劉 賀 賀 陽 谷家棟 文連奎

(吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

酒精是一種嗜神經(jīng)類脂性中樞神經(jīng)抑制劑，能夠通過機體血腦屏障與腦組織卵磷脂結合產(chǎn)生神經(jīng)細胞毒性作用[1]。長期過量飲酒會使人依賴成癮導致慢性酒精中毒(Chronic alcoholism，CA)，增加機體氧化應激反應，造成大腦神經(jīng)元結構被破壞甚至凋亡，導致中樞膽堿能系統(tǒng)功能紊亂和神經(jīng)信號傳導異常，從而引發(fā)認知功能障礙[2-3]。據(jù)報道[4]，CA發(fā)病率逐年增長且發(fā)病人群趨于年輕化。目前主要采取強制戒酒和臨床藥物改善CA導致的認知障礙，但強制戒酒具有極強的個體差異性且臨床治療副作用大，因此尋求天然安全的功能因子改善CA導致的認知障礙具有重大意義[5]。花青素是天然類黃酮多酚類化合物，對阿爾茲海默癥以及東莨菪堿誘導認知障礙具有改善作用[6-8]，但對CA導致認知障礙的改善作用未見報道。山葡萄作為花青素良好來源，物質(zhì)資源豐富但利用率低[9]。

試驗擬以山葡萄花青素為試材，采用Morris水迷宮和跳臺試驗評價山葡萄花青素對CA小鼠認知功能的影響，探討山葡萄花青素對CA小鼠氧化應激反應及膽堿能系統(tǒng)的改善作用，旨在為山葡萄花青素保健食品以及臨床藥物深度開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

試驗用無特定病原體動物雄性ICR小鼠：許可證號SCXK(京)2019-0008，體重約25～30 g，飼養(yǎng)于吉林農(nóng)業(yè)大學小動物實驗中心(批號NO.1103221911001900)屏障環(huán)境中，北京華阜康生物科技有限公司；

山葡萄花青素：參照He等[10]的方法自制；

56%vol二鍋頭酒：食品級，北京紅星股份有限公司；

二氧化硅：分析純，北京化工廠；

4%多聚甲醛溶液、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、乙酰膽堿(ACh)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、蛋白定量測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要儀器設備

電子分析天平：CPA-125型，德國Sartorius公司；

離心機：KL04-A型，美國Agilent公司；

Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)：WMT-100型，成都泰盟科技有限公司；

跳臺儀：DTT-2型，上海欣曼科教有限公司；

酶標儀：HBS-1096B型，美國Molecular Devices公司；

電動玻璃勻漿機：DY89-Ⅱ型，寧波新芝生物科技有限公司；

超低溫保存箱：MDF-382E型，日本SANYO電器公司；

奧林巴斯生物顯微鏡：BX53型，北京瑞科中儀科技有限公司；

輪轉(zhuǎn)式切片機：RM2016型，德國徠卡公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組 將40只小鼠飼養(yǎng)在(23±2) ℃，相對濕度(55±10)%，明暗交替各12 h，自由攝食和進水的屏障環(huán)境中，適應7 d后隨機分為4組：空白組(CK，等體積生理鹽水)、模型組[NC，30%乙醇，10 mL/(kg·d)]、山葡萄花青素低劑量組[LD，25 mg/(kg·d)]和山葡萄花青素高劑量組[HD，50 mg/(kg·d)]。

1.2.2 模型建立 參照蔣曦等[11-12]的方法修改如下：造模共30 d并分為兩個階段：CK灌胃生理鹽水，其他組動物每天灌胃30%乙醇溶液，連續(xù)灌胃15 d；從第16天開始，灌胃乙醇溶液1 h后開始灌胃相應劑量的山葡萄花青素，連續(xù)灌胃15 d。第31天開始Morris水迷宮試驗(MWM)，第37天開始跳臺試驗。試驗期間每3 d記錄小鼠體重。

1.2.3 Morris水迷宮試驗 參照盧聰[13]的方法修改如下：水池內(nèi)置圓形透明安全平臺(直徑80 mm，高150 mm)。試驗開始時將水池水面分成4個象限，將安全平臺放置于第Ⅳ象限中央，向水池中加水至水面高出安全平臺1 cm，調(diào)整水溫為(25.0±0.5) ℃，加入300 g二氧化鈦，混勻成乳白色液體，隱藏透明安全平臺所在位置。小鼠給藥1 h后進行水迷宮試驗。

(1) 定位巡航階段(5 d)：除第Ⅳ象限外，小鼠從其他3個象限邊緣中點位置進入水池，每只小鼠每天訓練3次，每次訓練時間120 s。記錄逃避潛伏期(即小鼠從入水到找到安全平臺所需時間。若小鼠未找到安全平臺，則需將其引導至安全平臺并停留10 s，記錄其逃避潛伏期為120 s)、小鼠總游程。

(2) 空間探索階段(1 d)：試驗開始撤掉水中安全平臺，第Ⅱ象限為小鼠入池位置，入水時間固定120 s。記錄小鼠首次登臺時間、穿臺次數(shù)、第Ⅳ象限停留時間、第Ⅳ象限路程百分比及小鼠游泳軌跡。

1.2.4 跳臺試驗 參照王方[14]的方法修改如下：小鼠置于跳臺儀中自由探索30 s，將小鼠放在橡膠圓臺上，小鼠跳下圓臺給予電流刺激，重復2～3次，24 h后開始試驗。

(1) 獲得階段(1 d)：將小鼠置于橡膠圓臺上，電柵欄通電(24 V，3 s)。記錄300 s內(nèi)小鼠跳臺潛伏期(即第一次跳下平臺的時間，若300 s內(nèi)未跳下平臺，則記錄其潛伏期為300 s)和錯誤次數(shù)(即300 s內(nèi)跳下平臺次數(shù))。

(2) 鞏固階段(1 d)：將小鼠置于橡膠圓臺，電柵欄通電。記錄300 s內(nèi)小鼠潛伏期和錯誤次數(shù)。

1.2.5 生化指標測定 水迷宮和跳臺試驗結束，各組小鼠禁食不斷水12 h后進行眼球取血，靜止30 min，4 ℃、3 500 r/min 離心10 min，取上清液；取腦組織在冰上分離海馬體，并與冷生理鹽水按m海馬體∶m生理鹽水為1∶9混合勻漿，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上清液。測定血清和海馬體上清液T-SOD、MDA、CAT、GSH、GSH-Px、Ach及AChE含量。

電視畫面中的字幕發(fā)布了首相的指示：“你們中的許多人都安全地聚集在學校禮堂和社區(qū)中心里。我們要求你們待在原地，這樣你們能得到處理。假如你們待在家中，請待在原地；我們會找到你?！?/p>

1.2.6 海馬體組織病理學觀察 用生理鹽水將小鼠海馬體洗凈，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，用乙醇脫去組織中水分，用透明劑二甲苯替換出組織中的乙醇，再經(jīng)石蠟包埋、切片、染色、脫蠟、脫水、封片后，于顯微鏡下進行觀察。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗結果均以平均值±標準差表示，使用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素ANOVA分析比較組間差異，P<0.05為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 山葡萄花青素對小鼠Morris水迷宮試驗的影響

2.1.1 定位巡航階段 由表1可知，訓練5 d后，CK、NC、HD潛伏期分別縮短了48.50%，25.91%，41.38%，小鼠逃避潛伏期雖有所縮短，但與CK比較NC明顯延長，且從試驗第1天開始差異極顯著(P<0.01)，表明CA能夠顯著延長小鼠逃避潛伏期，造成空間學習及記憶保持能力損傷?；ㄇ嗨馗深A后，訓練第2天開始逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05或P<0.01)，這是由于山葡萄花青素增強了小鼠對于水中安全平臺所在位置的記憶能力，使小鼠在短時間內(nèi)找到并登陸安全平臺。

表1 山葡萄花青素對小鼠逃避潛伏期的影響?

由表2可知，各組小鼠經(jīng)過訓練后總游程均有所縮短，CK、NC、HD小鼠總游程分別縮短了35.82%，21.41%，28.53%。與CK相比NC在第1天總游程開始差異顯著(P<0.05或P<0.01)，NC小鼠在水迷宮中緩慢沿著邊緣循環(huán)式游動，基本無空間探索行為，CA造成小鼠機體運動能力和認知能力失調(diào)；與NC相比HD在第3～5天總游程極顯著縮短(P<0.01)，說明花青素可提高小鼠機體運動能力，期間產(chǎn)生平臺探索行為，提高認知能力。

表2 山葡萄花青素對小鼠總游程的影響?

2.1.2 空間探索階段 由表3可知，與CK相比，NC首次登臺時間極顯著延長(P<0.01)，穿臺次數(shù)、第Ⅳ象限停留時間和路程百分比均極顯著減少(P<0.01)，表明CA導致小鼠不能準確定位到安全平臺所在區(qū)域以及具體位置，產(chǎn)生空間記憶能力障礙。與NC相比花青素干預后首次登臺時間顯著縮短了27.00%(P<0.01)，穿臺次數(shù)顯著增加至(3.00±2.55)次(P<0.05)，第Ⅳ象限停留時間及路程百分比分別增加了21.13%和24.24%(P<0.01)，這是因為山葡萄花青素代謝產(chǎn)物進入到腦中增強了海馬體對外界刺激信號接受及傳導能力，增加了小鼠對安全平臺的位置記憶能力和位置探索行為，并提高了其空間記憶能力。

表3 山葡萄花青素對小鼠空間探索階段試驗指標的影響?

由圖1可知，CK小鼠游泳軌跡大多呈直線式且能夠產(chǎn)生安全平臺定位探索行為，在短暫搜索后即可定位并登陸平臺。NC和LD游泳軌跡呈邊緣循環(huán)軌跡，沒有明確目標。HD軌跡呈趨向式，有探索安全平臺位置行為，穿臺次數(shù)及平臺所在象限游泳軌跡增加。MWM試驗表明，CA能夠降低小鼠的空間記憶及學習能力，與王蓉等[5，15-16]的結果吻合。山葡萄花青素能夠提高CA導致的認知功能損傷，與原花青素[1]、大豆異黃酮[17]等類黃酮多酚物質(zhì)對于認知障礙改善作用相似。

圖1 山葡萄花青素對小鼠游泳軌跡的影響

2.2 山葡萄花青素對小鼠跳臺試驗的影響

由表4可知，與CK相比，NC跳臺潛伏期極顯著縮短(P<0.01)，跳臺錯誤次數(shù)極顯著增加(P<0.01)，表明CA對小鼠空間學習和被動回避記憶能力產(chǎn)生損傷作用。與NC相比，HD在獲得階段和鞏固階段的跳臺潛伏期分別延長了26.39%和26.61%(P<0.01)，錯誤次數(shù)分別減少至(3.38±0.92)，(2.63±0.74)次(P<0.05或P<0.01)，花青素干預后小鼠延長安全平臺停留時間，且跳下平臺受到強直刺激后能夠立即跳回平臺。由于海馬體CA1區(qū)對于強直刺激反應明顯，花青素能夠改善該區(qū)域神經(jīng)元受損，增強機體對于該種刺激記憶及反射進而跳回安全平臺。跳臺試驗表明CA會造成小鼠認知障礙且山葡萄花青素對此有顯著改善作用，與石哲[12]的結果不同，可能是干預物質(zhì)不同，在機體代謝中生成的產(chǎn)物不同導致其改善作用存在差異，其具體機制有待深入研究。

表4 山葡萄花青素對小鼠跳臺試驗的影響?

2.3 山葡萄花青素對小鼠抗氧化應激的影響

機體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中，SOD/GSH-Px/CAT共同發(fā)揮抵御氧化應激損傷作用[18]。由表5可知，與CK相比NC小鼠血清和海馬體中T-SOD、CAT、GSH、GSH-Px水平均極顯著降低(P<0.01)，MDA含量極顯著增加(P<0.01)，這是由于CA導致血液中酒精含量增加，酒精代謝產(chǎn)物乙醛可通過血腦屏障進入神經(jīng)元產(chǎn)生大量活性氧，抑制抗氧化酶活性并降低抗氧化蛋白含量，攻擊血腦中多不飽和脂肪酸引起脂質(zhì)過氧化形成過氧化脂質(zhì)，造成核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)損傷，與吳偉青[5]的結果一致。與NC相比HD小鼠血清和海馬體中T-SOD分別增加了8.62%和6.80%，CAT分別增加了25.34%和17.39%，GSH分別增加了28.14%和3.57%，GSH-Px分別增加了16.14%和25.85%，MDA分別降低了21.24%和27.70%，這是由于山葡萄花青素進入血腦屏障，發(fā)揮抗氧化應激作用，抑制質(zhì)脂過氧化，修復神經(jīng)細胞損傷，平衡細胞間神經(jīng)興奮傳導穩(wěn)態(tài)，進一步加強學習記憶能力，與榮爽[19]的結果相近。

試驗發(fā)現(xiàn)T-SOD差異不顯著但活性增加明顯，CAT和GSH分別在海馬體和血清中具有顯著性，可能是由于花青素在機體不同位置的代謝產(chǎn)物不同，具體原因仍需進一步研究。Cui等[20]研究發(fā)現(xiàn)，花青素抑制腦缺血模型小鼠腦組織中MDA的增加和SOD的減少，能夠激活核因子E2相關因子2(Nrf2)和HO-1蛋白表達，通過Nrf-2/HO-1途徑減輕氧化應激損傷保護神經(jīng)元；Ali等[21]研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茲海默癥模型中花青素能夠調(diào)節(jié)磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/糖原合成酶激酶3β(p-PI3K/Akt/GSK3β)途徑，進而刺激Nrf-2/HO-1內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，降低氧化應激損傷，改善認知功能障礙?；ㄇ嗨卣{(diào)節(jié)PI3K/Akt/GSK3β途徑激活內(nèi)源性抗氧化劑Nrf2/HO-1途徑，可能是其抗氧化應激的可能通路，可以此作為切入點探究關于花青素改善CA導致認知障礙的通路。

表5 山葡萄花青素對小鼠抗氧化應激指標的影響?

2.4 山葡萄花青素對小鼠膽堿能系統(tǒng)指標的影響

研究[5]表明，CA引起機體大腦相關中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，通過引發(fā)氧化應激反應紊亂中樞膽堿能系統(tǒng)平衡，引起神經(jīng)信息傳遞功能障礙，最終導致機體出現(xiàn)多種神經(jīng)行為改變。ACh是關于認知功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，在學習記憶中起重要作用，AChE作為膽堿能神經(jīng)元生理活性特異性標記物的蛋白質(zhì)酶，在神經(jīng)元乙酰膽堿的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。由圖2可知，與CK相比NC中AChE極顯著升高(P<0.01)，ACh含量極顯著降低(P<0.01)，AChE活性升高會過量分解ACh，引發(fā)中樞膽堿能系統(tǒng)失衡，無法作用于突觸后膜發(fā)揮信號傳導作用，導致興奮傳導及記憶存儲信號混亂，甚至導致神經(jīng)元細胞凋亡。與NC相比HD能顯著抑制AChE活性(P<0.05)，顯著增加ACh含量(P<0.05)，花青素干預后能夠有效改善海馬體中膽堿能系統(tǒng)損傷，增強ACh與突觸后膜特異性受體的結合，增強突觸可塑性及突觸后效應，使神經(jīng)元突觸間的信息傳遞效率增強，促進記憶形成。

與CK組比較，*為P<0.05，**為P<0.01；與NC組比較，#為P<0.05，##為P<0.01

2.5 山葡萄花青素對小鼠海馬體組織的影響

海馬體是機體中神經(jīng)元可塑性區(qū)域，在學習記憶認知功能過程中發(fā)揮重要作用。酒精造成學習記憶損傷的一個重要原因是其對海馬體神經(jīng)細胞的毒性作用[22]。由圖3可知，CK海馬體CA1區(qū)神經(jīng)細胞層次分明，細胞結構完整形態(tài)清晰可見。NC海馬體CA1區(qū)神經(jīng)細胞排列分散層次混亂，細胞數(shù)目減少，部分細胞變性、壞死溶解呈空泡且難以辨別。這與石哲等[12，23]的結果相似，表明CA會導致海馬體CA1區(qū)神經(jīng)細胞損傷。與NC組比較HD海馬體CA1區(qū)神經(jīng)細胞排列較整齊，結構相對正常，細胞數(shù)目增多，表明山葡萄花青素可以改善CA導致的小鼠海馬神經(jīng)元受損。

圖3 山葡萄花青素小鼠海馬體CA1區(qū)神經(jīng)元的影響

3 結論

試驗表明，慢性酒精中毒會導致小鼠認知功能障礙；酒精導致機體氧化應激水平增加，引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿能穩(wěn)態(tài)失衡，這是慢性酒精中毒導致認知障礙的可能機制之一。山葡萄花青素對此具有改善作用，可顯著提高慢性酒精中毒小鼠學習記憶能力，提高血腦中抗氧化應激水平，調(diào)節(jié)海馬體膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，恢復受損神經(jīng)元，改善認知障礙。后續(xù)將深入分析山葡萄花青素抗氧化應激作用相關靶點，并進行PI3K/Akt/GSK3β-Nrf2/HO-1途徑機制研究。