張偉

開封市兒童醫(yī)院，河南 開封 475000

馬齒莧，又名長壽菜，為常見的藥食同源的中藥，來源廣，應(yīng)用廣泛，內(nèi)服用于治療痢疾，有降糖、降脂等作用［1］，外用可以治療濕疹、扁平疣和尖銳濕疣等［2－3］。其性寒味酸，入大腸、肝、脾經(jīng)，有清熱解毒、消癰利尿之功效，適用于濕熱或熱毒所致的痢疾、癰腫和淋癥等［4］。有研究表明，其性寒滑利，清血分及大腸熱毒，為中醫(yī)臨床治痢疾的常用品，有“痢疾克星”之稱［5］?！侗静菥V目》記載“散血消腫，利腸滑胎，解毒通淋，治產(chǎn)后虛汗”。中藥因其成分復(fù)雜，靶點(diǎn)眾多，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥藥理作用的分子作用機(jī)制有重要意義。

本研究通過收集整理馬齒莧的主要成分和作用靶點(diǎn)，構(gòu)建成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析馬齒莧藥理作用的分子機(jī)制，為尋找馬齒莧潛在的藥理作用提供了依據(jù)。

1 方法

1.1 活性成分及靶標(biāo)蛋白的篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology data base and analysis platform，TCMSP）［6］（http：／／tcmspw.com／tcmsp.php）檢索“馬齒莧”?？诜锢枚龋╫ral availability，OB），即口服后藥物以原型形式進(jìn)入血液循環(huán)的相對量，是確定藥物生物活性，可作為藥物的關(guān)鍵指標(biāo)，篩選值≥30%。類似性（drug－likeness，DL）是基于相似性原理，總體相似的分子應(yīng)具有相似的生物活性；DL≥0.18，即“類藥物”化合物的選擇標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)活性成分在相關(guān)靶點(diǎn)中選出相應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白名稱。

1.2 靶蛋白的基因symbol確定及成分－靶基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過UNIPROT［7］數(shù)據(jù)庫（https：／／www.uniprot.org／）和GENECARDS［8］（https：／／www.genecards.org／）數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的gene symbol，采用Cytoscope3.6.0軟件構(gòu)建成分－靶基因網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 構(gòu)建蛋白相互作用（protein－protein interation，PPI）網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用STRING［9］（https：／／stringdb.org／）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建相關(guān)靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)度值篩選核心網(wǎng)絡(luò)作用圖。

1.4 靶蛋白的富集分析采用在線富集分析網(wǎng)站Metascape［10］（https：／／metascape.org／gp／index.html）對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集。

1.5 實(shí)驗(yàn)流程圖見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選結(jié)果從馬齒莧中共篩選出10種（占54種化合物的18.52%）具有良好的口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）的化合物。見表1。

表1 馬齒莧活性化合物篩選結(jié)果

2.2 化合物－靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)共篩選出靶點(diǎn)221個(gè)蛋白基因。化合物－靶蛋白基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖2 馬齡莧有效成分－靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI分析）及高連接子圖篩選將所有靶基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行PPI分析，PPI網(wǎng)絡(luò)圖共212個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 898條邊，網(wǎng)絡(luò)異構(gòu)度為0.808，聚集系數(shù)為0.585，PPI富集P＜0.001，蛋白相互作用包括共表達(dá)、共現(xiàn)、融合、調(diào)控和注釋途徑等相互作用［11］。度值前10位節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，見表2。蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值越大，表明該蛋白質(zhì)參與的相互作用越多，體現(xiàn)了該蛋白質(zhì)與周圍蛋白質(zhì)之間的直接聯(lián)系的能力更強(qiáng)，對于蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的影響力就越大，該蛋白質(zhì)是關(guān)鍵蛋白質(zhì)的可能性越大［12］。度值最高的AKT1是絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶之一，調(diào)節(jié)多種過程，包括代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長和血管生成［13－15］。ALB為血漿白蛋白，在調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓中起到重要作用，并充當(dāng)多種內(nèi)源性分子及外源性藥物的載體蛋白［16］。白細(xì)胞介素－6（interleukin－6，IL－6）參與炎癥反應(yīng)，在急性期參與B細(xì)胞活化［17］。TP53、TNF、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK8均參與腫瘤的生成和壞死［18－23］。見圖3。

表2 度值前10位蛋白的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

圖3 PPI作用網(wǎng)絡(luò)及核心網(wǎng)絡(luò)篩選圖

2.4 靶蛋白基因GO富集分析和KEGG富集分析GO富集分析和KEGG通絡(luò)富集均在Metascape（https：／／metascape.org／gp／index.html）上完成，GO富集分析包括生物過程（biological progress，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞成分（cellular component，CC）。選取顯著性前20位富集結(jié)果做氣泡圖，圖4為BP富集結(jié)果，圖5為MF富集結(jié)果，圖6為CC富集結(jié)果，圖7為KEGG通路富集結(jié)果。MF富集分析顯示了作用靶點(diǎn)多具有與配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、核受體激活、類固醇激素受體激活、銨離子結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體激活等分子功能，BP富集分析主要包括對有機(jī)環(huán)狀化合物反應(yīng)過程、對有毒物質(zhì)反應(yīng)過程、對無機(jī)物的反應(yīng)過程等；CC富集分析顯示這些靶點(diǎn)蛋白主要分布在突觸后膜、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域、細(xì)胞外基質(zhì)等；主要的通路包括癌癥通路、乙型肝炎通路、動(dòng)脈粥樣硬化通路等。說明馬齒莧作用范圍廣泛，通過多種途徑調(diào)節(jié)機(jī)體功能，包括腫瘤形成、乙型肝炎、動(dòng)脈粥樣硬化等。

圖4 BP富集分析氣泡圖

圖5 MF富集分析氣泡圖

圖6 CC富集分析氣泡圖

圖7 KEGG富集分析氣泡圖

顏色由綠到紅為－log10（fdr）范圍從小到大，－lg（fdr）越大說明顯著性越強(qiáng)，fdr為調(diào)整后P值，即q值），氣泡大小為富集的基因數(shù)目，縱坐標(biāo)為各個(gè)富集的名稱，橫坐標(biāo)為富集倍數(shù)。

3 討論

本研究通過對馬齒莧的有效成分進(jìn)行篩選，尋找靶點(diǎn)蛋白，轉(zhuǎn)換成靶點(diǎn)基因，靶基因相互作用和富集分析來研究馬齒莧藥理作用的分子機(jī)制。符合多靶點(diǎn)、多通路和多種分子機(jī)制共同作用的條件。有效成分的篩選僅僅從口服生物利用度和參數(shù)方面考慮，沒有考慮有效成分在馬齒莧中的含量濃度，可能會(huì)存在一定的誤差。

蛋白質(zhì)不能獨(dú)立執(zhí)行生物功能，而是通過相互作用以協(xié)作的方式完成生物功能，PPI在生命活動(dòng)中起到核心作用。PPI是互相作用的蛋白質(zhì)在物理上的接觸，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物或短暫接觸后又發(fā)生了分離［24］。通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)馬齒莧作用的主要蛋白AKT1參與炎癥、癌癥、糖尿病及心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展。研究表明，AKT信號通路在心肌肥厚和重塑中起著重要作用［25］。馬齒莧前10的作用靶點(diǎn)分子中除了AKT1，IL－6、TNF也是炎癥反應(yīng)中重要的細(xì)胞因子。IL－6是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中重要成員，在急性炎癥反應(yīng)中處于中心地位，可誘導(dǎo)產(chǎn)生C反應(yīng)蛋白和降鈣素原生成，與炎性疾病及感染程度直接相關(guān)［26］。研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧可以抑制IL－6表達(dá)，抑制潰瘍性結(jié)腸炎的癌變［27］。前10作用分子中其他靶點(diǎn)參與腫瘤發(fā)展、細(xì)胞分裂等。研究表明，馬齒莧中提取的多糖能提高小鼠的免疫功能，同時(shí)也可直接抑制腫瘤細(xì)胞分裂［28］。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，馬齒莧通過驅(qū)邪扶正作用起到抗病毒作用［29］。富集分析結(jié)果顯示了馬齒莧的靶蛋白多參與細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物過程。這些研究結(jié)果均與基因富集分析結(jié)果中靶基因蛋白所參與的多條癌癥通路及心血管疾病通路相對應(yīng)。有研究表明，馬齒莧提取液具有抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌等作用［30］，本研究重點(diǎn)關(guān)注于馬齒莧在人體中潛在存在的靶點(diǎn)蛋白的作用，其他生物的靶點(diǎn)蛋白不在考慮范圍內(nèi)。

本研究僅分析了馬齒莧的作用分子機(jī)制，沒有把相關(guān)疾病靶點(diǎn)映射到其作用靶點(diǎn)中，探討馬齒莧與某種疾病的關(guān)系。后續(xù)研究要注意把相關(guān)疾病與馬齒莧作用靶點(diǎn)相互映射，為中藥治療相關(guān)疾病的開發(fā)提供依據(jù)。