賀桂蓮 謝劉陽(yáng) 劉春華 侯帆 朱雯雯 賀宏偉 劉飛

〔摘要〕 目的 從抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管新生角度，探討益氣定眩飲改善大鼠腦缺血損傷的作用機(jī)制。方法 97只SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠，隨機(jī)選取20只為假手術(shù)組，其余大鼠采用大腦中動(dòng)脈線(xiàn)栓法制作腦缺血模型。選取造模成功的60只SD大鼠隨機(jī)分為模型組、丁苯酞組、益氣定眩飲組，每組20只，分別予以蒸餾水、丁苯酞膠囊及益氣定眩飲灌胃干預(yù)。Zea-Longa法檢測(cè)各組1、3、7、14 d時(shí)間點(diǎn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，HE染色觀察大鼠腦缺血海馬組織形態(tài)學(xué)變化，TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)凋亡細(xì)胞，免疫組化檢測(cè)缺血腦組織促紅細(xì)胞生成素（EPO）、促紅細(xì)胞生成素受體（EPOR）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、酪氨酸激酶B（TrkB）蛋白表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組細(xì)胞凋亡率增高，EPO、EPOR、VEGF、BDNF、TrkB蛋白表達(dá)增加（P<0.05）;與模型組相比，丁苯酞組、益氣定眩飲組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.05）;EPO、EPOR、VEGF、BDNF、TrkB蛋白表達(dá)增加（P<0.05）。結(jié)論 益氣定眩飲對(duì)大鼠腦缺血損傷后的神經(jīng)功能、局部神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)均具有改善作用，以14 d效果更顯著，推測(cè)其可能與上調(diào)EPO、EPOR、VEGF、BDNF、TrkB蛋白表達(dá)，促進(jìn)血管新生，改善腦組織供血供氧，從而保護(hù)神經(jīng)元形態(tài)與功能、促進(jìn)受損神經(jīng)功能修復(fù)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 益氣定眩飲;促紅細(xì)胞生成素;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;酪氨酸激酶B;細(xì)胞凋亡;腦缺血

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.08.009

Yiqi Dingxuan Yin Improved Cerebral Ischemia Injury in Rats by Inhibiting

Apoptosis and Promoting Angiogenesis

HE Guilian1， XIE Liuyang2， LIU Chunhua1*， HOU Fan1， ZHU Wenwen3， HE Hongwei1， LIU Fei1

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Gansu University of Political Science and Law， Lanzhou， Gansu 730070， China; 3. Affiliated Fuzhou First Hospital of Fujian Medical University， Fuzhou，

Fujian 350009， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the mechanism of Yiqi Dingxuan Yin in improving cerebral ischemia injury in rats from the perspective of inhibiting neuronal apoptosis and promoting angiogenesis. Methods 97 SPF healthy adult male SD rats， a total of 20 rats were randomly selected as the sham operation group. The other rats were cerebral ischemia model by middle cerebral artery line embolization. 60 SD rats successfully modeled were randomly divided into model group， butylphthalide group and Yiqi Dingxuan Yin group， with 20 rats in each group. Distilled water， butylphthalide capsule and Yiqi Dingxuan Yin were given for intragastric intervention. Zea-Longa method was used to detect the neurological function scores of rats with cerebral ischemia at 1， 3， 7 and 14 days in each group. HE staining was used to observe the morphological changes in the hippocampus of rats with cerebral ischemia. Nerve apoptosis cells were detected by TUNEL method. The expression levels of erythropoietin （EPO）， erythropoietin receptor （EPOR）， vascular endothelial growth factor （VEGF）， brain-derived neurotrophic factor （BDNF）， tyrosinine-stimulated B （TrkB） protein in ischemic brain tissue were detected by immunohistochemistry. Results Compared with sham operation group， cell apoptosis rate and protein expression of EPO， EPOR， VEGF， BDNF， TrkB in model group were increased （P<0.05）. Compared with model group， nerve function deficit score and cell apoptosis rate were significantly decreased （P<0.05）， the protein expression of EPO， EPOR， VEGF， BDNF， TrkB increased （P<0.05） in butylphthalide group and Yiqi Dingxuan Yin group. Conclusion Yiqi Dingxuan Yin can improve the neural function and the morphology of local neurons after cerebral ischemia injury in rats， and with more significant effect of 14 days. It is speculated that it may be related to the up-regulation of EPO， EPOR， VEGF， BDNF， TrkB protein expressionpromoting angiogenesis， improving cerebral blood flow and oxygen supply， thus protecting neurons form and function， promoting restoration of the damaged neural function.

〔Keywords〕 Yiqi Dingxuan Yin; erythropoietin; vascular endothelial growth factor; brain-derived neurotrophic factor; tyrosinine-stimulated B; cell apoptosis; cerebral ischemia

急性缺血性腦卒中（ischemic stroke， IS）是最常見(jiàn)的腦卒中類(lèi)型，占我國(guó)腦卒中的69.6%～70.8%，是嚴(yán)重威脅中老年人生命和健康的疾病之一，早期診治意義重大[1-2]。盡管醫(yī)療機(jī)構(gòu)開(kāi)辟綠色通道、建立多學(xué)科合作的腦卒中診治團(tuán)隊(duì)，由于急性缺血性腦卒中的治療時(shí)間窗窄、很多患者起病時(shí)間不明、特異性治療中靜脈溶栓的出血并發(fā)癥、動(dòng)脈溶栓與取栓受醫(yī)療和患者個(gè)體條件限制、他汀與神經(jīng)保護(hù)藥物的療效尚需進(jìn)一步證實(shí)等原因，仍需積極尋求多種解決方法和藥物[3]。益氣定眩飲是劉祖貽國(guó)醫(yī)大師辨治腦病理論指導(dǎo)下的臨證常用經(jīng)驗(yàn)方，前期臨床研究[4-5]顯示其防治后循環(huán)缺血性眩暈療效顯著，不僅能降低血黏度、提高椎-基底動(dòng)脈血流速度，亦可改善神經(jīng)功能缺損和眩暈癥狀，推測(cè)其療效機(jī)制為通過(guò)改善椎-基底動(dòng)脈供血不足和腦缺血缺氧，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)而改善神經(jīng)功能缺損癥狀，因前庭神經(jīng)功能恢復(fù)而緩解眩暈癥狀。促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin， EPO）及促紅細(xì)胞生成素受體（erythropoietin receptor， EPOR）是一種刺激人體造血器官、促進(jìn)紅細(xì)胞生成的蛋白，發(fā)揮血管新生的作用[6]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）又稱(chēng)血管通透因子，具有促進(jìn)血管新生的作用[7]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derivedneurotr?ophic factor， BDNF）是一種具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的蛋白質(zhì)，與酪氨酸激酶B（tymsinekinase B， TrkB）結(jié)合而在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)[8]。益氣定眩飲是否可通過(guò)上調(diào)EPO/EPOR、VEGF、BDNF/TrkB蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腦組織血管新生，改善腦組織缺血缺氧，從而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元形態(tài)與功能、促進(jìn)受損神經(jīng)功能修復(fù)的作用？本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用大腦中動(dòng)脈線(xiàn)栓法（middle cerebral artery occlusion， MCAO）建立大鼠腦缺血模型，觀察益氣定眩飲對(duì)腦缺血損傷的神經(jīng)功能、局部神經(jīng)元形態(tài)改善的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～280 g，97只，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：1107271911003822），購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004]，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[使用許可證編號(hào)：SYXK（湘）2019-0009]。室溫20～25 ℃，濕度50%～70%，自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，術(shù)前12 h禁食不禁水。

1.2? 主要藥物、試劑及儀器

益氣定眩飲（湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科）;丁苯酞軟膠囊（H20050299，石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）;2636A4型MCAO線(xiàn)栓（北京西濃科技有限公司）;TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（C1098，碧云天生物科技有限公司），EPO一抗（A5663）、VEGF一抗（A11127）、BDNF一抗（A10760）、TrkB一抗（A2099）均來(lái)自武漢Abclonal公司，EPOR 一抗（bs-1424r，北京博奧森生物技術(shù)有限公司），通用型二步法檢測(cè)試劑盒（pv-9000，北京中杉金橋生物科技有限公司）;CM3050S型冰凍切片機(jī)、SYD-B型石蠟包埋機(jī)（德國(guó)Leica公司）;CX23型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）;電子天平（北京六一儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 分組

造模前隨機(jī)取20只為假手術(shù)組，其余77只大鼠進(jìn)行造模。在本實(shí)驗(yàn)中，大鼠造模失敗共17只，總計(jì)模型制備成功率約77.9%。隨機(jī)選取造模成功的60只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、丁苯酞組和益氣定眩飲組，每組20只。

2.2? 模型制備及神經(jīng)功能評(píng)分

采用大腦中動(dòng)脈線(xiàn)栓法[9]制作腦缺血模型。假手術(shù)組大鼠予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，每100 g體質(zhì)量0.35 mL，大鼠麻醉成功后，仰臥位固定，頸部正中切口，分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、外動(dòng)脈后縫合切口。待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清醒后，進(jìn)行Zea-Longa神經(jīng)功能評(píng)分[10]，神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：（1）無(wú)神經(jīng)功能損傷癥狀，動(dòng)物正常活動(dòng)、進(jìn)食，評(píng)0分;（2）將動(dòng)物尾巴提起后，左前肢屈曲，評(píng)1分;（3）將動(dòng)物放置平板上，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，評(píng)2分;（4）將動(dòng)物放置平板上，用手輕推向左側(cè)傾倒，評(píng)3分;（5）動(dòng)物左側(cè)偏癱，不能自發(fā)行走，意識(shí)朦朧或喪失，評(píng)4分。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：評(píng)分大于或等于2分，則表明模型成功，低于2分則予以剔除。

2.3? 給藥干預(yù)

各組大鼠再隨機(jī)分為4個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只大鼠，分別給與相應(yīng)藥物干預(yù)1、3、7、14 d，每日灌胃1次，具體如下：

（1）益氣定眩飲組：黃芪30 g、赤芍10 g、川芎6 g、紅花10 g、地龍10 g、葛根45 g、制何首烏10 g、熟地黃15 g、制南星9 g、天麻10 g、絲瓜絡(luò)15 g、鬼箭羽30 g，常規(guī)煎煮濃縮，得生藥濃度為1.6g/mL，按動(dòng)物與人體表面積折算給藥劑量。

（2）丁苯酞組：將丁苯酞軟膠囊內(nèi)的藥物倒出，按動(dòng)物與人體表面積折算給藥劑量，加蒸餾水稀釋成10 mL/（kg·d），每日灌胃1次。

（3）假手術(shù)組及模型組用相應(yīng)劑量蒸餾水以10 mL/（kg·d），每日灌胃1次。

2.4? 標(biāo)本取材與制備

假手術(shù)組及其余組造模成功的大鼠分別于干預(yù)1、3、7、14 d后觀察神經(jīng)功能缺損評(píng)分。并在干預(yù)1、3、7、14 d時(shí)取各亞組5 只大鼠，予以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，打開(kāi)胸腔予以生理鹽水及4%多聚甲醛磷酸鹽進(jìn)行左心室灌注，斷頭取腦，用直鑷從大腦基底部剝?nèi)〈竽X，從視交叉處冠狀位切為兩半，除去嗅腦、小腦和腦干，剩余腦組織置于4%多聚甲醛固定12 h，再用蒸餾水沖洗浸泡24 h，取視交叉前后2 mm脫水、透明、包埋，分別做HE染色、細(xì)胞凋亡檢測(cè)和免疫組化檢測(cè)。

2.5? HE染色觀察腦組織形態(tài)

將包埋后的海馬區(qū)腦組織連續(xù)冠狀切片，脫蠟后行蘇木素染色、鹽酸乙醇分色、自來(lái)水浸泡返藍(lán)、伊紅染色、二甲苯透明。染色完成后中性樹(shù)膠封片，常溫晾干，在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織結(jié)構(gòu)、神經(jīng)元數(shù)量、細(xì)胞核形態(tài)、胞質(zhì)染色情況。

2.6? TUNEL法測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞凋亡

取包埋后的海馬區(qū)腦組織切片、脫蠟，蛋白酶K作用，3%過(guò)氧化氫溶液孵育，生物素標(biāo)記，滴加標(biāo)記反應(yīng)終止液，Streptavidin-HRP工作液，DAB顯色，蘇木素細(xì)胞核染色，二甲苯封片觀察。光鏡下凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，計(jì)算凋亡細(xì)胞所占的百分比。

2.7? 免疫組化法測(cè)定腦組織中EPO/EPOR、VEGF、BDNF/TrkB蛋白表達(dá)

取包埋后的海馬區(qū)腦組織切片，過(guò)氧化氫浸泡，濕盒中進(jìn)行一抗孵育，加二抗，PBS沖洗，DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色結(jié)果，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，將切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，采用Scan Scope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為棕黃色顆?；虬|(zhì)染成黃色。

2.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以“x±s”表示，先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)：符合正態(tài)分布者，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組組間比較采用單因素方差分析;不符合正態(tài)分布者采用非參數(shù)檢驗(yàn)。均以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分

假手術(shù)組大鼠Longa評(píng)分結(jié)果為0分，神經(jīng)功能表現(xiàn)正常;模型組、丁苯酞組及益氣定眩飲組的大鼠Longa評(píng)分在1～4分之間，與假手術(shù)組比較Longa評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，干預(yù)后1 d的Longa評(píng)分與丁苯酞組、益氣定眩飲組無(wú)顯著性差異（P>0.05），3、7、14 d的Longa評(píng)分較模型組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;丁苯酞組與益氣定眩飲組相同時(shí)間點(diǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;益氣定眩飲組與丁苯酞組3、7、14 d與1 d比較Longa評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;益氣定眩飲組14 d與3 d比較Longa評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

3.2? 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

假手術(shù)組大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常，排列整齊，核膜清晰，胞質(zhì)染色均勻;模型組缺血腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞減少，形態(tài)、結(jié)構(gòu)破壞，排列紊亂，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、變性、壞死、形成空洞，胞質(zhì)染色變淺;與模型組比較，丁苯酞組、益氣定眩飲組在3、7、14 d組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量增多，形態(tài)、結(jié)構(gòu)破壞較輕，排列稍紊亂，細(xì)胞膜破裂不明顯，細(xì)胞核少量固縮、變性。見(jiàn)圖1。3.3? 各組大鼠細(xì)胞凋亡情況

假手術(shù)組大鼠腦缺血組織未見(jiàn)凋亡細(xì)胞;模型組、丁苯酞組、益氣定眩飲組大鼠缺血側(cè)可見(jiàn)凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，模型組細(xì)胞凋亡率逐漸升高，到第7天達(dá)到高峰;與假手術(shù)組比較，模型組、丁苯酞組、益氣定眩飲組大鼠凋亡率明顯升高（P<0.01）;與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，丁苯酞組、益氣定眩飲組3、7、14 d大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.05），且隨著干預(yù)時(shí)間的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸下降，14 d組細(xì)胞凋亡率最低;與丁苯酞組同時(shí)間點(diǎn)比較，益氣定眩飲組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖2和表2。

3.4? 各組大鼠EPO、EPOR蛋白表達(dá)情況

與假手術(shù)組比較，在1、3、7、14 d，模型組和丁苯酞組、益氣定眩飲組海馬區(qū)的EPO、EPOR蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，在3、7、14 d，丁苯酞組和益氣定眩飲組中海馬區(qū)的EPO、EPOR蛋白表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而益氣定眩飲組與丁苯酞組同時(shí)間點(diǎn)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖3-5。

3.5? 各組大鼠VEGF蛋白表達(dá)情況

與假手術(shù)組比較，模型組和丁苯酞組、益氣定眩飲組在不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)的VEGF蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組比較，在3、7、14 d，丁苯酞組和益氣定眩飲組中海馬區(qū)的VEGF蛋白表達(dá)量升高（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而益氣定眩飲組與丁苯酞組同時(shí)間點(diǎn)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖6-7。

3.6? 各組大鼠BDNF/TrkB蛋白表達(dá)情況

與假手術(shù)組比較，模型組、丁苯酞組和益氣定眩飲組在不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)的BDNF、TrkB蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）;與模型組比較，在3、7、14 d，丁苯酞組和益氣定眩飲組中海馬區(qū)的BDNF、TrkB蛋白表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;但益氣定眩飲組和丁苯酞組同時(shí)間點(diǎn)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖8-10。

4 討論

急性缺血性腦卒中屬于中醫(yī)“中風(fēng)病”范疇，“氣虛血瘀”為最主要的病理機(jī)制，清代王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》中補(bǔ)陽(yáng)還五湯為治療代表方，具有益氣活血通絡(luò)之功效。隨著中醫(yī)學(xué)的發(fā)展，及對(duì)“中風(fēng)病”的不斷研究，逐漸認(rèn)識(shí)到該病具有病因復(fù)雜、病機(jī)多端、病勢(shì)變化迅速、等多種特點(diǎn)。常見(jiàn)的病因有風(fēng)痰阻絡(luò)、風(fēng)火上擾、陰虛風(fēng)動(dòng)、氣虛血瘀、肝腎虧虛[11]。益氣定眩飲是在補(bǔ)陽(yáng)還五湯的基礎(chǔ)上進(jìn)行加減，兼具益氣活血、補(bǔ)腎益髓、祛風(fēng)化痰3種功效。

腦缺血發(fā)生后產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以引起自由基的改變、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，這一系列的病理生理學(xué)變化，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[12-13]。血管新生是IS恢復(fù)過(guò)程中的重要因素，腦缺血后通過(guò)新生血管增加了腦缺血區(qū)血流的供應(yīng)，促進(jìn)了新生血管網(wǎng)的形成，為缺血缺氧腦組織提供能量，促進(jìn)神經(jīng)功能損傷的修復(fù)[14-15]。該過(guò)程釋放血管生成因子包括EPO、VEGF、BDNF等[16-17]。

EPO又稱(chēng)紅細(xì)胞刺激因子、促紅素，主要由腎臟和肝臟分泌，基本功能是促進(jìn)紅細(xì)胞生成。在正常人腦組織中EPO蛋白水平表達(dá)較低，但在缺氧狀態(tài)下會(huì)明顯增加，這表明EPO可能有自身保護(hù)性作用，對(duì)神經(jīng)損傷有修復(fù)作用。研究[18-21]顯示：EPO作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性的細(xì)胞因子，可通過(guò)神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的旁分泌作用，作用至神經(jīng)元EPOR，從而激活下游通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與缺血后的腦保護(hù);可以使MMP-9的表達(dá)減少，TGF-β1的表達(dá)增多起到神經(jīng)保護(hù)作用;也可通過(guò)激活A(yù)MPK，上調(diào)KLF2的表達(dá)，增加NO產(chǎn)生，進(jìn)而提高血管新生。

VEGF作為目前最強(qiáng)的血管通透因子，是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)血管新生的作用，對(duì)MCAO細(xì)胞恢復(fù)具有重要作用[22]。在發(fā)生了腦缺血損傷后，相比于損傷發(fā)生之前，腦組織內(nèi)VEGF的表達(dá)顯著提高[23]。VEGF與其受體結(jié)合后，一方面促使微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)新血管生成，改善局部血供，并保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞不發(fā)生程序性死亡;另一方面能促進(jìn)微血管新生來(lái)維系腦微環(huán)境穩(wěn)定和改善病理狀態(tài)下的微環(huán)境以保護(hù)神經(jīng)元，是脈絡(luò)滲灌氣血發(fā)揮對(duì)腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的生物學(xué)基礎(chǔ)之一[24]。

BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的主要成員之一，有促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)發(fā)生和血管生成的作用[25]。大鼠海馬區(qū)神經(jīng)保護(hù)因子對(duì)神經(jīng)元缺血損傷較為敏感，而B(niǎo)DNF可通過(guò)與TrkB相結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[26-27]。有研究[28]表明其原理主要通過(guò)拮抗細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載興奮氨基酸毒性，增強(qiáng)抗氧化酶的活性，減輕氧自由基的損傷，抑制細(xì)胞凋亡壞死和Caspase-3活性，調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的再生修復(fù)和功能恢復(fù)。丁苯酞是我國(guó)自主研發(fā)的藥物，具有促進(jìn)缺血性腦卒中后側(cè)枝血管的形成、改善腦組織能量代謝、清除自由基、抑制神經(jīng)元凋亡和焦亡、保護(hù)神經(jīng)元等多重作用[29]。

本研究中，腦缺血后大鼠海馬區(qū)EPO、EPOR、VEGF、BDNF、TrkB蛋白表達(dá)均有不同程度的增多，益氣定眩飲干預(yù)后其上調(diào)作用更明顯，并能改善神經(jīng)功能缺損、細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞凋亡程度降低，且隨著干預(yù)時(shí)間的增加，其效果更顯著，推測(cè)其可能通過(guò)上調(diào)內(nèi)源性EPO、EPOR、VEGF、BDNF、TrkB蛋白，從而促進(jìn)血管新生，改善腦缺血損傷，保護(hù)腦缺血海馬神經(jīng)元細(xì)胞。綜上所述，益氣定眩飲與丁苯酞均能促進(jìn)腦缺血損傷大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，保護(hù)缺血損傷神經(jīng)元細(xì)胞。課題組后期將進(jìn)一步從信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡方面明確益氣定眩飲保護(hù)腦缺血神經(jīng)功能的具體機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1] WANG W Z， JIANG B， SUN H X， et al. Prevalence， incidence， and mortality of stroke in China： Results from a Nationwide population-Based survey of 480687 adults[J]. Circulation， 2017， 135（8）： 759-771.

[2] WANG D R， LIU J F， LIU M， et al. Patterns of stroke between university hospitals and nonuniversity hospitals in mainland China： Prospective multicenter hospital-based registry study[J]. World Neurosurgery， 2017， 98： 258-265.

[3] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組.中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018[J].中華神經(jīng)科雜志， 2018，51（9）：666-682.

[4] 鄧浩慶，劉春華，馮? 娜，等.益氣定眩飲聯(lián)合鹽酸丁咯地爾注射液治療后循環(huán)缺血性單發(fā)性氣虛血瘀型眩暈30例[J].中醫(yī)研究，2014，27（12）：13-15.

[5] 劉春華，卜獻(xiàn)春，顏? 旭，等.益氣定眩飲治療老年后循環(huán)缺血性單發(fā)性眩暈的臨床研究[J].湖南中醫(yī)雜志，2014，30（11）：1-4.

[6] CARELLI S， GIALLONGO T， VIAGGI C， et al. Recovery from experimental parkinsonism by intrastriatal application of erythropoietin or EPO-releasing neural precursors[J]. Neuropharmacology， 2017（119）： 76-90.

[7] HUNTER S F， AGIUS M， MILLER D M， et al. Impact of a switch to fingolimod on depressive symptoms in patients with relapsing multiple sclerosis： An analysis from the EPOC （Evaluate patient outcomes） trial[J]. Journal of the Neurological Sciences， 2016（365）： 190-198.

[8] LASEK-BAL A， JEDRZEJOWSKA-SZYPUIKA H， RTYCKA J， et al. Low concentration of BDNF in the acute phase of ischemic stroke as a factor in poor prognosis in terms of functional status of patients[J]. Medical Science Monitor， 2015， 21：3900-3905.

[9] ENGEL O， KOLODZIEJ S， DIRNAGL U， et al. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model[J]. Journal of Visualized Experiments， 2011， 1（47）： 3791-2423.

[10] LONGA E Z， WEINSTEIN P R， CARLSON S， et al. Reversible

middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989， 20（1）： 84-91.

[11] 高長(zhǎng)玉，吳成翰，趙建國(guó)，等.中國(guó)腦梗死中西醫(yī)結(jié)合診治指南（2017）[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，38（2）：136-144.

[12] LI J， CAI Y. The dual effects of autophagy in myocardial hypert?

rophy[J]. Actacardiologica， 2015， 70（4）： 493-498.

[13] SANDERSON T， GALLAWAY M， KUMAR R. Unfolding the unfolded protein response： Unique insights into brain ischemia[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2015， 16（4）： 7133-7142.

[14] HATAKEYAMA M， NINOMIYA I， KANAZAWA M. Angiogenesis and neuronal remodeling after ischemic stroke[J]. Neural Regeneration Research， 2020， 15（1）： 16-19.

[15] HABIB P， STAMM A S， ZEYEN T， et al. EPO regulates

neuroprotective Transmembrane BAX Inhibitor-1 Motif-containing （TMBIM） family members GRINA and FAIM2 after cerebral ischemia-reperfusion injury[J]. Experimental Neurology， 2019， 320： 112978.

[16] 倪廣曉，王? 璞，段春巧，等.EPO通過(guò)AMPK-KLF2信號(hào)通路調(diào)節(jié)腦缺血后血管新生的分子機(jī)制研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，37（2）：218-223.

[17] 樊飛燕，張運(yùn)克.益氣活血中藥聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)缺血性腦卒中血管新生的作用與機(jī)制[J].中國(guó)組織工程研究，2021， 25（13）：2060-2069.

[18] WANG D， SONG Y， ZHANG J， et al. AMPK-KLF2 signaling pathway mediates the proangiogenic effect of erythropoietin in endothelial colony forming cells[J]. American Journal of Physiology Cell Physiology， 2017， 313（6）： C674-C685.

[19] CARELLI S， GIALLONGO T， VIAGGI C， et al. Recovery from experimental parkinsonism by intrastriatal application of erythropoietin or EPO-releasing neural precursors[J]. Neuropharmacology， 2017， 119： 76-90.

[20] 劉? 敏，王? 英，王敬東，等.促紅細(xì)胞生成素通過(guò)AMPK-KLF2信號(hào)通路調(diào)節(jié)腦缺血后血管新生的分子機(jī)制[J].貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，44（7）：804-809.

[21] 趙德福，張? 輝，楊文海.促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的抑制作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2019，39（17）：4330-4333.

[22] WANG X， VALLS A F， SCHERMANN G，? et al. YAP/TAZ orchestrate VEGF signaling during developmental angiogenesis[J]. Developmental Cell， 2017， 42（5）： 462-478.

[23] LEE H S， YOU J K， SHIM Y S， et al. Associations between serum vitamin D levels and precocious puberty in girls[J]. Annals of Pediatric Endocrinology & Metabolism， 2014， 19（2）： 91-95.

[24] DZIETKO M， DERUGIN N， WENDLAND M F， et al. Delayed VEGF treatment enhances angiogenesis and recovery after neonatal focal rodent stroke[J]. Translational Stroke Research， 2013， 4（2）： 189-200.

[25] 諸葛陸杰，方? 燕，金華倩，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯上調(diào)miR-199a-5p表達(dá)促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)發(fā)生和血管生成[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2020，49（6）：687-696.

[26] 師? 佳，戴? 丹，李洋洋，等.腦卒中后抑郁大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及酪氨酸激酶受體B蛋白的表達(dá)[J].中華老年心腦血管病雜志，2018，20（1）：83-87.

[27] 李? 敏，陶? 陶，張繼榮.豐富環(huán)境對(duì)腦缺血再灌注損傷后相關(guān)凋亡基因的研究進(jìn)展[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2018，33（10）：1238-1241.

[28] MANNELLI L C， PACINI A， MICHELI L， et al. Astragali radix： could it be an adjuvant for oxaliplatin-induced neuropathy？[J]. Scientific Reports， 2017， 7： 42021.

[29] 張? 瑋，馬靜萍.丁苯酞通過(guò)NLRP3炎性小體信號(hào)通路對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞焦亡的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2020，18（6）：898-902.