【摘要】目的:于酶聯(lián)免疫吸附法漏檢的HIV(人類免疫缺陷病毒)和HBV(乙型肝炎病毒)血樣篩查中應(yīng)用核酸檢測技術(shù)的效果進(jìn)行研究。方法:對(duì)2018年1月到2020年1月的4000份經(jīng)兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測后各項(xiàng)指標(biāo)均呈陰性的無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行研究,標(biāo)本經(jīng)六混樣兩種試劑做核酸檢測,對(duì)陽性標(biāo)本用兩種試劑拆分做膽管核酸檢測,總結(jié)檢測結(jié)果。結(jié)果:在4000份經(jīng)兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測后各項(xiàng)指標(biāo)均呈陰性的無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本中,經(jīng)核酸檢測技術(shù)篩查出有4份是乙型肝炎病毒陽性標(biāo)本、1份是人類免疫缺陷病毒陽性標(biāo)本。結(jié)論:血液標(biāo)本即便是經(jīng)兩次酶聯(lián)免疫吸附法檢測時(shí),仍存在漏檢人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒的風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)用核酸檢測技術(shù)可有效篩查出漏檢人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病的標(biāo)本,而進(jìn)一步確保用血質(zhì)量、安全。
【關(guān)鍵詞】輸血;人類免疫缺陷病毒;乙型肝炎病毒;酶聯(lián)免疫吸附法;核酸檢測技術(shù);應(yīng)用價(jià)值
[中圖分類號(hào)]R446.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2096-5249(2021)07-0141-02
輸血是臨床重要的一種治療方式,可及時(shí)補(bǔ)充患者血容量,挽救生命。在輸血中,要嚴(yán)格確保輸血質(zhì)量以及安全,但人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒等可經(jīng)血傳播的病毒一直是輸血安全上最受人們關(guān)注的一個(gè)問題[1]。酶聯(lián)免疫吸附法是以往血液常規(guī)篩查的一種手段,可檢測無償獻(xiàn)血者血液中的病毒抗體、病毒抗原,并以此當(dāng)做血液感染與否的指標(biāo)[2]。酶聯(lián)免疫吸附法可明顯降低通過輸血傳播人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒等風(fēng)險(xiǎn),但是由于抗體、抗原檢測是標(biāo)志物的間接檢測方法,窗口期較長,并會(huì)受病毒變異、免疫沉默性感染以及病毒滴度等因素的影響,導(dǎo)致經(jīng)輸血傳播人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒等風(fēng)險(xiǎn)仍然存在[3]。而核酸檢測技術(shù)是對(duì)病毒核酸直接進(jìn)行檢測,其檢測窗口期明顯縮短,而且在窗口期也能檢測出人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒,同時(shí)還可避免因病毒變異、免疫沉默性感染以及病毒滴度等因素造成的漏檢,彌補(bǔ)酶聯(lián)免疫吸附法的不足,進(jìn)一步的降低經(jīng)輸血傳播人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒等風(fēng)險(xiǎn)[4]。本課題主要是探究酶聯(lián)免疫吸附法漏檢的HIV和HBV血樣篩查中應(yīng)用核酸檢測技術(shù)的效果,請(qǐng)見下文。
1 資料和方法
1.1臨床資料 對(duì)2018年1月到2020年1月的4000份經(jīng)兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測后各項(xiàng)指標(biāo)均呈陰性的無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行研究,采集血液后,在核酸檢測分離膠試管中保存,4 h內(nèi)進(jìn)行離心,3000 r/min,20 min,之后在4℃的環(huán)境下進(jìn)行保存。
1.2方法 (1)試劑和儀器:低溫離心機(jī),瑞士IVD混樣儀,Cobas AmpliPrep、Cobas TaqMan,Cobsa TaqScree MPX試劑盒,Cobsa TaqScree洗液、Cobsa TaqScree MPX V2對(duì)照試劑盒,Cobsa TaqScree MPX對(duì)照試劑盒。(2)檢測方法:①酶聯(lián)免疫吸附法:標(biāo)本做兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測,加樣器自動(dòng)加樣,全自動(dòng)酶聯(lián)免疫吸附分析儀對(duì)抗乙型肝炎表面抗原、人類免疫缺陷病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體進(jìn)行兩次檢測,按《中國輸血技術(shù)操作規(guī)程》關(guān)于血站部分的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行判定當(dāng)標(biāo)本的酶聯(lián)免疫吸附法檢測是陰性,而核酸檢測是陽性時(shí),重新取樣做酶聯(lián)免疫吸附法檢測。②核酸檢測技術(shù)篩查:在生物安全柜中,打開標(biāo)本蓋,在樣本架上放置,混樣儀自動(dòng)開展六混樣處理,平行混合兩份。一份是經(jīng)全自動(dòng)血液病毒核酸檢測儀+MPX試劑盒開展核酸檢測,對(duì)人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒進(jìn)行檢測。另外一份經(jīng)另外一臺(tái)檢測儀+MPX V2試劑盒開展核酸檢測,其檢測內(nèi)容同上一份一致。當(dāng)六混樣試管陽性,就做拆分單管核酸檢測。六混樣初篩結(jié)果是兩種試劑均判定是陽性,而拆分檢測結(jié)果也是陽性,則樣本核酸檢測就是陽性。
2 結(jié)果
2.1總結(jié)窗口期酶聯(lián)免疫吸附法的兩次檢測結(jié)果 自動(dòng)加樣后(加樣器),在兩臺(tái)全自動(dòng)酶免分析儀上使用兩種不同廠家試劑進(jìn)行兩次乙型肝炎表面抗原、人類免疫缺陷病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體的酶聯(lián)免疫吸附法檢測,光密度值分別是0.002、0.047,而判定是陰性。核酸檢測發(fā)現(xiàn)該標(biāo)本是人類免疫缺陷病毒陽性,從血袋再次取標(biāo)本同時(shí)使用兩種試劑進(jìn)行檢測,光密度值分別是0.006、0.040,再次判定酶聯(lián)免疫吸附檢測結(jié)果仍呈陰性。
2.2總結(jié)漏檢人類免疫缺陷病毒標(biāo)本的核酸檢測結(jié)果Cobas TaqScreen MPX的六混樣聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增曲線上,熒光探針在第19.2個(gè)循環(huán)時(shí)就有靶標(biāo)核酸片段檢出,但內(nèi)置控沒有擴(kuò)增出來,而該批次的其他陰性樣本檢測中均擴(kuò)增出內(nèi)置控,推測該樣本的病毒載量濃度過高,使反應(yīng)被抑制。Cobas TaqScreen MPX第二代制劑的六混樣聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增曲線上,熒光探針在第21.8個(gè)循環(huán)時(shí)就有靶標(biāo)核酸片段檢出,該試劑選擇多熒光探針技術(shù),CH4是內(nèi)置控、CH1是人類免疫缺陷病毒,同內(nèi)置控多熒光探針技術(shù)相比,六混樣檢測的靈敏度較很好,且在高濃度抑制擴(kuò)增上內(nèi)置控也有改進(jìn)。
2.3總結(jié)漏檢人類免疫缺陷病毒標(biāo)本的核酸檢測拆分單檢結(jié)果 單管核酸檢測的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增曲線上,熒光探針在第16.4個(gè)循環(huán)時(shí)就有靶標(biāo)核酸片段檢出,說明濃度更高,但仍未擴(kuò)增出內(nèi)置控,從而更有理由推斷是其病毒載量濃度過高,使反應(yīng)被抑制。所以,經(jīng)陰性血漿把標(biāo)本稀釋400倍,之后再進(jìn)行核酸檢測,Cobas TaqScreen MPX試劑復(fù)孔進(jìn)行單管核酸檢測,熒光探針在第24.7個(gè)循環(huán)時(shí)就有靶標(biāo)核酸片段檢出,在第30.3個(gè)循環(huán)時(shí)內(nèi)置控在擴(kuò)增曲線開始抬頭,樣本稀釋后不在抑制內(nèi)置控?cái)U(kuò)增,但稀釋后樣本仍遠(yuǎn)提前于內(nèi)置控?cái)U(kuò)增。在第19個(gè)循環(huán)時(shí)CH1探針就有靶標(biāo)核酸片段檢出,判定樣本人類免疫缺陷病毒陽性。
2.4總結(jié)酶聯(lián)免疫吸附法漏檢乙型肝炎病毒的情況在4000份血液標(biāo)本中,核酸檢測工檢出4份乙型肝炎病毒陽性標(biāo)本,檢出率是0.10%。
3 討論
在本課題的4000份經(jīng)兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測后各項(xiàng)指標(biāo)均呈陰性的無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本中,經(jīng)核酸檢測技術(shù)篩查出有4份是乙型肝炎病毒陽性標(biāo)本、1份是人類免疫缺陷病毒陽性標(biāo)本。從而得知:即便是經(jīng)過兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測,無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本仍存在人類免疫缺陷病毒感染、乙型肝炎病毒感染的情況,影響用血安全[5]。對(duì)于核酸技術(shù)來說,盡管可篩查出酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)于人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒的漏檢標(biāo)本,但是不能徹底的消除乙型肝炎病毒窗口期,不過能夠把經(jīng)輸血傳播乙型肝炎病毒的風(fēng)險(xiǎn)降到最低[6]。
目前在全世界范圍內(nèi),抗體檢測相關(guān)試劑已發(fā)展到第四代,對(duì)于前三代試劑來說,主要是對(duì)兩種抗體進(jìn)行檢測,而第四代試劑能夠同時(shí)檢測免疫球蛋白M抗體、免疫球蛋白G抗體、P24抗原,同時(shí)把窗口期縮短到三周[7]。在本課題中,是對(duì)血液標(biāo)本使用兩種不同廠家的第四代試劑進(jìn)行兩次檢測,經(jīng)核酸檢測技術(shù)對(duì)兩次酶聯(lián)免疫吸附法檢測均呈陰性的樣本再次進(jìn)行篩查,結(jié)果表示篩查出了人類免疫缺陷病毒陽性、乙型肝炎病毒陽性的標(biāo)本。說明:在臨床用血的酶聯(lián)免疫吸附法檢測中,仍存在一定安全隱患,需開展核酸檢測來確保臨床用血安全[8]。
在感染者血液標(biāo)本中,最早被檢測出來的是病毒核酸,且呈一過性的高水平,之后水平有所下降。于本課題中,在第19個(gè)循環(huán)時(shí)CH1探針就有靶標(biāo)核酸片段檢出,明顯提前于在第30.3個(gè)循環(huán)時(shí)內(nèi)置控在擴(kuò)增曲線開始抬頭,所以推斷同內(nèi)置控病毒載量水平相比,其水平是相當(dāng)高的,但經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法并未檢測出免疫球蛋白M抗體、免疫球蛋白G抗體、P24抗原等,說明該樣本很可能是處于最早期感染階段,病毒核酸一過性高水平,剛好P24抗原水平下降但抗體未升高或者P24抗原未出現(xiàn)而導(dǎo)致漏檢[9]。同第四代酶聯(lián)免疫吸附法試劑比較來說,核酸檢測技術(shù)把窗口期縮短了五天,證實(shí)縮短窗口期可確保輸血安全[10]。
總之,血液標(biāo)本即便是經(jīng)兩次酶聯(lián)免疫吸附法檢測時(shí),仍存在漏檢人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒的風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)用核酸檢測技術(shù)可有效篩查出漏檢人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病的標(biāo)本,而進(jìn)一步確保用血質(zhì)量、安全。
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作者簡介:崔永利(1977.01-), 男, 漢族,山東淄博人,淄博市中心血站,主管技師。E_mail:CYL0533@126.com