勞少杏 榮成智

摘要： 目的 驗(yàn)證和評(píng)價(jià)LiCA500光激化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)在HBsAg、Anti-HIV、Anti-HCV、Anti-TP檢測(cè)中的性能，并評(píng)估其使用價(jià)值。方法 通過設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)LiCA500光激化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行精密度、線性范圍、檢出限/分析靈敏度及符合率等進(jìn)行評(píng)價(jià);并與安圖A2000plus、雅培ARCHITECT-i2000SR進(jìn)行符合度比較。結(jié)果 HBsAg、Anti-HIV、Anti-HCV、Anti-TP等的精密度、檢測(cè)限、分析靈敏度均符合相關(guān)文件標(biāo)準(zhǔn)和廠家要求;定量項(xiàng)目HBsAg的回歸方程為y = 1.0064x - 9.9246（r2=0.9955;a=1.0064）;且LiCA500和安圖、雅培的比較有較好的一致性，符合率>95%。結(jié)論 LiCA500初步評(píng)價(jià)各項(xiàng)性能良好，同時(shí)其分析樣本需求少，攜帶污染低，適用于本實(shí)驗(yàn)室日常標(biāo)本檢測(cè)。

關(guān)鍵詞： 光激化學(xué)發(fā)光;傳染病四項(xiàng);性能評(píng)價(jià);方法學(xué)比對(duì)

【中圖分類號(hào)】R51 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2107-2306（2021）06-025-02

傳染四項(xiàng)病篩查檢驗(yàn)技術(shù)從ELISA發(fā)展到現(xiàn)在各類化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，檢測(cè)的靈敏度和特異度均得到了很大的提升?？泼涝\斷LiCA500免疫分析儀是基于光激化學(xué)發(fā)光（Light Initiated Chemilnescent Assay， LiCA）免疫分析技術(shù)的全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)，可定量或定性檢測(cè)血清、血漿中各類抗原或者抗體的成分。該技術(shù)來源于LOCI（Luminescent oxygen changneling immunoassay ）技術(shù)，LOCI最初由Ullman等[1]在1994年報(bào)道，后由西門子生產(chǎn)出了免疫診斷試劑，國產(chǎn)光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)系統(tǒng)，是由上海博陽公司建立，也是LiCA500全自動(dòng)免疫分析儀使用的配套試劑。為了評(píng)估該設(shè)備是否符合實(shí)驗(yàn)室的使用要求，需要在儀器的投入使用之前對(duì)該儀器進(jìn)行必要的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源：收集本院門診和住院患者血清，包括陽性和陰性標(biāo)本，陽性數(shù)值覆蓋有低值與高值。

1.2 儀器與試劑：

1.2.1 儀器：科美LiCA500全自動(dòng)光激化學(xué)發(fā)光免疫分析儀;安圖A2000plus全自動(dòng)磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析儀;雅培ARCHITECT-i2000SR化學(xué)發(fā)光免疫分析儀

1.2.2 試劑及標(biāo)準(zhǔn)品：

LiCA500使用博陽生物科技（上海）有限公司生產(chǎn)試劑及配套校準(zhǔn)品和質(zhì)控品：HbsAg，批號(hào)1901;Anti-HIV，批號(hào)1902;Anti-HCV，批號(hào)1902 ; Anti-TP，批號(hào)1903。A2000plus 使用安圖生物配套試劑：HbsAg，批號(hào)20190617;Anti-HIV ，批號(hào)20190702;Anti-HCV，批號(hào)20190516; Anti-TP，批號(hào)20190507。

ARCHITECT-i2000SR 使用雅培配套試劑：HbsAg，批號(hào)04383FN00;Anti-HIV，批號(hào)05527BE01;Anti-HCV，批號(hào)04539BE01;Anti- TP，批號(hào)05031BE01。北京康徹思坦生物有限公司校準(zhǔn)物：Anti-HIV（2NCU/ml）批號(hào)201808003;Anti-HCV（0.5NCU/ml） 批號(hào)201902001;Anti- TP（0.5NCU/ml）批號(hào)201901001。

1.3 評(píng)價(jià)方法及標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 精密度評(píng)價(jià) 參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化（CLSI）EP12-A[2]及EP15-A2[3]文件。按試劑說明書操作，檢測(cè)博陽生物試劑配套高、低兩個(gè)濃度水平的質(zhì)控品，收集20次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和CV值。

1.3.2 檢出限評(píng)價(jià) 參考WS/T 494-2017《臨床定性免疫檢驗(yàn)重要常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量要求》[4]文件，將康徹思坦生物有限公司校準(zhǔn)物Anti-HIV（2NCU/ml），Anti-HCV（0.5NCU/ml），Anti- TP（0.5NCU/ml）梯度稀釋至廠商聲明的檢出限濃度（Anti-HIV 1 NCU/ml、Anti-HCV 0.16 NCU/ml和Anti- TP 0.25 NCU/ml），配置5份樣本，重復(fù)檢測(cè)，每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目收集20份數(shù)據(jù)。

1.3.3 分析靈敏度評(píng)價(jià) 參考CLSI的EP17-A[5]文件。對(duì)博陽公司“零濃度”水平的校準(zhǔn)品，在1次運(yùn)行中重復(fù)測(cè)定10次， 計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的光信號(hào)均值（X）和SD。分析靈敏度采用空白光信號(hào)X±2SD對(duì)應(yīng)的濃度值。

1.3.4 線性范圍評(píng)價(jià) 參考CLSI 的EP6-A[6]文件，選擇HbsAg對(duì)應(yīng)的低濃度（L）和高濃度 （H） 標(biāo)準(zhǔn)品各一支，按要求稀釋成5個(gè)濃度水平，每份樣本平均檢測(cè)4次，計(jì)算均值。以x為預(yù)期值，y為檢測(cè)均值做線性回歸，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r2）和斜率（a）。

1.3.5 不同方法學(xué)比較 參考CLSI的EP9-A2[7]文件。分別檢測(cè)已知陰陽性的標(biāo)本（陽性22例和陰性20例），其中陽性標(biāo)本濃度涵蓋弱陽性至高值陽性值。樣本隨機(jī)分成4組，分上下午檢測(cè)，共兩天完成。根據(jù)結(jié)果計(jì)算靈敏度、特異度、符合率等指標(biāo)。

1.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析 檢測(cè)數(shù)據(jù)使用Excel2019軟件處理;儀器符合度分析使用軟件SPSS25.0進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa≥0.75，代表兩比較者有較好的一致性。

2 結(jié)果

2.1 精密度評(píng)價(jià) LiCA500檢測(cè)HBsAg、Anti-HIV、Anti-HCV、Anti-TP精密度如表1所示。

2.2 檢出限評(píng)價(jià) 檢測(cè)稀釋后的康徹思坦生物有限公司校準(zhǔn)物Anti-HIV，Anti-HCV和Anti-TP的結(jié)果均值分別為2.87S/CO、4.60S/CO和1.92S/CO，且所有樣本均檢測(cè)出陽性，見表2。

2.3 分析靈敏度評(píng)價(jià) 定量檢測(cè)項(xiàng)目HBsAg檢測(cè)結(jié)果的光信號(hào)X=313和SD=17.11;X+2SD=347.22，其對(duì)應(yīng)的濃度為0.04ng/ml。因此HBsAg分析靈敏度為0.04ng/ml。

2.4 線性范圍評(píng)價(jià) HBsAg線性檢測(cè)數(shù)值見表3，經(jīng)計(jì)算，相關(guān)系數(shù)r2=0.9955;斜率a=1.0064，在0.95-1.05之間。檢測(cè)回歸方程為y = 1.0064x - 9.9246。

2.5 不同檢測(cè)方法符合度分析 三臺(tái)儀器分別檢測(cè)HBsAg、Anti-HIV、Anti-HCV和Anti-TP的結(jié)果見表4。在HbsAg分析中，LiCA500、ARCHITECT-i2000SR和A2000plus的靈敏度和特異度均為100%;在Anti-HIV分析中，三臺(tái)儀器的靈敏度均為100%，特異度 LiCA500和A2000PLUS為95%，ARCHITECT-i2000SR為100%;在Anti-HCV分析中，LiCA500和ARCHITECT-i2000SR的靈敏度和特異度為100%，而A2000plus的靈敏度為95.46%，特異度為95.00%;在Anti-TP分析中，三臺(tái)儀器的靈敏度和特異度均為100%。LiCA500和ARCHITECT-i2000SR檢測(cè)HbsAg的總符合率為100%，K=1;檢測(cè)Anti-HIV的總符合率為97.62%，K=0.952;檢測(cè)Anti-HCV的總符合率為100%，K=1;檢測(cè)Anti-TP的總符合率為100%，K=1。LiCA500和A2000plus檢測(cè)HbsAg的總符合率為100%，K=1;檢測(cè)Anti-HIV的總符合率為100%，K=1;檢測(cè)Anti-HCV的總符合率為95.24%，K=0.905;檢測(cè)Anti-TP的總符合率為100%，K=1。

3 討論

傳染病原體乙型肝炎（HBV）病毒、艾滋（HIV）病毒、丙型肝炎（HCV）病毒、梅毒（TP）螺旋體的傳播是威脅人們健康的公共衛(wèi)生難題。大量資料表明上述疾病均可通過胎盤進(jìn)行垂直傳播，常規(guī)開展孕產(chǎn)婦傳染病檢測(cè)是做好孕產(chǎn)婦保健及早期胎兒疾病預(yù)防的必要前提[8]。在不同地區(qū)不同人群，HBV、HIV、HCV和TP的感染風(fēng)險(xiǎn)和陽性率是不一樣的，其中孕產(chǎn)婦的HBV感染率可達(dá)9.83%，而由母嬰傳播的乙肝可高達(dá)30%～50%[9，10]。檢驗(yàn)環(huán)節(jié)是孕產(chǎn)婦篩查及應(yīng)對(duì)治療措施的關(guān)鍵點(diǎn)，因此，要求HBV、HIV、HCV和TP的檢測(cè)方法學(xué)具有高靈敏度及高特異度，以滿足臨床檢測(cè)的需求。

在對(duì)LiCA500精密度評(píng)價(jià)中可知HBsAg、Anti-HIV、Anti-HCV和Anti-TP的總CV值均小于廠家規(guī)定的變異系數(shù)CV≤15%的要求，而且本次的CV5%，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定。在徐少華等[11]，榮楊等[12] 對(duì)LiCA免疫技術(shù)檢測(cè)HbsAg、AFP和CEA的精密度評(píng)價(jià)中，其結(jié)果與本次結(jié)論相同，可見LiCA免疫技術(shù)精密度是符合臨床樣本檢測(cè)要求。

根據(jù)儀器項(xiàng)目檢測(cè)方式的不同，HbsAg為定量分析，Anti-HIV、Anti-HCV和Anti-TP為定性分析，因此本次HBsAg進(jìn)行分析靈敏度分析，Anti-HIV、Anti-HCV、Anti-TP進(jìn)行檢測(cè)限分析。結(jié)果可知HBsAg分析靈敏度為0.04 ng/ml，檢測(cè)結(jié)果與張陽根等[13]結(jié)果一致，均符合廠家規(guī)定的≤0.05ng/ml要求。在檢測(cè)限分析中，博陽生物科技有限公司規(guī)定其Anti-HIV、Anti-HCV、Anti-TP的檢測(cè)限分析分別為≤ 1NCU/ml，≤ 0.2NCU/m l和≤ 0.5NCU/ml，本次檢測(cè)在規(guī)定的要求下均能有陽性反應(yīng)。

在儀器的線性分析上，本次檢測(cè)的線性范圍r2=0.9955;斜率a=1.0064，a在0.95-1.05之間，儀器線性良好，能有效的確保了檢測(cè)范圍內(nèi)結(jié)果的準(zhǔn)確性。初步評(píng)價(jià)，檢測(cè)結(jié)果均符合廠家的要求，檢測(cè)結(jié)果總體滿意，與同類檢測(cè)系統(tǒng)有相近的檢測(cè)水平[14]。

在LiCA500符合度分析上，本次用LiCA500、雅培ARCHITECT-i2000SR和安圖A2000plus共同檢測(cè)42例標(biāo)本，三臺(tái)儀器在HBsAg、Anti-HIV、Anti-HCV和Anti-TP符合率分析中均有較好的一致性，Kappa>0.75。

但是在Anti-HIV檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)LiCA500和A2000plus均出現(xiàn)了1例假陽性，且兩者的S/CO均小于5，考慮為三臺(tái)儀器間不同方法學(xué)差異造成。首先從原理上來看，雅培ARCHITECT-i2000SR和安圖A2000plus均采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)，但是在免疫標(biāo)記物上又有區(qū)分，雅培ARCHITECT-i2000SR為直接化學(xué)發(fā)光，A2000plus為酶促化學(xué)發(fā)光;而LiCA500的光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)是通過將兩種微粒表面包被的抗原或抗體，在液相中形成免疫復(fù)合物而將兩種微粒拉近，在激光的激發(fā)下，使微粒之間的離子氧轉(zhuǎn)移，進(jìn)而產(chǎn)生高能級(jí)的紅光，通過單光子計(jì)數(shù)器和數(shù)學(xué)擬合將光子數(shù)換算為靶分子濃度。其次根據(jù)相關(guān)研究對(duì)HIV化學(xué)發(fā)光檢測(cè)結(jié)果的S/CO陽性率驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，S/CO>15才是HIV診斷的最佳臨界點(diǎn)，而S/CO值越小假陽性率也會(huì)越高[15]。所以三臺(tái)檢測(cè)敏感性存在差異是可以接受的。就本次比對(duì)而言LiCA500相對(duì)雅培ARCHITECT-i2000SR的檢測(cè)靈敏度高，假陽性率也相對(duì)增大，但作為日常臨床標(biāo)本初篩是適用的，能減少可疑標(biāo)本的漏檢。

LiCA500與科室在用的安圖A2000plu比較，存在以下優(yōu)勢(shì)：其一，LiCA500單個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目需要樣本量少（LiCA500最多為25ul，A2000plus最多為165ul），更加適用于標(biāo)本較少的新生兒標(biāo)本檢測(cè)，從臨床角度來看則能減少患者的抽血量，減輕患者痛苦。其二，由于儀器檢測(cè)使用一次性TIP槍頭，全程無清洗，也無磁珠微粒反應(yīng)性步驟，并且具有避免HOOK效應(yīng)的專利，因此攜帶污染的因素相對(duì)較少，儀器使用及保養(yǎng)也相對(duì)簡(jiǎn)單。畢竟，婦幼醫(yī)院檢測(cè)標(biāo)本以新生兒和孕產(chǎn)婦的為主，兩者血清中容易存在干擾性物質(zhì)，如高水平膽紅素、高甘油三酯等，檢測(cè)過程中減少干擾是科室比較看重的。

綜上所述，雖然有研究[16-17]表示LiCA免疫分析技術(shù)在某一些項(xiàng)目的檢測(cè)上優(yōu)于目前市面上使用的酶聯(lián)免疫技術(shù)、電化學(xué)發(fā)光技術(shù)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)，具有極為廣闊的臨床、科研應(yīng)用前景。但是每種分析技術(shù)的使用，又受到了試劑和檢測(cè)儀器研發(fā)的限制，每個(gè)方法都有其獨(dú)特的方面。目前在臨床標(biāo)本的檢測(cè)上，推薦多種方法學(xué)的聯(lián)合檢測(cè)，才能有效的彌補(bǔ)各方法學(xué)、各儀器間的不足，以提高項(xiàng)目檢測(cè)的靈敏度和特異度[18]。本研究對(duì)LiCA500初步評(píng)價(jià)，光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有高通量，操作簡(jiǎn)單，背景干擾少，樣本消耗少，靈敏度和特異度高等特點(diǎn)，各項(xiàng)結(jié)果均符合產(chǎn)家的要求，同時(shí)與目前在用的國內(nèi)外儀器比對(duì)，總體符合率良好，可以用于臨床標(biāo)本檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Ullman E F， Kirakossian H， Singh S， et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay： measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 1994， 91（12）：5426-30.

[2] CLSI. User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline：EP12-A [S]. Wayne， Pennsylvania CLSI， 2002.

[3] CLSI. User demonstration of performance for precision and accuacy approved guideline-sacond edition：EP15-A2 [S]. Wayne， PA： CLSI， 2004.

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).臨床定性免疫檢驗(yàn)重要常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量要求[C].中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，WS/T 494-2017.

[5]CLSI. Protocols for determination of limits of detection and limits of quantitation; approved guideline-second edition [S]. EP17-A， CLSI， 2004.

[6]CLSL.Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures; a statistical approach; approved guideline[S]. EP6-A， CLSI， 2004.

[7]CLSI. Method comparison and bias estimation using patient samples， approved guideline-sacond edition：EP9-A2 [S]. Wayne， PA，USA： CLSI， 2010.

[8]李慶. 孕婦產(chǎn)前四項(xiàng)傳染病指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的分析[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志（電子版）， 2014， 8（02）：98-100.

[9]祁慧， 徐志明. 5477例孕產(chǎn)婦四種血源性傳染病檢測(cè)結(jié)果分析[J]. 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床， 2018， 29（6）：43-45.

[10] 覃清華， 謝小花， 張華， 等. 2011-2016年廣西孕產(chǎn)婦艾滋病、梅毒和乙肝血清學(xué)監(jiān)測(cè)分析 [J].中國健康教育， 2018， 34（1）：10-13.

[11] 涂少華， 朱敏， 沈江帆. 光激化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙型肝炎病毒感染血清學(xué)標(biāo)志的性能評(píng)價(jià)[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)， 2011， 26（07）：452-456.

[12] 榮揚(yáng)， 趙強(qiáng)元， 劉敏， 等. 光激化學(xué)發(fā)光法定量測(cè)定AFP和CEA的性能評(píng)價(jià)[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)， 2013， 28（02）：146-149.

[13] 張陽根， 胡桂華， 黃林江. Lica光激化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測(cè)乙肝兩對(duì)半的性能評(píng)價(jià)[C]. 第五次全國免疫診斷暨疫苗學(xué)術(shù)研討會(huì)， 2011：4.

[14] 劉立民， 李鈺， 蒙雨明， 等. 化學(xué)發(fā)光微粒免疫分析技術(shù)檢測(cè)輸血四項(xiàng)的性能評(píng)估[J]. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2015， （2）：107-110.

[15] 羅娜， 張勁豐， 蘇榮， 等. 雅培化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)HIV的S/CO比值與確證試驗(yàn)的相關(guān)性分析 [J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2017， 27（19）：2794-2796.

[16] 賀安. 癌胚抗原和神經(jīng)元特異性烯醇化酶光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑的研制[D]. 南方醫(yī)科大學(xué)， 2011.

[17] 顏露， 趙曉航， 許楊. 均相光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)， 2016， 28（09）：1083-1088.

[18] 鄧飛， 韓惠云， 來祝檁. 不同ELISA試劑檢測(cè)傳染病四項(xiàng)弱反應(yīng)性結(jié)果的比較[J]. 中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)， 2018， 15（24）：162-163.