狄和雙，王利剛，韓大勇，蔣珊珊，孫慶蘅

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

近年來犬業(yè)經(jīng)濟(jì)蓬勃發(fā)展，但母犬配種后未受孕時(shí)假孕發(fā)生率達(dá)50%～70%，假孕易誘發(fā)母犬子宮疾患、不孕甚至死亡.犬假孕的原因主要是母犬發(fā)情排卵后未孕的情況下卵巢上黃體期的時(shí)間與真孕母犬黃體期時(shí)間相似甚至更久，導(dǎo)致犬配種后無論懷孕與否體內(nèi)的孕酮水平相似，因此正常未孕母犬黃體期又被稱為生理學(xué)或隱性假孕[1]，母犬表現(xiàn)出與真孕母犬相似的懷孕征兆，增加了母犬早期妊娠診斷的難度，而B型超聲波等診斷妊娠方法在犬場難以普及應(yīng)用，因此，我們提出胚胎著床期可能是探尋早期鑒別犬真孕與假孕差異指標(biāo)的關(guān)鍵時(shí)期.

研究已證實(shí)瘦素不僅與動(dòng)物的體脂能量調(diào)節(jié)關(guān)系密切，瘦素及其受體對人及嚙齒動(dòng)物的青春期啟動(dòng)、性腺發(fā)育、胚胎著床及病理妊娠等繁殖活動(dòng)發(fā)揮重要的作用[2-4]，一定濃度的瘦素是小鼠正常妊娠時(shí)胚胎著床所必須的，但瘦素及其受體對于犬的胚胎著床的作用研究鮮見報(bào)道.我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在母犬的胚胎著床期(配種后19～23 d)真孕母犬的外周血中瘦素水平極顯著高于假孕母犬外周血清中的瘦素水平[5]，推測瘦素可能參與了母犬的胚胎著床，瘦素可能是判別母犬真孕和假孕的激素指標(biāo).但真孕母犬外周血中高濃度瘦素水平的來源未知，為了對前期結(jié)論進(jìn)行更深入的研究，本研究通過RT-PCR和免疫組織化學(xué)的方法觀察胚胎著床期瘦素及其受體在真孕和假孕母犬下丘腦-垂體-性腺軸各組織中的表達(dá)差異，為驗(yàn)證瘦素是否參與了母犬胚胎著床以及瘦素是否可以作為判別母犬真假孕的關(guān)鍵因子探尋證據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及處理

在江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)犬舍選擇飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致的中華田園犬，年齡(3～5歲)、體質(zhì)量相近自然發(fā)情的健康母犬，選取用種公犬配種后20 d經(jīng)B型超聲波診斷妊娠的3只母犬，另外用輸精管結(jié)扎的公犬進(jìn)行自然配種后20 d的3只母犬作為假孕母犬模型(借鑒小鼠假孕模型的研究[6])，參照李成的方法[7]，取各器官組織樣品保存?zhèn)溆茫驹囼?yàn)通過了我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審核(另：試驗(yàn)犬采樣后的尸體用做解剖標(biāo)本的制作).

1.2 主要試劑

Trizol Reagent、cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR Mix購自HaiGene公司；兔抗犬瘦素多克隆抗體、兔抗犬瘦素受體的多克隆抗體及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司；SP免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物公司；瓊脂糖、氯仿、異丙醇、TAE緩沖液、無水乙醇等常規(guī)藥品均購自國藥集團(tuán)；引物由Genscript公司合成.

1.3 RNA提取及RT-PCR

按常規(guī)方法提取各組織的RNA，溶解后-70 ℃保存.將檢測完整的RNA反轉(zhuǎn)錄至cDNA，按以下組分配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液:Total RNA 1 μg，5×RT MasterMix 4 μL，Oligo (dT)15 Primer 1 μL，Rnase Free H2O Up to 20 μL.在PCR儀上按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：30 ℃5 min， 55 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃.針對犬Leptin基因(Genbank No.:NM_001003070)設(shè)計(jì)1對引物，犬Leptin-F:5′-ATACTCTAGGTGGTGGATCTGTTC-3′，犬Leptin-R:5′-TGTCTGCCGTTATGGTCTTAGG -3′，擴(kuò)增片段為440 bp；針對犬leptin的受體基因(GenBank No.:AY823396)設(shè)計(jì)1對引物，犬 LeptinR-F:5′-GGTTTCACCAAAGATGCTATCG-3′，犬 LeptinR-R:5′-TGTGCCCAGGAACAATTCTTG-3′， 擴(kuò)增片段為176 bp；針對犬甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因(Genbank No.:NM_001003142.1)設(shè)計(jì)1對引物， 犬GAPDH F:5′-GTGAAGGTCGGAGTCAACGG -3′，犬GAPDH R:5′-TCAGCAGAAGGAGCAGAGATG-3′ ，擴(kuò)增片段為371 bp.以上引物均由Genscript公司合成.PCR反應(yīng)總體積為50 μL，擴(kuò)增循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán).取反應(yīng)產(chǎn)物用1.5% TAE瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)(UVP，UVP -200)拍照并用軟件分析條帶灰度，分別以瘦素和瘦素受體基因?qū)APDH的相對灰度比值作為瘦素及其受體的相對表達(dá)量.

1.4 瘦素及其受體的表達(dá)

取真孕和假孕母犬的各組織固定并制備石蠟切片，按狄和雙的方法[8]進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，一抗為兔抗犬瘦素多克隆抗體(1∶500)或兔抗犬瘦素受體的多克隆抗體(1∶500)，37 ℃孵育1 h，陰性對照以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替一抗，二抗為羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min，辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素37 ℃孵育20 min，DAB染色，蘇木精輕度復(fù)染、脫水、透明，封片.顯微鏡下觀察，細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)見棕黃色顆粒沉著為陽性細(xì)胞.根據(jù)Kraan等[9]的方法，測量平均光密度值.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理

2 結(jié)果與分析

2.1 瘦素及其受體的RT-PCR產(chǎn)物定性及半定量分析

真孕母犬與假孕母犬的下丘腦、垂體、卵巢和子宮組織中均有瘦素mRNA的表達(dá)，輸卵管中未檢測出瘦素mRNA的表達(dá).真孕和假孕母犬的下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管組織中均檢測到瘦素受體mRNA的表達(dá)，擴(kuò)增的瘦素、瘦素受體及GAPDH的RT-PCR產(chǎn)物與理論長度相符合(圖1).通過mRNA灰度分析并比較得出，真孕組母犬下丘腦、卵巢和子宮中瘦素的mRNA表達(dá)水平都顯著高于假孕組母犬下丘腦、卵巢和子宮中的瘦素水平(P<0.05)，真孕和假孕母犬垂體中瘦素水平差異不顯著(P>0.05).真孕母犬下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管組織中的瘦素受體的mRNA表達(dá)水平均顯著高于假孕母犬對應(yīng)各組織中的瘦素水平(P<0.05，表1).

2.2 瘦素及其受體在真孕和假孕母犬下丘腦-垂體-性腺軸各組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示(圖2～3)，瘦素在真孕和假孕母犬的下丘腦、垂體、卵巢、子宮中均有表達(dá)，在輸卵管中未檢測到表達(dá)，瘦素受體在真假孕母犬的下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管組織中均有表達(dá).其中，瘦素在真孕母犬卵巢的卵泡及卵巢間質(zhì)細(xì)胞呈陽性表達(dá)，在假孕母犬卵巢陽性表達(dá)主要集中在間質(zhì)細(xì)胞；瘦素受體在真假孕母犬卵泡及間質(zhì)細(xì)胞均呈陽性表達(dá)，瘦素受體主要在真假孕母犬的輸卵管皺襞表達(dá)陽性；瘦素及瘦素受體在真孕母犬子宮內(nèi)膜、子宮腺中均呈陽性表達(dá)，而在假孕母犬子宮腺中表達(dá)陰性.

1～10分別代表：真孕母犬下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管、假孕母犬下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管.內(nèi)參采用GAPDH (371 bp)，Marker：DL2000 (100、250、500、750、1 000、2 000).Lane 1～5 represents hypothalamuses,pituitaries,ovaries,uteruses and fallopian tubes of pregnant bitches respectively,and lane 6～10 represents hypothalamuses,pituitaries,ovaries,uteruses and fallopian tubes of pseudo-pregnant bitches respectively.GAPDH was used as a control,whose length was 371 bp.DL2000 was used as DNA Marker.圖1 瘦素(440 bp)和瘦素受體 (176 bp)及內(nèi)參對照GAPDH(371 bp)在真孕和假孕母犬下丘腦-垂體-性腺軸各組織中的表達(dá)情況Figure 1 The expression of leptin and its receptor in various tissues of the hypothalamus-pituitary-gonad axis

表1 真孕組和假孕組母犬的各組織器官中瘦素及其受體mRNA的表達(dá)水平比較

A：真孕組下丘腦；B:假孕組下丘腦；C：真孕組垂體；D：假孕組垂體；E:真孕組卵巢；F:假孕組卵巢；G：真孕組輸卵管；H：假孕組輸卵管；I：真孕組子宮；J：假孕組子宮.A,C,E,G and I represent the tissues of pregnant bitches while B,D,F,H and J represent the tissues of pseudo-pregnant bitches.The images were magnified as 40×.A & B:hypothalamuses,C & D:pituitaries,E & F:ovaries,G & H:fallopian tubes,I & J：uteruses.圖2 瘦素在真孕和假孕母犬下丘腦-垂體-性腺軸各組織中的表達(dá)(40×)Figure 2 The expression of leptin in various tissues of the hypothalamus-pituitary-gonad axis(40×)

A：真孕組下丘腦；B：假孕組下丘腦；C：真孕組垂體；D：假孕組垂體；E：真孕組卵巢；F：假孕組卵巢；G：真孕組輸卵管；H：假孕組輸卵管；I：真孕組子宮；J：假孕組子宮.A,C,E,G and I represent the tissues of pregnant bitches while B,D,F,H and J represent the tissues of pseudo-pregnant bitches.The images were magnified as 40×.A & B:hypothalamuses,C & D:pituitaries,E & F:ovaries,G & H:fallopian tubes,I & J:uteruses.圖3 瘦素受體在真孕和假孕母犬下丘腦-垂體-性腺軸各組織中的表達(dá)(40×)Figure 3 The expression of leptin receptor in various tissues of the hypothalamus-pituitary-gonad axis

真孕母犬下丘腦、卵巢和子宮中的瘦素及其受體的表達(dá)量均顯著高于假孕母犬(P<0.05)，真孕母犬垂體和輸卵管中瘦素受體的表達(dá)量顯著高于假孕母犬(P<0.05).真孕母犬垂體中的瘦素表達(dá)水平與假孕母犬差異不顯著(P>0.05，表2)

表2 瘦素及其受體在真孕和假孕母犬下丘腦-垂體-性腺軸各組織中的表達(dá)比較

3 討論

瘦素已被證實(shí)是小鼠、牛等動(dòng)物體內(nèi)胚胎著床的關(guān)鍵因子[10-12]，在妊娠小鼠及孕婦外周血中瘦素水平顯著高于妊娠前和分娩后，且瘦素水平在孕婦體內(nèi)下降有可能是妊娠即將終止的信號，測定孕婦血清中瘦素水平可以預(yù)測流產(chǎn)[13-14].對中國美利奴新疆軍墾型細(xì)毛羊(單胎品種)和江蘇湖羊(多胎品種)妊娠1～43 d外周血中的瘦素水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示江蘇湖羊外周血中瘦素水平極顯著高于中國美利奴新疆軍墾型細(xì)毛羊，2種妊娠母羊的瘦素水平均高于空懷母羊，說明瘦素水平的含量不同直接影響綿羊是否懷孕以及懷單胎還是雙胎[15].與我們前期研究結(jié)果相似近期有學(xué)者也發(fā)現(xiàn)妊娠母犬從排卵到分娩外周血中瘦素水平的濃度均高于未妊娠的母犬[16]，多種動(dòng)物妊娠與非妊娠期瘦素水平的對比結(jié)果顯示瘦素對于母犬的妊娠具有一定的調(diào)節(jié)作用.

大多數(shù)的哺乳動(dòng)物妊娠前期由卵巢上的黃體分泌孕酮維持妊娠，黃體退化后胎盤分泌孕酮繼續(xù)維持妊娠，但目前尚無證據(jù)支持犬的胎盤能分泌孕酮，而且在母犬懷孕的任何階段切除卵巢或黃體都會(huì)導(dǎo)致母犬流產(chǎn)[17].因此，犬的妊娠調(diào)控是由下丘腦-垂體-卵巢軸分泌激素相互作用的結(jié)果.在靈長類動(dòng)物及小鼠下丘腦和垂體均發(fā)現(xiàn)了瘦素受體，瘦素通過直接或間接作用于下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)神經(jīng)元或GnRH神經(jīng)元主要調(diào)節(jié)因子kisspeptin (Kiss1)促進(jìn)動(dòng)物初情期啟動(dòng)及生殖系統(tǒng)的發(fā)育[18]，瘦素缺乏會(huì)導(dǎo)致下丘腦-垂體-性腺軸功能異常[19-20].在小鼠垂體離體培養(yǎng)試驗(yàn)中[21]發(fā)現(xiàn)外源瘦素可以促進(jìn)垂體促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)的釋放且呈劑量依賴性，當(dāng)FSH和LH達(dá)峰值后再提高瘦素濃度FSH和LH又下降，類似于垂體的負(fù)反饋?zhàn)饔茫酝茰y瘦素可以直接調(diào)控垂體功能也可能是先作用于下丘腦再促進(jìn)垂體分泌促性腺激素.本研究發(fā)現(xiàn)在真孕母犬下丘腦和垂體均有瘦素及其受體的表達(dá)，且真孕組瘦素及其受體在下丘腦中表達(dá)顯著高于假孕母犬，瘦素受體在垂體的表達(dá)顯著高于假孕母犬，說明瘦素及其受體在犬胚胎著床期可能也是通過直接或間接作用介導(dǎo)了下丘腦-垂體-卵巢軸對于胚胎著床的調(diào)控.

給肥胖的雌鼠外源注射瘦素可明顯增加卵巢重量及發(fā)育卵泡數(shù)量，而離體卵泡顆粒細(xì)胞與卵泡膜細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)瘦素可以抑制顆粒細(xì)胞分化和卵細(xì)胞的成熟，說明不同的生理環(huán)境下瘦素對于卵巢具有不同的調(diào)節(jié)機(jī)制[22-23].本研究中瘦素在真孕母犬卵巢的卵泡及卵巢間質(zhì)細(xì)胞呈陽性表達(dá)，在假孕母犬卵巢陽性表達(dá)主要集中在間質(zhì)細(xì)胞，瘦素受體在真假孕母犬卵泡及間質(zhì)細(xì)胞均呈陽性表達(dá)，說明瘦素可以直接作用于卵巢調(diào)控卵泡與間質(zhì)細(xì)胞的功能.真孕組瘦素及受體在卵巢上表達(dá)量顯著高于假孕組可能是瘦素直接或通過下丘腦垂體間接地促進(jìn)卵巢分泌胚胎著床需要的激素.

瘦素促進(jìn)人、小鼠、牛等動(dòng)物胚胎著床的功能與瘦素受體在子宮內(nèi)膜的表達(dá)密切相關(guān)，瘦素與子宮內(nèi)膜上的受體結(jié)合，刺激子宮內(nèi)膜發(fā)生變化為胚胎植入做好準(zhǔn)備[10-13]，也可能是瘦素先促進(jìn)卵巢雌激素、孕激素的分泌，然后雌激素、孕激素又作用于子宮促進(jìn)胚胎的著床.有學(xué)者發(fā)現(xiàn)瘦素及其受體的mRNA在妊娠期母犬的子宮和胎盤中有不同程度的表達(dá)，指出瘦素及其受體通過自分泌/旁分泌參與了犬胚胎著床的調(diào)控[24]，與之相似，本研究中犬胚胎著床期瘦素及其受體在真孕母犬子宮內(nèi)膜、子宮腺中表達(dá)陽性，且表達(dá)水平顯著高于假孕母犬，說明瘦素在犬胚胎著床期可能也是通過自/旁分泌作用與子宮內(nèi)膜上受體結(jié)合促進(jìn)子宮與胚胎的結(jié)合.妊娠早期在雌、孕激素共同作用下子宮內(nèi)膜增生，子宮腺分泌物增加為胚胎著床做好準(zhǔn)備，胚胎著床期瘦素及其受體在假孕母犬子宮內(nèi)膜腺中表達(dá)陰性說明假孕子宮內(nèi)沒有發(fā)生胚胎著床時(shí)子宮腺分泌功能增強(qiáng)等變化.Bartel等在母犬發(fā)情后期泡沫狀子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(FEECs)發(fā)現(xiàn)了瘦素及其瘦素受體的存在，認(rèn)為犬子宮內(nèi)的泡沫狀子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及表達(dá)的瘦素及其受體在早期妊娠中有潛在的作用[25].可見，瘦素及其受體通過作用于子宮對于母犬妊娠及胚胎著床具有一定的調(diào)節(jié)作用.

瘦素及其受體在人的輸卵管中均有表達(dá)[26]，但瘦素在真孕和假孕母犬輸卵管中沒有檢測到表達(dá)，而瘦素受體主要在輸卵管的黏膜皺襞上有表達(dá)，說明瘦素受體與犬輸卵管的相關(guān)功能密切相關(guān).本研究中瘦素及其受體在假孕母犬各組織中也有一定的表達(dá)，說明瘦素在假孕母犬體內(nèi)也發(fā)揮著特定的生理作用.在非妊娠母犬黃體形成期瘦素及其受體的mRNA在卵巢中的表達(dá)有顯著變化，表明瘦素對于非妊娠母犬黃體分泌孕酮及黃體退化有調(diào)控作用[27].可見，瘦素及其受體在母犬不同生理狀態(tài)下發(fā)揮不同的功能.

通過比較瘦素及其受體在胚胎著床期真孕與假孕母犬下丘腦-垂體-性腺軸各組織中的表達(dá)差異，課題組推測真孕母犬外周血中高濃度的瘦素水平可能來自于下丘腦-垂體-性腺軸各組織的表達(dá)，外周血中瘦素水平能否作為判別真假孕的檢測指標(biāo)，其定量閾值是多少將在未來繼續(xù)進(jìn)行研究.

4 結(jié)論

胚胎著床期瘦素及其受體在真孕和假孕母犬下丘腦-垂體-性腺軸大部分組織中存在顯著表達(dá)差異，表明瘦素及其受體對于犬的胚胎著床具有一定調(diào)節(jié)作用.本研究為瘦素在多種動(dòng)物體內(nèi)參與了下丘腦-垂體-性腺軸對于生殖的調(diào)控[28-30]提供了新證據(jù).