(shù)分布呈現(xiàn)出典型的雙峰分布(圖3(d)), 這符合已有研究中關(guān)于脂膜中存在部分異常擴散磷脂分子的推測[17,19].利用上文所述的方法分離軌跡, 得到該組軌跡相應(yīng)的Tslow和 Tfast所占比例分別為21.3%和78.7% (圖3(e),擬合參數(shù)及擬合優(yōu)度見附錄表A1和表A2).然而,對于加入熒光淬滅劑之后的脂膜系統(tǒng)(圖3(c)—圖3(e))[17], 盡管其Dstd的頻數(shù)仍呈雙峰分布, Tslow及 Tfast對應(yīng)高斯峰的位置, 兩個高斯峰的交點與加入前基本一致, 但分布情況卻發(fā)生了顯著變化:Tslow占軌跡總數(shù)量的比例顯著提高, 而 Tfast所占比例明顯降低(分別為49.7%和50.3%).考慮到淬滅劑會淬滅脂雙層上葉絕大多數(shù)的熒光基團, 這些結(jié)果表明 Tslow主要、卻非完全來源于脂膜下葉的脂分子, 而脂膜中磷脂分子自身運動異質(zhì)特性也應(yīng)對Tslow有所貢獻; 此外, 我們的結(jié)果還表明, 淬滅劑的加入盡管改變了磷脂膜上下葉中熒光分子的數(shù)目分布, 卻不會對磷脂分子的運動行為造成額外的影響.這些結(jié)果充分顯示了Dstd頻數(shù)分布軌跡分析法在分離不同運動模式脂分子軌跡上的有效性,同時也清楚表明了磷脂分子在膜內(nèi)擴散運動的異質(zhì)性, 并暗示了支撐脂雙層膜在仿生細胞膜或細胞器膜方面可能存在的局限性.

圖3 DOPC支撐脂雙層膜內(nèi)磷脂分子運動軌跡的Dstd的頻數(shù)分布分析 (a), (b) 典型的單個磷脂分子時間序列熒光成像照片(拍攝速率30 frames/s)及運動軌跡(總時長4.38 s).(c)—(e) 原始以及加入熒光淬滅劑之后的脂膜: (c)示意圖; (d)分子軌跡Dstd頻數(shù)分布情況; (e) T slow 與 T fast 比例柱狀圖.圖(c)中紅色為熒光脂分子, 藍色為無熒光脂分子Fig.3.PDF of Dstd of the lipid trajectories in a DOPC SLB before or after fluorescence quenching: (a), (b) Representative lipid molecule in a pristine membrane, its time-serial images (at 30 frames/s) and trajectory (with a time duration of 4.38 s); (c)?(e) schematic diagram, PDF of Dstd, and percentage histogram of the T slow and T fast , of the membrane before and after outer-leaflet fluorescence quenching.

作為比較, 我們同樣使用了傳統(tǒng)的 Rg頻數(shù)分布方法對磷脂運動軌跡進行了分析.如附錄圖A2(a)所示, Tmixed的頻數(shù)分布在 Rg≈0.7 的區(qū)域會呈現(xiàn)出反常高水平分布, 這是由原本兩種軌跡的標(biāo)準(zhǔn)差差距很大導(dǎo)致的.在現(xiàn)有文獻中, 也有學(xué)者直接利用 Rg值的大小以區(qū)分不同運動模式的軌跡.盡管在一定程度上, 利用 Rg分離軌跡與利用Dstd實現(xiàn)軌跡分離的結(jié)果有一定的相似度(附錄圖A2(b)和圖A2 (c)), 然而這一方法強烈依賴于分析者的主觀判斷來進行臨界 Rg值的選擇,并且分離閾值的確定會受頻數(shù)分布步長的影響.但Dstd頻數(shù)分析法由兩個高斯函數(shù)的交點作為閾值來定量區(qū)分, 且不會受到步長選擇的影響(附錄圖A3).

3.3 蜂毒肽導(dǎo)致的磷脂分子異常擴散行為

根據(jù)之前的研究結(jié)果, 蜂毒肽實現(xiàn)殺菌功能的細胞膜作用過程主要包括兩步: 多肽在細胞膜表面的吸附和聚集, 以及多肽的插膜和跨膜孔的形成.基于巨囊泡泄露測試的實驗結(jié)果顯示, 蜂毒肽導(dǎo)致跨膜孔道形成的臨界濃度約為3.0 μg/mL,僅在高于此臨界濃度時, 脂膜上吸附的多肽分子能夠形成跨膜孔道并造成顯著的物質(zhì)跨膜泄露(附錄圖A4(a)—圖A4 (d))[5].因此在實驗中, 我們選擇了遠低于或高于此臨界值的兩個多肽濃度體系(0.5與5.0 μg/mL)以實現(xiàn)多肽不同的作用狀態(tài): 在0.5 μg/mL蜂毒肽濃度的體系中, 多肽主要呈現(xiàn)為脂膜表面吸附的狀態(tài), 該狀態(tài)恰好對應(yīng)于多肽跨膜成孔的中間態(tài)時間過程; 而當(dāng)濃度達到5.0 μg/mL, 部分多肽分子會在脂膜內(nèi)形成跨膜孔道(附錄圖A4(e)—(f))[10].因此對這兩個濃度體系下蜂毒肽與細胞膜相互作用狀態(tài)的研究, 有助于深入了解蜂毒肽殺菌活性的濃度依賴性, 以及它破膜殺菌的動力學(xué)過程.

基于對不同蜂毒肽濃度(0.5或5.0 μg/mL)的脂膜體系中、大量脂分子擴散行為追蹤(每種條件下約600條軌跡)、Dstd頻數(shù)分布分析及相應(yīng)的雙高斯峰擬合, 分別得到了 Tslow以及 Tfast軌跡組(圖4(a),(b), 擬合結(jié)果見表1, 相應(yīng)擬合優(yōu)度見附錄表A3).與原始脂膜相比, 高濃度體系中Tfast峰位顯著左移(由0.37到0.29, 降低了約21.6%),意味著 Tfast軌跡組的脂分子運動速率明顯變慢; 峰的寬度顯著變窄(半高寬由原始的0.11降至0.08,降低了約27.3%), 同時 Tfast組脂分子所占比例發(fā)生了明顯提高(由純脂膜中的78.7%提高到87.3%),這些現(xiàn)象表明體系中脂分子運動的異質(zhì)性大大降低, 即大部分脂分子呈現(xiàn)出較為均勻的、比原始脂膜中 Tfast組脂分子慢的運動狀態(tài).這一結(jié)果證明高濃度下多肽形成跨膜孔對磷脂分子運動擴散能力不僅起到顯著阻礙作用、也起到了均一化作用.相較之下, 低濃度蜂毒肽體系則出現(xiàn)了不同的情況.該體系中, Tfast峰位與原始膜接近(0.37—0.36)且呈現(xiàn)較寬的分布(半高寬保持在0.11), Tfast所占比例由純脂膜中的78.7%提高到87.9%.這意味著大量的脂分子(包括原始的快速運動及部分慢速運動分子)共同呈現(xiàn)出了不均一的運動行為, 證明了低濃度多肽在脂膜表面的吸附并沒有影響 Tfast組脂分子整體的運動速率.需要注意的是, 不同濃度多肽都增強了 Tslow和 Tfast組脂分子(主要為下葉和上葉脂分子)之間的耦合, 使他們呈現(xiàn)了更相似的運動狀態(tài).

圖4 蜂毒肽作用下的脂分子運動行為分析 (a), (b) 蜂毒肽影響下磷脂分子運動軌跡的Dstd頻數(shù)分布, 多肽濃度為 (a) 0.5 μg/mL,(b) 5.0 μg/mL; (c), (d) 三種實驗體系內(nèi) T fast 與 T slow 的系綜平均均方位移; (e) 三個體系中多肽與脂膜作用示意圖Fig.4.Dstd PDF analysis of the melittin-exposed lipid membrane: (a), (b) PDF of Dstd of lipids incubated with melittin at (a) 0.5 μg/mL and (b) 5.0 μg/mL; (c), (d) EA-MSD of T fast and T slow in the three systems; (e) cartoons showing melittin-membrane interactions in the three systems.

表1 不同濃度蜂毒肽影響下磷脂膜中磷脂分子運動Dstd頻數(shù)分布的擬合結(jié)果Table 1.Fittings of the Dstd PDF of lipid trajectories in membrane incubated with melittin at different concentrations.

基于上述不同體系內(nèi) Tslow和 Tfast的分組結(jié)果,分別研究了原始膜及不同多肽濃度體系中 Tslow和Tfast組分子軌跡的均方位移, 如圖4(c)和圖4(d)所示.而且, 為了方便比較這些體系內(nèi)磷脂分子的運動能力[20,21], 進一步利用擴散方程MSD=4Dta進行擬合, 得到了擴散系數(shù)D和指數(shù)α, D的大小代表了粒子擴散運動能力的強弱, 而α則體現(xiàn)了粒子的擴散方式.通常情況下α = 1對應(yīng)布朗運動, α < 1則對應(yīng)著亞擴散[22,23].

對于 Tfast部分磷脂 (擬合結(jié)果見附錄表A4),在三個體系中α皆略小于1, 即表現(xiàn)出亞擴散特征.與原始脂膜體系相比, 0.5 μg/mL濃度蜂毒肽的加入使得此部分磷脂的D值略微降低 (由3.60—3.30 μm2/s, 降低了約8.3%).這意味著低濃度多肽在膜表面的吸附會輕微地阻礙部分磷脂分子(主要是上葉磷脂分子)的擴散速率, 這與之前模擬結(jié)果中所示的、多肽吸附導(dǎo)致其下方區(qū)域脂分子擴散運動減速的現(xiàn)象相符(圖4(e), 附錄圖A5)[10]; 但當(dāng)蜂毒肽濃度增大至5.0 μg/mL, 此部分磷脂的D值會顯著降低(至2.08 μm2/s, 降低了約42.2%),表明高濃度下多肽跨膜成孔會嚴(yán)重阻礙(主要是上葉)磷脂分子的擴散.此外, Tslow部分的磷脂分子呈現(xiàn)出不同的運動變化趨勢.加入0.5 μg/mL 濃度蜂毒肽使得此部分磷脂分子運動顯著受限(D由0.56 μm2/s 降低至0.01 μm2/s).這可能是由蜂毒肽的吸附和淺插使得脂膜表面張力增大、厚度變薄、以及上下葉磷脂之間的耦合性[6]等原因?qū)е碌? 而在5.0 μg/mL濃度蜂毒肽的作用下, 此部分磷脂分子運動受限情況則會有所緩解(D由0.01 μm2/s 增加為0.24 μm2/s).這可能與跨膜孔道的形成釋放了多肽分子吸附或成孔所帶來的高表面張力有關(guān).這些結(jié)果顯示了不同濃度蜂毒肽作用下(或者蜂毒肽跨膜成孔過程的不同階段), 不同運動模式的脂分子的擴散運動行為受到的不同影響; 考慮到脂分子的運動模式主要受上下葉位置決定, 這些結(jié)果體現(xiàn)了多肽在膜表面的吸附和成孔分別對上下葉脂分子運動帶來的不同干擾.

4 結(jié) 論

脂膜分子運動的異質(zhì)性以及平板支撐雙層脂膜上下葉環(huán)境的不對稱性等因素導(dǎo)致膜中磷脂分子呈現(xiàn)出不同的運動模式, 這些運動模式的耦合會給細胞膜界面動力學(xué)過程的分析和理解帶來諸多困難, 而傳統(tǒng)的基于分子位移或回旋半徑頻數(shù)分布的分析方法并不能將這些運動模式進行有效分離.針對這一問題, 本文提出了一類基于分子位移標(biāo)準(zhǔn)差的頻數(shù)分布來區(qū)分和分離不同運動模式分子軌跡的方法, 該方法表現(xiàn)出了比傳統(tǒng)手段更高的準(zhǔn)確度和更多的定量信息.利用這一方法, 研究了單組分磷脂膜中磷脂分子的運動情況, 發(fā)現(xiàn)即使結(jié)構(gòu)最為簡單的單組分支撐膜體系也包含有快、慢兩種不同運動狀態(tài)的磷脂分子; 脂膜上葉熒光淬滅實驗表明, 運動能力強和弱的磷脂分子分別主要位于雙層膜的上葉和下葉.基于這一結(jié)果, 進而研究了在蜂毒肽影響下的磷脂分子的運動狀況, 刻畫了蜂毒肽的"兩態(tài)"作用模式分別對磷脂膜中運動較快和較慢的兩類磷脂分子的影響: 對于運動較快的磷脂分子(主要是上葉脂分子), 吸附狀態(tài)的蜂毒肽對其影響較小, 而多肽跨膜孔道的形成則會顯著抑制其運動; 對于運動較慢的磷脂分子(主要是下葉脂分子), 多肽吸附對膜結(jié)構(gòu)的擾動(例如厚度變薄、形變、表面張力增大等)會進一步限制其運動, 但蜂毒肽跨膜孔道的形成卻會減弱這種限制.然而, 不論是吸附還是跨膜成孔的多肽, 都會顯著增強上下葉脂分子之間的耦合.本文發(fā)展了一類對復(fù)雜生物膜體系中不同運動模式的分子運動軌跡進行區(qū)分和分離的數(shù)據(jù)分析方法, 并應(yīng)用該方法, 闡述了蜂毒肽-脂膜作用的不同階段, 對上下葉脂分子運動的不同影響.本方法的發(fā)展將對利用單分子追蹤技術(shù)研究生物體系動力學(xué)過程有重要幫助.

附 錄

文中通過正態(tài)隨機數(shù)生成法產(chǎn)生了不同長度的軌跡的位移(Δx, Δy):

隨后根據(jù)生成的Δx和Δy得到一條完整軌跡的實時坐標(biāo):

文中提到的數(shù)值模擬的軌跡為了接近實際實驗中的軌跡,軌跡的長度均采用了100 幀.不同擴散能力的軌跡可以通過調(diào)整位移滿足的高斯分布中的σ來調(diào)整, 兩類不同擴散能力的軌跡就是將兩類σ值不同的軌跡混合而來, 文中提到的混合軌跡體系中均含有4000條軌跡.圖A1為σ = 1的四條代表軌跡.

圖 A1 數(shù)值模擬所得的σ = 1的四條代表軌跡Fig.A1.Four typical trajectories with σ = 1 obtained from numeric simulations.

圖A2為不同步長下得到的 Rg的頻數(shù)分布, 其中黑色虛線代表的理論曲線是根據(jù) Tfast的Dstd的平均值所生成的標(biāo)準(zhǔn)布朗運動的軌跡的 Rg的頻數(shù)分布情況.將這一理論曲線與實際從磷脂分子運動軌跡中得到的結(jié)果比較, 可以發(fā)現(xiàn) Rg較低部分即為擴散模式不同的軌跡.為了驗證 Rg和Dstd分離法之間的關(guān)聯(lián), 計算了每一條軌跡的 Rg以及Dstd之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient),得到這個代表兩個量之間相關(guān)性的R = 0.7652 (皮爾森相關(guān)系數(shù)介于–1和1之間, 越接近于–1代表兩個量呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系, 越接近1代表兩個量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系).也就意味著 Rg和Dstd這兩個物理量基本成正相關(guān)關(guān)系, 那么根據(jù)這兩個物理量篩選出的軌跡也就基本重合.

圖A3給出了不同步長的Dstd的頻數(shù)分布以及根據(jù)對應(yīng)的高斯擬合所得到的閾值, 結(jié)果顯示, 三種不同步長得到的閾值均為1.10, 證明了利用Dstd的頻數(shù)分布分離軌跡的方法不取決于頻數(shù)分布的步長.

圖 A2 原始脂膜內(nèi)脂分子運動行為的回旋半徑PDF分析 (a) 不同步長下的 R g 頻數(shù)分布以及相應(yīng)的閾值; (b) 分別以 R g 和Dstd 為標(biāo)準(zhǔn)分離軌跡得到的 T slow 占比柱狀圖; (c) 純DOPC脂膜中磷脂分子運動軌跡的回旋半徑以及位移標(biāo)準(zhǔn)差之間的關(guān)系,其中黑色線為擬合曲線, 二者呈現(xiàn)正相關(guān)Fig.A2.PDF analysis of R g for the lipids in a pristine membrane: (a) PDF of R g acquried with different step values (Step = 0.1,0.2 or 0.3).Dashed lines show determination of the threshold value separating the trajectories.(b) Percentage of T slow obtained by Rg or D std analysis.(c) Relationship between R g and D std for a pure DOPC bilayer.

圖 A3 不同步長的Dstd的頻數(shù)分布以及相應(yīng)的高斯擬合 (a) 步長為0.05; (b) 步長為0.02; (c) 步長為0.04Fig.A3.PDF of Dstd by different step and corresponding Gaussian fittings: (a) step = 0.05; (b) step = 0.02; (c) step = 0.04.

如圖A4所示, 本文使用的蜂毒肽濃度主要是0.5 μg/mL以及5 μg/mL, 使用GUV動力學(xué)泄露實驗研究了不同濃度下蜂毒肽與磷脂膜的相互作用情況.結(jié)果顯示, 0.5 μg/mL的蜂毒肽并沒有對GUV產(chǎn)生明顯的擾動, 這時蜂毒肽主要吸附在磷脂膜上.蜂毒肽導(dǎo)致GUV產(chǎn)生明顯泄露的臨界濃度為2.5 μg/mL, 而當(dāng)蜂毒肽濃度上升到8 μg/mL后,GUV出現(xiàn)了大量的解離現(xiàn)象.因此5 μg/mL的蜂毒肽與脂膜的相互作用以形成跨膜孔道為主.

圖A5所示的是分子動力學(xué)模擬中在蜂毒肽分子吸附作用下脂分子的運動情況, 結(jié)合圖A5(a)和圖A5(b)可以發(fā)現(xiàn), 蜂毒肽吸附區(qū)域下方的脂分子運動受到了抑制(以紅色虛線圈標(biāo)出), 而蜂毒肽周圍區(qū)域的部分脂分子運動有所增強, 這一結(jié)果體現(xiàn)了多肽吸附導(dǎo)致的脂分子運動的異質(zhì)性.

圖 A4 不同濃度的蜂毒肽作用下的GUV泄露實驗 (a)—(c) 分別在0.5, 5.0以及8 μg/mL的蜂毒肽的作用下的GUV泄露情況, 其中綠色通道為GUV中包裹的鈣黃綠素, 紅色通道代表GUV所在的輪廓; (d) 0—10 μg/mL各濃度的蜂毒肽對GUV的擾動情況; (e)濃度3 μg/mL蜂毒肽的作用下, 典型的GUV熒光泄露曲線; (f) 低濃度蜂毒肽吸附在脂膜以及高濃度蜂毒肽形成跨膜孔道的示意圖Fig.A4.GUV leakage experiment incubated with different concentration of melittin: (a)–(c) Confocal images of GUV leakage incubated with 0.5, 5.0 and 8 μg/mL of melittin; (d) influence on GUV by different concentration of melittin; (e) typical leakage curve of GUV incubated with 3 μg/mL; (f) sketch of absorption or poration of melittin interacted with membrane.

圖 A5 分子動力學(xué)模擬中蜂毒肽影響下脂分子的擴散情況 (a) 代表性俯視截圖, 顯示蜂毒肽在脂膜表面的吸附; (b)脂分子的擴散圖譜[10]Fig.A5.Diffusion of lipids upon melittin exposure in molecular dynamics simulations: (a) Representative snapshot of melittin binding on a membrane (top view); (b) diffusion map of individual lipids[10].

擬合優(yōu)度是用于衡量擬合函數(shù)與原數(shù)據(jù)相符程度的系數(shù).計算方式如下:

其中y表示擬合前的原始數(shù)據(jù), f表示擬合所得的函數(shù), 通過上面的式子可以發(fā)現(xiàn), 當(dāng)擬合函數(shù)對原始數(shù)據(jù)描述得越好時, 擬合優(yōu)度R2就越接近1.

表 A1 正文中圖2所示高斯擬合的擬和優(yōu)度Table A1.Goodness of the Gaussian fittings in Fig.2 in the main text.

表 A2 單組分DOPC磷脂膜淬滅前后磷脂分子運動Dstd頻數(shù)分布的擬合數(shù)值Table A2.Fittings of the Dstd PDF of lipid trajectories in a SLB membrane before and after quenching.

表 A3 不同濃度蜂毒肽影響下磷脂膜中磷脂分子運動Dstd頻數(shù)分布的擬合數(shù)值Table A3.Fittings of the Dstd PDF of lipid trajectories in membrane incubated with melittin at different concentrations.

表 A4 不同濃度的蜂毒肽影響下磷脂分子運動軌跡的系綜平均均方位移的擴散方程擬合結(jié)果Table A4.Fittings of the EA-MSD of lipid trajectories in membrane incubated with melittin at different concentrations.